El documento describe un experimento que examina los efectos mutagénicos de la hidroxilamina en Neurospora crassa. Se utilizaron 7 cepas mutantes de N. crassa y una cepa silvestre. Las cepas fueron tratadas con hidroxilamina y otros agentes mutagénicos como control. El objetivo era determinar si la hidroxilamina causa sustituciones de bases como se sabe en fagos, y comparar sus efectos con otros mutágenos. Los resultados podrían arrojar luz sobre los mecanismos de mutagé

1. 1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
QBP
GENÉTICA MICROBIANA
MUTAGÉNESIS

2. Definiciones
▶Marcador genético: Un marcador genético es un
segmento de ADN con una ubicación física conocida
en un cromosoma.
▶Genoma: Totalidad del material genético de una
entidad biológica.
▶Genotipo: Totalidad de información genética de una
entidad biológica que se expresa o no se expresa
▶Fenotipo: Totalidad de información genética que se
expresa a bajo una condición dada.
2

3. ▶Haploide: Información genética en una sola copia.
▶Diploide: constitución genético duplicado.
▶Merodiploide: marcadores en diploide y en haploide
▶Alelo: Presentaciones alternativas de un marcador.
▶Prototrofía: Aquel microorganismo que tiene la capacidad
de sintetizar o metabolizar todos los nutrientes que
necesita
▶Auxotrofía: Es aquel microorganismo que no puede
sintetizar o degradar algún metabolito.
3

4. 4
▶Mutación: Una mutación es cualquier cambio
hereditario en la secuencia de bases nitrogenadas del
DNA, afectando o no el fenotipo del organismo debe
ser heredable y no debe ser resultado de
recombinación.
▶Mutágeno: Agente físico, químico o biológico que altera
o cambia la información genética del DNA de un
organismo
▶Mutante:Que desciende de una célula, organismo o
individuo mutantes.
▶Revertante: Mutante en el que una mutación anterior
fue anulada por otra mutación.

5. Importancia
Variabilidad
fenotípica
Adaptación
Variación
genética
Nuevas
especies
Ventajas Especies más
complejas
5

6. ORIGEN
6

7. Mutaciones espontáneas
▶Son cambios en la secuencia nucleotídica de los genes y
no parecen tener causa conocida. Frecuencia de 10^7 a
10^10 (1 en 10 millones)
▶Errores por tautomerismo, daño oxidativo, desaminación
y despurinazación.
7
Mutaciones Inducidas
▶Mutación que se da por la influencia de cualquier factor
o agente mutagénico. Frecuencia de 10^4 a 10^7.
▶Agentes químicos, físicos y biológicos.

8. Tautomerismo
8
Figura 1. Comparación de las relaciones de emparejamiento de bases normales con
las disposiciones producidas como resultado de cambios tautoméricos. Las puntas
de flecha señalan los sitios de unión del azúcar pentosido.

9. Daños oxidativos:
▶El metabolismo aeróbico produce radicales superóxido
O2.
▶Estos radicales producen daños en el DNA y transforman
la G en 8-oxo-7,8-dihidro-desoxiguanina que se aparea
con la A.
9
Figura 2. 8-oxo-7,8-dihidro-desoxiguanina (8-oxo-G)
❖ Modificadores de base

10. Mutación espontánea.-
desaminación
Figura 3.- Desanimación de citosina y de adenina

11. desaminación espontánea de adenina.
Figura 14.- Mutación espontanea causada por la desaminación de adenina.

12. Espontánea.- DESPURINIZACIÓN.
Figura 4.- La perdida de un
residuo de purina (guanina) de
una sola cadena de DNA. La
estructura azúcar y fosfato
queda intacto.

13. Físicos
• Son radiaciones o
factores como el calor
que pueden alterar la
secuencia y estructura
del ADN.
• Radiaciones ionizantes:
X y γ. Emisiones α y β
• Radiaciones no
ionizantes: UV
Químicos
• Compuestos capaces
de inducir mutaciones
directamente
reaccionando con las
bases.
• Análogo de bases
• Modificadores de bases
• Intercalante
Biológicos
• Agentes propios o del
organismo que pueden
producir cambios
• Virus
• Transposones
13
ORIGEN INDUCIDO

14. Agentes mutagénicos físicos
❖ Rayos X y radiaciones ionizantes:
Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV,
producen radicales libres de hidroxilo hiperreactivos,
responsables de la abertura de un anillo de una base, o
fracturas monocatenarias o bicatenarias en el ADN.
❖ Rayos UV:
Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la misma hélice
la luz UV hace que se produzcan puente de hidrógeno
entre ambas. Los más frecuentes son los dímeros de
Timinas. 14

15. Lesión de bases por luz ultravioleta (UV)
Figura 5.- Representación de la formación de dímeros de timina causado por luz
UV. 15

16. ❖ Análogos de base
16

17. 5-Bromouracilo 2-Aminopurina
17
Figura 6. Posibles apareamientos del 5-
Bromouracilo.
Figura 7. Posibles apareamientos de la
2-aminopurina

18. Mecanismo del
mutágeno químico 5-
bromouracilo
Figura18.- El mecanismo de
mutagénesis de 5 BU.

19. Ácido Nitroso
Provoca una desaminación
oxidativa , en la que los
grupos amino se
convierten en grupos ceto
como consecuencia la
citosina se convierte en
uracilo, la adenina en
hipoxantina y la guanina
en xantina.
Figura 8. Sustitución del grupo amino por
el grupo carbonilo en una desaminación con
HNO2.
19

20. Figura 20.- Mecanismo de acción de Ácido Nitroso como agente mutágeno.

21. Figura 22.- Mecanismo de acción de Ácido Nitroso como agente mutágeno.

22. 22
Hidroxilamina
Presenta daño oxidativo, debido a los oxidantes
reactivos
Figura 9. Hidroxilamina induce solo transiciones GC-AT

23. Figura 23.- Mecanismo de acción de Hidroxilamina como agente mutágeno.
Hidroxilamina

24. Figura 10. Cambio en el apareamiento de guanina provocado por la
alquilación. 24
Alquilantes.Etilmetanosulfonato (EMS)

25. Figura .-Mecanismo de acción de EMS como agente mutágeno sobre Guanina.
G

26. Figura 11.Esquema de la acción de
los agentes intercalantes
26
❖ Intercalantes

27. Agentes mutagénicos biológicos
❖ Transposones:
Los transposones son segmentos móviles de DNA.
contienen cortas repeticiones invertidas terminales que
son esenciales para el mecanismo de inserción y que se
utilizan para definir los límites del transposón.
27

28. TAMAÑO
28

29. Macrolesión
Alteraciones graves de la
secuencia de mas de dos
pares de bases en el DNA.
29
Microlesión
Alteración
producida en
una o dos pares
de bases del
DNA.
Sustituciones
Transversiones
Transiciones
Inserciones y
Deleciones
Alteran el marco de
lectura

30. Transición y transversión
Transiciones:
• Se sustituye
una base púrica
por otra púrica,
o bien una
pirimídica por
otra pirimídica.
Transversiones:
• Se sustituyen
dos bases de
distinto tipo.
Figura 12. Esquema de las posibles
transversiones y transiciones
30

31. Inserciones y deleciones
Figura 13. Esquema de las
mutaciones por inserciones o
deleciones
INSERCIONES
• Es la inserción de
nucleótidos en la
secuencia del gen
DELECIONES
• Es la pérdida de
nucleótidos.
Produce un
corrimiento en el
orden de lectura

32. Figura 14. Esquema de las consecuencias de una
deleción y de una inserción en la traducción.
32
Corrimiento del marco de lectura

33. EFECTO SOBRE
EL FENOTIPO
33

34. Mutación silenciosa
▶ Mutación de sustitución en la secuencia de bases de
ADN que da como resultado un nuevo codón que
codifica para el mismo aminoácido.
▶ No hay cambios en el producto se le llama silenciosa
Figura 15. Esquema de una mutación
silenciosa donde se sintetiza el mismo aa.
34

35. Figura 16. Cambio de una timina por
una citosina en una cadena de DNA,
produciendo una mutación en sentido
erróneo.(Tomada de Snyder &
Champness, 2007, p. 157)
35
Mutación sentido equivocado
▶Mutaciones que conducen al cambio de secuencias
de aminoácidos, generando una proteína diferente a
la original, parcial o totalmente, dependiendo del
sitio de la mutación.

36. Mutación sin sentido
▶ Mutación que conduce a la formación de un codón de
parada , causando la formación de productos de
proteínas incompletos.
Figura 17.Comparación entre un polipéptido completo y
uno truncado debido a una mutación sin sentido
36

37. ▶ Es una segunda mutación, se restaura total o parcialmente el
genotipo y/o fenotipo dañado por la primera mutación.
Verdadera: mutante que ha revertido a su genotipo anterior,
restauración del genotipo (ADN) silvestre.
No verdadera (por supresión): reversión del fenotipo mutante al
silvestre a causa de una mutación en otro lugar que suprima o compense
la deficiencia de la primera
• Supresión intragénica: se produce cuando la segunda mutación se da
dentro del mismo gen en que se dio la primer mutación.
• Supresión intergénica: las segunda mutación se da en un gen
diferente a donde se dio la primer mutación.
37
REVERSIÓN

38. La hidroxilamina como
agente mutagénico de
Neurospora crassa
H.V. Malling
Biology Division, Oah Ridge National Laboratory
38

39. Neurospora crassa
o Es un hongo perteneciente a la división Ascomycota.
o Es utilizado como organismo modelo por su haploidía, su ciclo
de vida rápido y sencillo, y por la facilidad con la que se
puede cultivar.
o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de la
mutación es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 son
morados y se detectan fácilmente.
Figura 29. Cultivo de
Neurospora crassa. 39

40. Introducción
▶La HA induce a la sustitución de pares de bases (GC-AT)
en fagos.
▶Se sabia que induce a daños cromosomales en células de
mamíferos, pero no se había identificado la alteración
genética a nivel molecular.
▶HIPOTESIS: Podrá ser tan especifica en eucariotes
como en fagos para provocar mutaciones por
sustitución de pares de bases.
40

41. Objetivos
❖ Determinar si el comportamiento mutagénico de HA es
similar en fagos y eucariotes.
❖ Determinar qué efecto mutagénico genera HA en
Neurospora crassa comparando con el efecto
mutagénico conocido de otros compuestos múgatenos.
41

42. Tipo de mutaciones causadas por
los distintos agentes Mutágenos.
Mutágeno Hidroxilamina
*Sustitución de
bases.
Ácido Nitroso
Sustitución de
bases.
EMS
Sustitución de
bases.
ICR-170
Inserción y/o
deleción.

43. Selección de cepas.
▶ Se usaron 7 cepas mutadas con un tratamiento de
ácido nitroso y una que mutó espontáneamente.
Figura. 27. Cepas utilizadas en el ensayo (Prefijo 2-17 inducidas por ácido
nitroso y prefijo 5-4-1, mutó espontáneamente).

44. 1.- Obtención de
conidios.
DESARROLLO EXPERIMENTAL

45. Preparación del cultivo
20ml de medio glicerol
completo con sulfato de
adenina (25mg/L)
Incubación por
1 día a 30 °C
Incubación por
6-9 días a 25° C
Agitación
con perlas
de vidrio
(4mm de
diámetro)
Filtrar en
malla de
platino
suspender en
solución salina
(0.9%)
2 lavados por
centrifugación
Resuspender en
solución salina
(0.9%)
45

46. Tratamiento
Suspensión
de conidios
en matraces
de
Erlenmeyer
agitador rotatorio
en baño de agua a
25 C
5 min antes
de detener el
tratamiento.
Después de los
tratamientos
NA, EMS o ICR-
170
Resuspender en una solución
salina (mínimo de Frie´s) ajustado
a pH 8 con NaOH. 46

47. Tratamiento con acido
nitroso (NA)
Conidios
Neurospora
crassa
Resuspender
Acetato de sodio
0.05M
Buffer a pH4.5
Preparado fresco de
solución de Nitrato
de sodio a 0.02M
3 volúmenes de
conidios
Concentración final
de NaNO2 fue de
0.005M
Tratamiento fue finalizado
como se describe anteriormente
40 min después.
47

48. Tratamiento con EMS
Conidios
Neurospora
crassa
Resuspender
Buffer de Fosfato a
0.067M a pH de 7.
Añadiendo suficiente
EMS hasta la
concentración final
0.1M
Tratamiento fue suspendido
300 minutos después
48

49. Tratamiento con ICR-170
Conidios
Neurospora
crassa
Resuspender
buffer de Fosfatos a
0.067 M pH de 7
Concentración final
de 10.58µM
1 volumen de Solución de ICR-
170 (250mg/L H2O) a 49
volúmenes de suspensión de
conidios
Procedimiento
realizado en luz Roja,
y las cajas incubadas
en oscuridad
Tratamiento fue finalizado
como se describe
anteriormente 130 min
después.
49

50. Tratamiento con Hidroxilamina
(HA)
Conidios
Neurospora
crassa
Resuspender
NaCl 3M Concentración final
de HA de 1M.
diluidos 5 veces en
la reacción de HA Tratamiento
fue finalizado
5 min
después.
Resuspender en
NaCl 3M
Los conidios fueron
resuspendidos en la
solución salina
mínima de Fries
ajustada a un pH de
8.
50

51. Medio de cultivo Westergaard
Conidios
sin tratar
Conidios
de NA
Conidios
de EMS
Conidios de
ICR-170
Conidios
de HA
Suplementado con Sorbosa, glucosa, fructosa, ácido casamínico, una solución de vitamina
como en el completado de glicerol y Sulfato de Adenina
Sustituir 25 mg/L por 0.2 mg/L de Sulfato de adenina
* Oscuridad
por 24 hrs.

52. Resultados
TABLA 1. PORCENTAJE DE SUPERVIVENCIA Y LAS FRECUENCIAS DE
REVERSIÓN DEL EQUIPO DE PRUEBA DESPUÉS DEL TRATAMIENTO CON
ICR-I70, NA, EMS Y HA
ao significa que la frecuencia de reversión no es significativamente diferente de la
frecuencia de mutación espontánea en el nivel de confianza del 5%.
Reversión por sustitución de pares de bases.
Reversión por deleción o inserción de pares de bases.

53. ▶ *Las cepas mutantes
requieren adenina53

54. Gráfica 1. Incremento del número de reversiones (M) después del tratamiento con HA
sobre el número de mutaciones espontáneas (Mo) contra el tiempo de tratamiento con
HA.
54

55. Gráfica 2. Porcentaje de sobrevivientes contra el tiempo de tratamiento con HA.
55

56. ▶ La frecuencia de reversión con Hidroxilamina no es proporcional al tiempo
en Neurospora, pero sí para fagos.
Gráfica 3. Cinética de las inducciones de reversiones por HA en la sustitución par
base de la cepa 2-17-155. Frecuencia de las reversiones por 108 sobrevivientes
contra el cuadrado del tiempo del tratamiento de HA.
● Heterocarionte
● Rápida penetración de
HA.
● Reacción con citosina
ocurre en dos pasos
56

57. Conclusiones:
▶ El efecto mutagénico que produce Hidroxilamina, es
similar en Fagos y Eucariotes
▶ El tipo de mutación que predomina en Neurospora crassa
al ser tratada con HA es sustitución de bases,
específicamente transición.
▶ HA parece no tener un efecto considerablemente letal
pues después de 8 horas de tratamiento la población no
presentó un valor menor al 42%
57

58. Inducción de mutantes en
Escherichia coli
Protocolo de laboratorio
58

59. objetivos
▶Conocer el manejo de algunas técnicas para
producir mutaciones
▶Analizar algunos parámetros que caracterizan
el proceso de mutación, como la frecuencia
de mutación y la relación dosis-respuesta.
▶Caracterizar el daño producido por la luz
ultravioleta y la hidroxilamina, mediante
pruebas de reversión.
59

60. Medios de cultivo
•MacConkey con lactosa
•Medio rico de Luria (L)
•Medio mínimo con lactosa (MML)
Cepa
Escherichia coli W 3350 F- , Lac + , Sm s , Su -

61. Protocolo para tratamiento
con hidroxilamina
Día 1 Día 2
61

62. Protocolo para tratamiento con
hidroxilamina
Día 2
62

63. Protocolo para tratamiento con
hidroxilamina
Día 2
Agar MacConkey
(dispersión con
varilla)
63

64. Protocolo para tratamiento
LUZ ULTRAVIOLETa
Día 1 Día 2
64

65. Protocolo para tratamiento con LUZ
ULTRAVIOLETA
Día 2
65

66. Protocolo para AMBOS TRATAMIENTOS
Día 3
66

67. Protocolo para AMBOS TRATAMIENTOS
Día 3
67

68. Protocolo para AMBOS TRATAMIENTOS
Día 4
68

69. Protocolo para AMBOS TRATAMIENTOS
b. Determinación del tipo de mutación
producido por la luz UV y la hidroxilamina.
69

70. BIBLIOGRAFÍA
70
• Cesar Benito, J. E. (s.f.). Genética conceptos esenciales .
México.Panamericana. pág 215-234
• Klug. (Conceptos de Genética ). Conceptos de Genética .
México: Panamericana. Pág 410-433
• Klug, William S. 2013. “Conceptos de genética.” Pearson
Educación. Décima edición. Madrid. pág. 415-428.
• Lehninger, A.L. (2007). Principios de bioquímica. 5ta edición.
Editorial Omega. Barcelona. pág. 1013-1014.
• Rafael Oliva(2004). Genética médica. 3ra edición. Editorial
publicacions 1. Barcelona. pág. 57-60