Siguiendo este protocolo, los jóvenes participan en la investigación para desarrollar una vacuna contra la malaria que, en combinación con las medidas actuales, podría contribuir de forma significativa a controlar mejor esta importante enfermedad causada por un parásito. Los estudiantes probarán distintas vacunas posibles utilizando una técnica llamada ELISA y decidirán cuál es la más eficaz. El protocolo del experimento es una oportunidad para que los centros de ciencias, los museos y los colegios simulen un experimento real realizado en un laboratorio real para investigar la vacuna de la malaria.

1. Investiga la vacuna
de la malaria
Taller de experimentación
PROTOCOLO

2. Introducción
La malaria es considerada la enfermedad más combinación de diferentes medidas que inclu-
importante del mundo debida a un parásito y es yen la utilización de mosquiteras impregnadas
responsable de la muerte de aproximadamen- de insecticida, de aerosoles insecticidas, de
te 800.000 personas cada año, especialmente tratamientos de prevención, la implantación de
niños menores de cinco años y mujeres emba- programas educativos e intervenciones ambien-
razadas. Según la Organización Mundial de la tales, entre otras cosas.
Salud (OMS), unos 3.000 millones de personas
corren el riesgo de contraer la infección, y en el La comunidad científica está trabajando in-
año 2010 se produjeron 225 millones de casos tensamente para desarrollar una vacuna que
de malaria en el mundo, de los cuales un 90% se cree que, en combinación con las medidas
tuvieron lugar en África. actuales, podría contribuir significativamente a
un mejor control de la malaria. Actualmente ya
Actualmente, la malaria es endémica en más de existe una vacuna que se encuentra en fase de
100 países localizados en el África Subsahariana estudio clínico y que será efectiva en un 50% de
y regiones del sur de Asia, de Latinoamérica y de los casos.
Oceanía. Los últimos informes indican que la mi-
tad de la población mundial vive en áreas donde
existe riesgo de contraer la enfermedad y donde,
además de las consecuencias sobre la salud de
la población, la malaria contribuye a debilitar
aún más la situación económica de la zona. En este taller investigarás con
diferentes candidatos a vacuna para decidir
Para erradicar la enfermedad, en las zonas con cuál es el más eficaz.
alto riesgo de transmisión se están llevando a
cabo varias intervenciones que suponen una
Países o zonas donde se produce la transmisión de malaria Países o zonas con riesgo limitado de transmisión de malaria
Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). Datos de 2009
2

3. ¿Cómo se transmite la malaria? ¿Por qué es necesaria una vacuna
contra la malaria?
La malaria es una enfermedad infecciosa que
se contagia mediante la picadura de un mosqui- Históricamente las vacunas han constituido
to del género Anopheles que transmite parási- uno de los medios más eficaces para prevenir
tos del género Plasmodium y que por lo tanto enfermedades y salvar vidas, especialmente
actúa como vector. Dentro del organismo huma- en el caso de las enfermedades infecciosas. La
no, los parásitos se multiplican en el hígado y a obtención de una vacuna parcialmente eficaz
continuación infectan los glóbulos rojos. Entre podría significar la posibilidad de salvar a cien-
los síntomas de la malaria destaca la fiebre, tos de miles de vidas.
el dolor de cabeza y los vómitos, que aparecen
entre 10 y 15 días después de la picadura del La obtención de una vacuna supondrá un gran
mosquito. paso adelante y se podrá añadir al arsenal ac-
tual de medidas utilizadas para la prevención de
la malaria, como las mosquiteras impregnadas
con insecticida y el tratamiento oportuno y ade-
cuado de los casos diagnosticados de malaria.
¿Cómo se está interviniendo para Como su eficacia a corto plazo será parcial, no
controlar la malaria? sustituirá estas medidas, sino que las comple-
Las intervenciones fundamentales para contro- mentará y, conjuntamente, constituirán una
lar la malaria se dividen en varios grupos: respuesta integral para la prevención de la
malaria.
1 Estrategias contra el
mosquito o vector, como la
fumigación de los espacios
cerrados con insecticidas.
2 Estrategias para evitar
el contacto vector-
huésped, como el uso de
mosquiteras impregnadas
con insecticida.
3 Estrategias contra el
parásito. Dentro de este
grupo de estrategias,
encontramos el tratamiento
con combinaciones de
fármacos basados en
una molécula llamada artemisinina, que es
rápido y eficaz. Una vacuna también sería una
estrategia de control contra el parásito que,
en combinación con otras estrategias, podría
contribuir significativamente a la erradicación
de la malaria.
3

4. ¿Qué hacemos en ISGLOBAL, el Instituto de Salud Global de Barcelona?
El Instituto de Salud Global de Barcelona 1. Estudio de las bases moleculares de la
(ISGlobal) es una organización sin ánimo de enfermedad, así como de las diferentes
lucro, cuyo objetivo es mejorar la salud y el respuestas inmunitarias.
desarrollo de las poblaciones más vulnerables
mediante la generación, la gestión, la transmi- 2. Desarrollo de nuevos fármacos y evaluación
sión y la aplicación de conocimientos. Su visión de su seguridad, eficacia y efectividad.
es un mundo donde todos podamos gozar de
una buena salud y, entre otras instituciones, 3. Evaluación de las características epidemio-
cuenta con el apoyo de la Obra Social "la Caixa". lógicas de la malaria en diferentes entornos y
de los aspectos socioculturales que la rodean.
Uno de los pilares esenciales de ISGlobal es la
investigación centrada en problemas de salud 4. Análisis de la efectividad de diferentes herra-
que afectan a las poblaciones más vulnerables mientas de prevención, así como de la rela-
y se desarrolla desde el Centro de Investigación ción coste-efectividad de las intervenciones.
en Salud Internacional de Barcelona (CRESIB).
La investigación sobre la malaria que se lleva a Dentro del ámbito (4), el CRESIB lleva a cabo
cabo desde el CRESIB se centra en: estudios clínicos de seguridad, de eficacia y de
efectividad de vacunas. Actualmente participa
en el desarrollo de la vacuna RTS,S contra la
malaria, que está resultando efectiva en más
del 50% de los niños infectados. En paralelo, los
investigadores del CRESIB están investigando
para identificar nuevos candidatos a vacuna.
4

5. Objetivos del taller 1
En este taller te invitamos a analizar diferen-
tes candidatos a vacuna contra la malaria con
los que el CRESIB está investigando, para que
identifiques cuál es el mejor candidato. Los
candidatos a vacuna del CRESIB han sido obte-
nidos de proteínas del parásito que previamente
se han purificado.
Para analizarlos dispondrás de varias muestras
de sangre de personas residentes en zonas
afectadas por malaria que ya han sufrido la
enfermedad en varias ocasiones y que ya están
inmunizadas.
Para confirmar que nuestros candidatos a vacu-
na son efectivos, tenemos que comprobar que
las personas inmunizadas han desarrollado una
respuesta contra esos candidatos. Si en las per-
sonas se observa una activación de la respuesta 2
inmunitaria contra las proteínas candidatas,
significará que podrían ser buenos candidatos a
vacuna porque también podrían desencadenar
la respuesta necesaria para protegerse contra
futuras infecciones.
3
5

6. El objetivo de este taller es que te familiarices candidatos indicará que ha sido capaz de acti-
con una de las técnicas más utilizadas en los var una buena respuesta inmunitaria y que, por
laboratorios de biomedicina, la técnica ELISA lo tanto, se podría tratar de un buen candidato.
(“Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”).
Gracias a esta técnica descubriremos concreta-
Se trata de un análisis para detectar si en mente cuál de los antígenos de los que dispo-
las muestras de sangre hay anticuerpos. La nemos en el laboratorio es un buen candidato a
presencia de anticuerpos específicos contra los vacuna contra la malaria.
Principios básicos de la técnica ELISA
El principio básico de esta técnica se basa en la Para llevar a cabo la identificación, se utilizan
interacción del candidato a vacuna, o antígeno unos anticuerpos que tienen asociada una molé-
(1), con el anticuerpo (2). Un anticuerpo especí- cula llamada enzima (3), que tiene la capacidad
fico se unirá a un antígeno específico para dar de reaccionar con una sustancia llamada sustra-
un complejo antígeno-anticuerpo exclusivo. to (4) que le añadiremos, y producir un color.
La técnica ELISA nos permite identificar si Así pues, si la muestra tenía el anticuerpo que
había anticuerpos, y por lo tanto, si se han queríamos detectar, éste se unirá al que aña-
formado los complejos antígeno-anticuerpo al diremos unido a una enzima, que a la vez hará
poner en contacto las muestras de sangre con que el sustrato cambie de color y de este modo
los candidatos a vacuna. nos indicará el resultado positivo.
Sustrato
Enzima
Anticuerpo
Antígeno
1. Antígeno: cualquier material extraño que se une de forma específica a los anticuerpos o linfocitos específicos para activar
una respuesta inmunitaria. En general, los antígenos tienen un peso molecular elevado y normalmente son proteínas o
polisacáridos.
2. Anticuerpo: proteínas (inmunoglobulinas o Ig) del suero que se forman como respuesta a la invasión de moléculas
extrañas en el organismo, bien por exposición natural a un antígeno o por inmunización mediante vacunas. Tienen
forma de Y y están formados por cuatro cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro
intercatenarios. Los anticuerpos tienen una región constante y una región variable.
3. Enzima: proteína que facilita reacciones específicas del metabolismo.
4. Sustrato: solución que contiene un compuesto sobre el cual actuará una enzima.
6

7. Organización del taller
Para analizar qué candidato a vacuna o antígeno laria tienen anticuerpos contra los mismos.
es el más efectivo, analizaremos si las muestras Para ello dividiremos el experimento en 3 eta-
de sangre de personas inmunizadas contra ma- pas principales.
1. UNIÓN DE LAS PROTEÍNAS CANDIDATAS (O ANTÍGENOS) A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS
El primer paso será fijar las proteínas candidatas objeto de estudio a un soporte sólido
2. FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO
Después añadiremos las muestras de sangre, concretamente el suero (que corresponde a las
muestras de sangre una vez extraídas las células y los factores de coagulación), y un anticuerpo
marcado con una enzima que denominaremos anticuerpo secundario. En las muestras de sangre
donde esté presente el anticuerpo de estudio se formarán complejos antígeno-anticuerpo, que a su
vez se unirán al anticuerpo marcado con la enzima.
Anticuerpo
Suero secundario
de los pacientes marcado con
enzima
3. LECTURA DE LA REACCIÓN
Por último, añadiremos el sustrato de la enzima, que cambiará de color en caso de que hubiera
complejos antígeno-anticuerpo. De este modo podremos saber si las muestras de sangre tenían el
anticuerpo de estudio y en qué cantidad.
Sustrato
de la enzima
Resultados y conclusiones
Con los resultados obtenidos podremos decidir inmunitaria más intensa y por lo tanto puede
qué candidato a vacuna activa una respuesta ser el mejor candidato.
7

8. Equipamiento y material
necesario
Instrumentos y utensilios de laboratorio
Agitador magnético (1) Núcleo magnético y Micropipeta
(para preparar PBS-Tween) "pesca-núcleos" de 20 a 200 µl (2)
Probeta Botella de cristal
Cronómetro Embudo
de 100 ml de 250 ml
Material fungible
Tiras de 12 pocillos Pipetas Pasteur Puntas para micropipeta
de ELISA y soportes de plástico graduadas
Papel absorbente Rotulador permanente Guantes, gafas y bata
1. En caso de que no tengas agitadores magnéticos, puedes comprar el PBS líquido
2. En caso de que no tengas micropipetas, puedes utilizar pipetas Pasteur de poco volumen
8

9. Reactivos y muestras
Solución tampón PBS (3) Detergente Tween-20 (4) Agua destilada
Anticuerpo 2ario
A B C+ C-
Candidatos a vacuna Controles positivos Anticuerpo secundario
(antígenos) y negativos (5) con enzima
(peroxidasa)
Sustrato
1 2 3 4
Sustrato o solución de Muestras de suero de 4 personas residentes en zonas
revelado endémicas de la malaria que son inmunes a la enfermedad
3. Ayuda a mantener el pH de la solución gracias a fosfatos de sodio y de potasio.
4. Ayuda a prevenir uniones de anticuerpos inespecíficas
5. C+: contiene una mezcla de sueros de personas residentes en zonas endémicas de malaria
y que son inmunes a la enfermedad. C-: mezcla de sueros de personas que nunca han estado
expuestas a la malaria
9

10. Procedimientos
Para determinar la presencia o la ausencia de el suero) de diferentes pacientes que residen en
anticuerpos específicos contra los 2 antígenos zonas endémicas de malaria con estos antígenos,
candidatos a vacuna que tenemos en el labora- para ver si en estos sueros encontramos anti-
torio, confrontaremos la sangre (concretamente cuerpos específicos contra nuestros antígenos.
1 Unión de los antígenos a la superficie de los pocillos
Las tiras de micropocillos se recubren con los La unión de estos antígenos a la superficie de
candidatos a vacuna (antígenos) que queremos los pocillos se produce con facilidad por estar
probar para ver si serían buenos candidatos a hechos con un plástico tratado que tiene una
una vacuna contra la malaria. gran afinidad para unir proteínas.
PROTOCOLO PARA LA UNIÓN DE LOS ANTÍGENOS A LA SUPERFICIE DE LOS POCILLOS
1
A continuación anota qué pondrás en cada pocillo (controles, muestras de sangre
y nombre de los antígenos que analizarás).
2
Rotula los pocillos marcando
donde pondrás cada muestra.
10

11. 3
Prepara una solución de lavado (PBS-Tween 0,05%).
A B
Mide 200 ml de agua destilada utilizando la
probeta y enrasando con la pipeta Pasteur. Deposita el núcleo magnético dentro de
Añade los 200 ml de agua destilada a la la botella y diluye con el agua 1 pastilla
botella utilizando el embudo. de PBS utilizando el agitador magnético.
C D
Cuando la píldora se haya disuelto, extrae el
núcleo magnético y añade 100 µl de Tween-20 Remuévelo bien invirtiendo la botella
con una pipeta Pasteur de plástico. varias veces.
Nota: La solución de lavado contiene PBS (phosphate buffer saline), que permite que los anticuerpos se mantengan en un
ambiente estable que ayuda a conservar su estructura. El Tween-20 es un detergente que ayudará a eliminar las proteínas
que se hayan podido unir de forma no específica y se une a las partes del pocillo que no están cubiertas por antígeno.
De este modo se reduce el ruido de fondo.
11

12. 4 5
Añade los dos
antígenos problema
a los pocillos
correspondientes
utilizando la
micropipeta
(50 µl por pocillo).
Es importante que
uses una punta
limpia para dispensar
los antígenos,
así se evitarán
contaminaciones.
Deja incubar durante 5 minutos a
temperatura ambiente.
6 7
Lávalo para eliminar el exceso de antígeno
Elimina los restos de antígeno mediante no unido a la tira. Para ello, llena los
inversión de la tira sobre un papel absorbente. pocillos con la solución de lavado mediante
una pipeta Pasteur de plástico.
8 9
Descarta la solución de lavado mediante
inversión de la tira sobre un papel absorbente. Repite los pasos 7 y 8 una vez más.
12

13. 2 Formación de complejos antígeno-anticuerpo
En este paso, primero acondicionaremos el con una enzima llamada peroxidasa. Como a
suero de los pacientes para analizar si contie- cada anticuerpo primario se le puede unir más
nen anticuerpos contra el candidato a vacuna. de un anticuerpo secundario, la cantidad de
A estos anticuerpos que queremos analizar los color que se obtendrá en el paso tres será am-
llamaremos anticuerpos primarios. Después plificada. De este modo la técnica tendrá más
añadiremos un anticuerpo secundario marcado sensibilidad.
Anticuerpo
Suero de los secundario
pacientes marcado con
enzima
PROTOCOLO DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS ANTÍGENO-ANTICUERPO
1 2
Añade los controles positivos y negativos Añade las distintas muestras de
a los pocillos correspondientes utilizando sueros de 4 residentes en zonas
la micropipeta (50 µl por pocillo). endémicas de malaria a los pocillos
El control positivo (C+) contiene una correspondientes utilizando la
mezcla de sueros de personas residentes micropipeta (50 µl por pocillo).
en zonas endémicas de malaria y que
son inmunes a la enfermedad. El control
negativo (C-) contiene una mezcla de
sueros de personas que nunca han
estado expuestas a la malaria.
13

14. 3 4
Déjalo incubar durante 5 minutos a Elimina el exceso de muestra mediante
temperatura ambiente. inversión de la tira sobre un papel absorbente.
5 6
Lava todos los pocillos para eliminar
los anticuerpos que no han reaccionado
con los antígenos y que por lo tanto no
son específicos. Llena los pocillos con la Descarta la solución de lavado mediante
solución de lavado mediante una pipeta inversión de la tira sobre un papel absorbente.
Pasteur de plástico.
7 8
Con la micropipeta, añade el anticuerpo
secundario que está unido a una enzima
a todos los pocillos (50 µl por pocillo).
Repite los pasos 5 y 6 dos veces más.
14

15. 9 10
Elimina el exceso de anticuerpo
Deja incubar durante 5 minutos a secundario mediante inversión de la tira
temperatura ambiente. sobre un papel absorbente.
11 12
Lava los pocillos llenándolos con la Descarta la solución de lavado mediante
solución de lavado mediante una pipeta inversión de la tira sobre un papel absorbente.
Pasteur de plástico.
13
Repite los dos pasos anteriores 3 veces más.
15

16. 3 Lectura de la reacción
Después de lavarlo para eliminar todas las
moléculas marcadas no fijadas en forma de
complejos antígeno-anticuerpo, se añade el
sustrato enzimático en solución, que facilitará
el cambio de color.
Sustrato
de la enzima
PROTOCOLO DE LA LECTURA DE LA REACCIÓN
1 2
Añade el sustrato de la enzima a todos Déjalo incubar durante 5 minutos.
los pocillos con la micropipeta Durante este tiempo el sustrato se unirá
(50 µl por pocillo). a la enzima e irá apareciendo el color a
temperatura ambiente.
16

17. 3
Recoge los resultados en forma de gráfico de barras.
ANTÍGENO 1
máximo
Intensidad
mínimo Muestras
C+ C- M1 M2 M3 M4
ANTÍGENO 2
máximo
Intensidad
mínimo Muestras
C+ C- M1 M2 M3 M4
17

18. Resultados y conclusiones
Interpreta y apunta los resultados
1. ¿Qué antígeno de los que has probado crees que es el mejor candidato a vacuna?
¿Crees que los antígenos que has probado son un buen candidato a vacuna? ¿Por qué?
2. ¿Cuándo una reacción es positiva y cuándo es negativa? ¿Por qué?
3. ¿Por qué crees que se utilizan los controles?
18

19. 4. ¿Qué parte del anticuerpo primario es reconocida por el anticuerpo secundario: la región
constante o la variable? Razona la respuesta.
5. ¿Qué pasaría si no hiciéramos los lavados antes de poner el sustrato de revelado?
6. ¿Podríamos utilizar sangre de compañeros de tu clase para determinar si nuestros antígenos
de laboratorio son buenos candidatos para una vacuna contra la malaria? Razona la respuesta.
7. ¿Crees que con este experimento ha quedado demostrado que el candidato seleccionado
estimula la respuesta inmunitaria? ¿Tendría que hacerse algún otro tipo de experimento para
evaluar si también es capaz de activar algún otro tipo de respuesta?
19

20. Anexo I
USO OBLIGATORIO USO OBLIGATORIO USO OBLIGATORIO
DE GAFAS DE BATA DE GUANTES
Precauciones de seguridad
INFÓRMATE envases de reactivos a una llama. No calientes
Localiza los elementos de seguridad del labora- líquidos inflamables. Transporta las botellas
torio o el espacio habilitado para experimentar sujetándolas por la base, nunca por la boca.
(extintores, duchas o baño, salidas, etc.). Lee
atentamente las instrucciones antes de hacer ELIMINACIÓN DE RESIDUOS
un experimento. No olvides leer las etiquetas Deposita en contenedores especiales y debida-
de seguridad de reactivos y aparatos. mente señalizados el cristal roto, los reactivos
tóxicos, nocivos o perjudiciales para el medio
UTILIZA VESTIMENTA ADECUADA ambiente y los residuos biológicos. No tires
Guantes, bata y gafas de protección. nunca residuos sólidos por el fregadero.
NORMAS GENERALES En caso de accidente, avisa inmediatamente
Está prohibido fumar, comer o beber en el labo- al educador. Recuerda: Ante cualquier duda,
ratorio o en el espacio habilitado para experi- consulta al educador.
mentar.
Lávate las manos antes de salir del laborato- PRECAUCIONES ESPECÍFICAS
rio. Trabaja ordenadamente, pulcramente y sin PARA ESTE TALLER
prisas. Si se te cae algún producto, recógelo in- En esta práctica deberás seguir las precaucio-
mediatamente. Deja siempre el material limpio nes generales para la manipulación de produc-
y ordenado. No uses nunca un equipo o aparato tos químicos. A continuación se enumeran sólo
sin conocer perfectamente su funcionamiento. los que presentan los grados de peligrosidad
siguientes:
MANIPULACIÓN DE CRISTAL
Protégete las manos cuando manipules mate- • PBS:
rial de cristal. No uses cristal agrietado. tóxico por ingestión, inhalación y contacto con
la piel.
PRODUCTOS QUÍMICOS
No uses ningún frasco de reactivos sin etiqueta. • Tween 20:
No huelas, inhales, pruebes o toques los pro- tóxico por ingestión, inhalación y contacto con
ductos químicos. No pipetees nunca con la boca. la piel. Irritante.
Ponte guantes y lávate las manos a menudo si
usas productos tóxicos o corrosivos. No acerques
Anexo II
Referencias de los reactivos
NOMBRE REFERENCIA CASA COMERCIAL
PBS P4417-50TAB Sigma
Tween-20 P1379-100ML Sigma
CHK IGY, bagged (= ANTÍGENO) 1662406EDU BioRad
RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) 1662407EDU BioRad
GAR-HRP, bagged (= ANTICUERPO SECUNDARIO) 1662408EDU BioRad
SUSTRATO REVELADO 1662402EDU BioRad
20

21. Sigue investigando en Xplore Health!
Investigadores que han contribuido con contenidos: Laura Puyol, investigadora del CRESIB, ISGlobal.
DESARROLLADO POR
Esta obra ha sido incluida con una licencia Attribution-NonCommercial-
NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Para ver una copia de la
licencia, visita http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/