Clase: Reparacion del DNA

1. DR. PABLO RAMÍREZ ROCA
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Facultad de Ciencias Biológicas
Curso de Genética Microbiana
Mutación y reparación del DNA
pramirezr@unmsm.edu.pe

2. 2
▪ Aleatoria vs dirigida: test de fluctuación
Mutación en el DNA
Luria, S. E., and Delbrück, M. 1943. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance.Genetics, 28:491-511.

3. 3
▪ Aleatoria vs dirigida: test de fluctuación
Mutación en el DNA

4. ▪ Demuestra que en bacterias, las mutaciones genéticas se
producen en ausencia de selección, en lugar de producirse
como respuesta a la selección.
▪ Por lo tanto, la teoría de la selección natural de Darwin que
actúa sobre mutaciones aleatorias puede también aplicarse
sobre las bacterias y otros organismos más complejos.
▪ Max Delbrück y Salvador Luria ganaron el Premio Nobel en
Fisiología o Medicina (1969) en parte por este trabajo.
El experimento de Luria y Delbrück (1943),
también llamado test de fluctuación

5. ▪ Tasas y frecuencias de mutación espontáneas
• Frecuencia por gen (gameto o replicación) (10-4-10-8)
• Por nucleótido (10-8 - 10-9)
Estimaciones recientes en humanos muestran que hay 75
nuevas mutaciones por genoma haploide y generación, que
equivale a una tasa de mutación de 2.3 × 10-8 por bp.
Frec. Mutación: 2/8
Tasa mutación: 1/7
(número de divisiones celulares = número células finales - 1)
Mutación en el DNA

6. Cambios en el nivel de un nucleótido (puntuales) del DNA:
▪ Inserción: + A-T TGGTCGTAT TGGTCAGTAT
ACCAGCATA ACCAGTCATA
▪ Deleción: - G-C TGGTCGTAT TGGTCATAT
ACCAGCATA ACCAGTATA
▪ Transición: A-T -> G-C; G-C-> A-T; C-G -> T-A; T-A -> C-G
▪ Transversión: AT->CG, … (8 posibilidades)
MUTACIÓN EN EL DNA

7. Consecuencias de la mutación puntual en la región
codificadora
Sin sentido
Cambio de sentido
Desplazamiento
de marco

8. DAÑOS DEL DNA
• Errores en la replicación del DNA
• Ataques expontáneos
⮚ Ataques hidrolíticos
⮚ Daño oxidativo
⮚ Metilaciones descontroladas
Estos ataques espontáneos producen despurinaciones y
desaminaciones
• Agentes químicos externos: CARCINÓGENOS
⮚ Son compuestos con grupos electrófilos que reaccionan con O y N
⮚ Modifican las bases nitrogenadas
⮚ Pro-carcinógenos: su metabolismo en el organismo mediante el citocromo
P450 los transforma en carcinógenos
• Agentes físicos: radiaciones
⮚ Luz UV: dímeros de timina (dímeros de pirimidinas)
⮚ Radiaciones g : rotura de la doble cadena del DNA

9. 9
Las mutaciones indel causan un desplazamiento del marco de lectura
Alineamiento incorrecto

10. Lesiones del DNA que requieren
reparación
Lesión del DNA Causa
Pérdida de una base Eliminación de purinas por ácidos y calor (en el genoma
humano, hidrólisis espontánea de 10,000 enlaces
glucosídicos/día )
Base alterada Radiaciones ionizantes, agentes alquilantes, especies
reactivas de oxígeno (ROS: O2
-., HO., H2O2)
Base incorrecta Desaminación espontánea (C pasa a U y A pasa a
hipoxantina), errores en la replicación no corregidos por
exo 3’-5’)
Deleción/Inserción Agentes intercalantes (naranja de acridina, proflavina)
Dímeros de pirimidina Radiación UV
Rotura de las cadenas Radiación ionizante, agentes químicos (bleomicina)

11. oxidación hidrólisis
metilación no controlada
El tamaño de las flechas indica la frecuencia
relativa de cada acontecimiento Fig 5-46 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Estas alteraciones conducen a la
despurinación o desaminación de la doble cadena de DNA
DAÑOS DEL DNA
▪ Alteraciones espontáneas que requieren reparación del DNA

12. Despurinación y Desaminación
Fig 5-47 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Sitio apurínico
Otras desaminaciones
(menos frecuentes)
A 🡺 Hipoxantina
G 🡺 Xantina
Sitio apurínico

13. Despurinización del DNA

14. Desaminación
de bases
Fig 5-52 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.

15. Mutaciones producidas por desaminación
Fig 5-49 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Cambio de
apareamiento
G=C por A=T;
transición

16. Mutaciones producidas por desaminación
▪ La desaminación de C y A origina TRANSICIONES, mutaciones
puntuales producidas por la sustitución de una purina (pirimidina) por otra.
G ↔ A ; C ↔ T
🡺 T =
A
🡺 G C
Transición
CG a TA
AT a GC

17. Azúcar despurinado
(A)
Fig 5-49 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
Mutaciones producidas por despurinación
Deleción de 1 par de
bases (Ej. AT)

18. La radiación UV produce dímeros de timina
Fig 5-48 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
▪ La luz UV une de forma
covalente dos residuos de
timina adyacentes en una hebra
cadena de DNA, formando
ciclobutano
▪ Con menos frecuencia se
pueden formar otros dímeros de
pirimidinas
T-T > T-C, C-T > C-C
▪ Los dímeros de timina
producen una distorsión local
del DNA

19. Oxidación de bases
▪ El metabolismo celular expone el DNA a los efectos perjudiciales de las
especies reactivas de oxígeno (ROS: O2
-., HO., H2O2), subproductos naturales
del metabolismo oxidativo.
▪ Se conocen más de 100 modificaciones oxidativas diferentes en el DNA
p. Ej.: G puede oxidarse a 8-oxoguanina
▪ oxoG puede aparearse con C o con A.
▪ Si oxoG se aparea con A se
produce una TRANSVERSIÓN.
▪ TRANSVERSIÓN: mutación
puntual producida por la
sustitución de una purina por una
pirimidina o al revés.
G ≡ C 🡺 T =A

20. Alquilación de bases
▪ Agentes alquilantes
Puede aparearse con C o T,
produciendo transversiones
▪ La alquilación de la posición N7 de un nucleótido de purina, hace que su
enlace glucosídico sea susceptible a la hidrólisis y lleve a la pérdida de la
base: despurinación

21. Sistemas de reparación del
DNA
• Escisión de la región dañada seguida de reemplazamiento
preciso
a. Escisión de base
b. Escisión de nucleótidos
• Reparación de errores de replicación
a. Desapareamientos (“mismatch repair”)
b. Translesión (“by-pass”)
• Reparación de roturas de doble cadena
a. Unión de extremos no-homólogos
b. Unión de extremos homólogos: recombinación
homóloga

22. Reparación por escisión
Etapas principales
• Reconocer la lesión
• Eliminar la lesión escindiendo parte de una de las
hebras
• Nueva síntesis para llenar el hueco
• Sellar la mella para reestablecer la continuidad del DNA
Reparación por escisión de base
• Una glucosilasa elimina la base, deja
la cadena intacta
• La AP endonucleasa corta la cadena,
la AP liasa elimina el azúcar
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA ligasa sella la mella
Reparación por escisión de
nucleótido
• Un corte doble elimina la lesión, se
elimina un oligonucleótido
(12-13 nucleótidos en E. coli,
27-29 en humanos)
• La DNA polimerasa rellena el hueco
• La DNA ligasa sella la mella
Apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease

23. Reparación por
escisión de base
Fig 5-50a .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
DNA glucosilasa: hidroliza el enlace β-glucosídico
que une la base dañada al azúcar.
Existen al menos 6 tipos de gluocosilasas
(reconocen desaminaciones de C y A; bases
oxidadas o alquiladas; bases con anillos alterados,
etc…)
Genera un sitio sin base: apurínico o
apirimidínico. Sitio AP
AP endonucleasa: rompe el enlace fosfodiéster
del sitio AP generado por la glucosilasa
Sistema de replicación: DNA polimerasa I y
DNA ligasa
“UNG”

24. Reparación por escisión de base
En humanos
• La desaminación de 5-metil-C (habituales en secuencias CG)
deja T en lugar de U, actúan glucosilasas que reconocen el par desapareado
T:G, eliminando preferentemente la T, sin embargo a veces elimina la G,
produciendo una mutación.
• La AP endonucleasa más importante es APE1
⮚ Corta la cadena por el lado 5’ del sitio AP
⮚ Recluta la DNA pol b
⮚ La DNA pol b, que tiene dos actividades enzimáticas,
elimina el fosfato-azúcar abásico, con su actividad AP liasa,
y rellena el hueco con su actividad polimerasa

25. Reparación por escisión
de base
El sistema de reparación por
escisión de base repara los
daños en el DNA producidos por
despurinación de bases, a partir
de AP endonucleasa
Despurinación de G
C
C
C
C
G
G
Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col. (modificada)
G

26. Reparación por escisión de
nucleótido
Es el sistema de reparación más genérico
y flexible
Este sistema de reparación actúa sobre una gran variedad
de lesiones
• Dímeros de pirimidina
• Modificaciones químicas con carcinógenos: benzopireno,
aflatoxina y con agentes quimioterápicos como cisplatino
• Bases desapareadas y pequeños lazos del DNA

27. Reparación por
escisión de
nucleótido
Detección del daño: mecanismo de “escaneo”
Actividad endonucleasa: ESCINUCLEASA
también llamada excinucleasa o escisión endonucleasa
DNA helicasa
Sistema de replicación: DNA polimerasa y
DNA ligasa
Fig 5-50 .- Biología Molecular de la Célula 4ª ed., Alberts y col.
De forma general este sistema implica:

28. Sistemas enzimáticos en E. coli: 4 componentes
Reparación por escisión de
nucleótido
Función Componente
Escaneo DNA UvrA
Nucleasa: EXONUCLEASA UvrB, UvrC
Helicasa UvrD
Sistema de replicación DNApol I/DNApol II; ligasa

29. Reparación por
escisión de nucleótido
(E. coli)
Fig 9-16 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.

30. Reparación por escisión de
nucleótido
Función E. coli Humanos
Escaneo DNA UvrA XPA, XPC; RPA
Nucleasa:
ESCINUCLEASA
UvrB, UvrC XPF, XPG
Helicasa UvrD XPB, XPD
Sistema de
replicación
DNApol I/DNApol II;
ligasa
DNApol δ/ε; ligasa
Comparación en E. coli y en humanos

31. Enzimas MMR en E. coli: 4 componentes
Función Componente
Escaneo DNA MutS
Reparación de errores
MutL
MutH (endonucleasa)
MutU (UvrD helicasa)
Sistema de replicación DNApol III; ligasa
Reparación de desapareamientos post-
replicativos o apareamiento incorrecto de
base o MisMatch Repair (MMR)

32. Reparación de desapareamientos post-
replicativos (MMR)
El sistema tiene que distinguir la base errónea en la cadena hija, sin afectar a
la cadena molde
La cadena hija permanece sin metilar en las secuencias GATC varios minutos
después de su síntesis
¿Cómo se reconoce la cadena dañada?
Sistema MMR
Fig 14-29 .- Genes VII., Lewis.

33. Reparación de
desapareamientos
(E. coli)
Fig 25-20 .- Lehninger 3ª ed
• Los apareamientos incorrectos son
reconocidos por un homodímero MutS, al que
se une MutL
• Los 2 monómeros MutS crean un bucle que
contiene el apareamiento incorrecto
• La endonucleasa MutH se une a sitios
hemimetilados, permanece inactiva hasta que
interacciona con el complejo MutL-MutS
• MutH corta la hebra hemimetilada, del lado
5’ ó 3’ del desapareamiento

34. 34
Reparación de desapareamientos
(E. coli) (cont.)
Fig 25-21 .- Lehninger 3ª ed (Modificada)
MutS, MutL
MutU (helicasa)
Hueco de ≈ 1000
nucleótidos

35. Función E. coli Humanos
Escaneo DNA MutS hMSH2-hMSH6
Reparación de
errores
MutL
MutH (endonucleasa)
MutU (UvrD helicasa)
hMLH1-PMS1, PMS2
MED1 (endonucleasa)
Sistema de
replicación
DNApol III; ligasa DNApol δ/ε; ligasa
▪ Comparación de los sistemas enzimáticos en E. coli y en humanos
Reparación de
desapareamientos

36. Reparación por síntesis de translesión
“translesion synthesis” (TLS)
Actúa un mecanismo de seguridad que permite que la maquinaria de
replicación se salte “by –pass” estos sitios de lesión
¿Qué ocurre si la DNA pol de replicación encuentra una lesión,
dímero de T o un sitio AP, que no ha sido reparada?
Síntesis de translesión
Este sistema es muy propenso a cometer errores, pero evita que un
cromosoma se replique de manera incompleta

37. Reparación por síntesis de translesión (TLS)
Polimerasas de translesión:
Familia Y de DNA polimerasas
• Sintetizan DNA a través del sitio
de la lesión
• Son dependientes de molde
• Incorporan nucleótidos de una
manera independiente de
apareamiento de bases, por eso
cometen errores con frecuencia
Fig 9-18 .- Biología Molecular del Gen 5ª ed., Watson y col.
E. Coli