Presentación sobre técnicas de detección de ácidos nucleicos utilizadas en los bancos de Sangre: principios, ventajas y desventajas. Fue realizada en el contexto de la practica profesional de Tecnología Medica mención BHB en el Banco de Sangre del Hospital Clínico de la Universidad de Chile.

1. Tamizaje por NAT
en Banco de Sangre
Sergio Alegria G.
Interno Tecnología Medica mención BHB
25 de julio del 2017

2. Introducción

3. Desde la introducción de la prueba de
antígeno de superficie del HBV a
principios de los años 70, el riesgo de
infecciones transmitidas por transfusión
viral ha disminuido constantemente.
Para excluir individuos de riesgo de
transmisión, en la actualidad se incluye
un proceso de selección de donantes
que incluye la historia clínica del
donante candidato, un examen físico
breve y pruebas serológicas.

4. ¿Que son los NAT?
Nucleic acid test
• PCR
• El ADN ramificado: utiliza una
molécula que se enlaza con el
material genético específico.
• Reacción en cadena de la ligasa
• Amplificación mediada por
transcripción (TMA). Utiliza un
método molecular ligeramente
diferente de la PCR pero tiene
el mismo principio básico.
• La amplificación basada en
secuencias de ácidos nucleicos
(NASBA)

5. NAT combina las ventajas
de la detección directa,
especificidad con una
sensibilidad analítica
mayor que la detección
de antígenos, alto
rendimiento y la
disponibilidad creciente
de ensayos comerciales

6. Tamizaje de acidos nucleicos
virales en donadores de
sangre

7. 1999: Se estableció el primer NAT
para el VHC seguido por la prueba
dúplex del VIH-1 de forma
rutinaria y introducción de
pruebas de ADN del parvovirus
B19.

8. 2004: Las pruebas de ADN
del VHB comenzaron a ser
implementadas
globalmente, cuando se
hicieron disponibles
ensayos PCR comerciales
multiplexados que incluían
la detección simultánea de
ácidos nucleicos HBV, HCV
e HIV-1 y 2.

9. Las autoridades reguladoras en EEUU consideran seriamente un
enfoque de tamizaje por NAT similar con virus re-emergentes, incluidos
el VHA, HEV y HHV-8.

10. El desarrollo de las pruebas puede ser interno, diseñado en el propio
laboratorio, o por plataformas comerciales. En ambos casos los
resultados son similares (1)
Tipos de NAT usados:
• Alemania, Austria y Escocia  NAT internos (1)
• Brasil  NAT comerciales como internos (1)
• Cruz roja de Japón  NAT comercial (2)

11. Técnica de tamizaje y confirmación en usado por la Cruz Roja
en Alemania
3. Structure and focus of the German Red Cross Blood Transfusion Service BadenWürttemberg - Hessia and its affiliates [Internet].
Blutspende. 2010 [cited 19 June 2017]. Available from: https://www.blutspende.de/en/_files/structure.pdf

12. Prueba con Serología - y NAT + el año 2008
4. Roth W, Busch M, Schuller A, Ismay S, Cheng A, Seed C et al. International survey on NAT testing of blood donations: expanding implementation and
yield from 1999 to 2009. Vox Sanguinis [Internet]. 2011 [cited 25 July 2017];102(1):82-90. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1423-
0410.2011.01506.x/abstract;jsessionid=E3222B6B674BACB2FDE81E79EE6283F1.f03t01

13. Patógeno NAT ELISA
VIH ½ 11 16
VHB 34 21-59
VHC 23 52-192
HTLV ½ - 36-72
Sifilis - 21-42
Chagas - 35-45
Tiempo de ventana en dias
5. Vergara L. TAMIZAJE MICROBIOLOGICO EN DONANTES DE SANGRE [Internet]. Santiago de Chile: Centro de Sangre Metropoltano; 2010
[cited 24 July 2017]. Available from: http://www.smlc.cl/biblioteca/tmzj_mcrblgc_dnnts.pdf

14. Debilidades de los NAT

15. Costo
• La Cruz Roja Ecuatoriana evaluó el 2011, el costo de implementar
NAT en U$ 20 por donante, con pruebas realizada en minipooles de 6
donantes (6)
• Costo en Colombia estaría entre 12 a 15 dólares. Con un número de
aproximado de 800.000 donantes al año, el costo de la
implementación de estas pruebas seria de 12 millones de dólares al
año, para detectar, en periodo de ventana, 5 donantes para VHB y
probablemente ninguno para HIV o HCV (6)

16. Costo/beneficio
• Estudios realizados en EEUU (2004) y Países Bajos (2012) el
costo/beneficio de la adición de detección NAT, se mas costoso en
comparación a otras intervenciones de salud (6)
• Los costos de implementación de los análisis NAT en EEUU deberían
ser reducidos a niveles menores de US$1/donación para justificar su
implementación (6)
• Dadas las circunstancias geográficas de Chile, sólo bancos de sangre
de alto volumen de colecta estarían en capacidad de montar estas
pruebas con una relación costo/beneficio adecuada (6)

17. La implementación del NAT puede
verse limitada por el costo
considerable. La optimización costo-
efectividad instigó el desarrollo de
varias opciones destinadas a reducir el
costo de NAT, destacando:
• Pool de plasma de diversos tamaños,
pero con la desventaja de reducir la
sensibilidad.
• Ensayos multiplex capaces de
detectar simultáneamente, y
eventualmente identificar. Se reduce
los costes de los reactivos, el
volumen de la muestra y el tiempo
necesario para los resultados, pero al
mismo tiempo complica el desarrollo
de la técnica

18. El PCR anidado aumenta la
sensibilidad al realizar dos PCR
consecutivos sobre la misma región
Estrategias de mejora de sensibilidad en NAT pool
Aumentar la cantidad de
ácido nucleico en la reacción
de amplificación. Esto puede
hacerse aumentando el
volumen de plasma en el
procedimiento de extracción
de ácido nucleico
La ultracentrifugación,
cromatografía de
afinidad en columnas de
heparina o captura con
partículas magnéticas

19. Los niveles extremadamente bajos de ácido nucleico viral pueden no
ser la única causa de fracaso NAT. La diversidad genética viral puede
reducir o la hibridación de primer / sondas y, por tanto, afecta el
rendimiento de los métodos de detección molecular (1)

20. El surgimiento de variantes es particularmente esperado para retrovirus
(HIV-1/2, HTLV), flavivirus (VHC, VNO, Dengue) y hepnavirus (VHB) que
se caracterizan por una alta variabilidad genética, resultante de la
combinación de una alta tasa de mutación. Diferentes genotipos y
subtipos son frecuentes en diferentes áreas del mundo (1)

21. La optimización del rendimiento y la calibración estándar de los ensayos
serológicos y moleculares se basan en patrones prevalentes en América
del Norte y Europa Occidental. Un estudio comparativo dos NAT
comerciales demostró la existencia de diferencias significativas entre los
ensayos de NAT de HBV, HCV y VIH-1 de diferentes genotipos (1)
¿Esta validado
para nuestra
epidemiología?

22. Epidemiologia molecular

23. Es esencial monitorear la
evolución genética constante
de los virus en términos de
cambios en la distribución
del genotipo y la aparición
de variantes que escapan al
tamizaje mediante el uso de
técnicas epidemiológicas
moleculares.

24. Los datos generados
pueden ser importantes
para seleccionar ensayos de
selección o para ajustar los
primers / sondas utilizados
en los ensayos PCR in
house, así como la
especificidad de
anticuerpos y antígenos
utilizados en ensayos
serológicos.

25. Plataforma Procleix

26. Amplificación por mediación de transcripción
(TMA)
7. Hologic’s. Hologic’s Proprietary Real-Time TMA [Internet]. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hzAqbVgSbTw

27. Detección
• Por sondas similares a Molecular Beacons
7. Hologic’s. Hologic’s Proprietary Real-Time TMA [Internet]. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=hzAqbVgSbTw

28. Amplificación por mediación de transcripción
(TMA)
• Ventajas:
• Múltiples objetivos pueden amplificarse
• Un tiempo más rápido para obtener resultados
• Sin transferencias, sin pasos de lavado
• Amplificación exponencial de los objetivos de patógenos deseados
8. Transcription-Mediated Amplification (TMA) technology simplifies NAT and speeds workflow I PROCLEIX [Internet]. Procleix. 2017 [cited 23 July 2017].
Available from: http://www.procleix.com/en/web/procleix/tma-technology

29. Procleix Tigris System
• Máxima productividad para las demandas de alto volumen
de pruebas
• Primeros resultados en 3.5 horas, hasta 109 resultados cada
hora después de eso
• Instalar y entrenar en menos de una semana
9. Procleix Tigris system for NAT [Internet]. Procleix. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: http://www.procleix.com/en/web/procleix/procleix-tigris-system

30. Procleix Tigris System
10. Procleix Tigris system for NAT [Internet]. Procleix. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: http://www.procleix.com/en/web/procleix/procleix-tigris-system

31. Procleix Panther System
• Panther lanza los primeros resultados en 3,5 horas, luego 12
resultados por hora
• Operación simple
• Instalar, entrenar y probar en menos de una semana
11. Procleix Panther system for NAT [Internet]. Procleix. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: http://www.procleix.com/en/web/procleix/procleix-panther-system

32. 12. Procleix assays for NAT blood screening [Internet]. Procleix. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from: http://www.procleix.com/en/web/procleix/procleix-assays

33. Plataforma Cobas s 201

34. Pruebas disponibles
Plataforma Cobas s 201
13. cobas s 201 system | Roche Molecular Diagnostics [Internet]. Molecular.roche.com. 2017 [cited 23 July 2017].
Available from: https://molecular.roche.com/systems/cobas-s-201-system/

35. Sondas Taqman multiplexadas
14. [Internet]. [cited 23 July 2017]. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/PCR/qPCR/images/data/dat-multiplex-dyes.jpg

36. Conclusiones

37. La alta sensibilidad y
especificidad, el NAT
complementa de forma
eficaz las pruebas
serológicas en la
detección de infecciones
en período de ventana
pre-seroconversión, es
especial en VHC.
Es importante realizar
una adecuada evaluación
costo/beneficio antes de
su implementación.

38. La existencia de
donaciones seropositivas
pero NAT-negativas indica
que las pruebas
serológicas deben
mantenerse incluso con el
ensayo NAT más sensible
realizado en la donación
individual.
Aunque queda por evaluar
si el costo/beneficio de
mantener la serología.

39. La vigilancia epidemiológica
de la diversidad viral en
donantes de sangre es
esencial para evaluar la
prevalencia de la variante
viral.

40. Existe experiencia en el
desarrollo de técnicas
“in house”. Por otro
lado las técnicas
comerciales utilizadas
por las distintas
plataformas son usadas
hace años en
laboratorios de biología
molecular.

41. Durante el periodo enero-
mayo del 2017 el Banco
de Sangre del HCUCh tuvo
1308 donante, agregando
en consideración los datos
de serología – con NAT +
en Europa durante el
2008, para que el Banco
de Sangre del hospital
tenga 1 donante con esta
condición tendrían que
pasar:
• VIH: 110 años
• VHB: 96 años
• VHC: 140 años

42. Por otro lado, podría
evaluarse el uso de NAT
en VHC para acortar los
periodos de exclusión de
donantes, facilitando la
donación

43. Bibliografia

44. 1. Molecular virology in transfusion medicine laborator. Blood Transfusion [Internet]. 2013 [cited 19 June
2017];2:203-216. Available from: http://www.bloodtransfusion.it/articolo.aspx?idart=002470&idriv=82
2. Grifols suministrará su ultima tecnología NAT a la Cruz Roja Japonesa para analizar las donaciones de sangre de
Japón [Internet]. Grifols: eventos y noticias. 2014 [cited 24 July 2017]. Available from:
http://www.grifols.com/es/web/germany/search_news_and_events/-/new/japanese-red-cross-selects-grifols-as-
partner-for-nucleic-acid-screening-of-nations-blood-supply
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6. Ramirez Campos F. Generalidades sobre la implementación de la prueba NAT para Bancos de Sangre en
Colombia [Internet]. Bogota: Acobasmet; 2016 [cited 24 July 2017]. Available from:
http://www.acobasmet.com/assets/documento_final_-respuesta-a-minsalud-pruebas-nat_acobasmet_-
04mar2016.pdf

45. 7. Hologic’s. Hologic’s Proprietary Real-Time TMA [Internet]. 2017 [cited 23 July 2017]. Available from:
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dyes.jpg