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Protocolo practicas de biología molecular

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Protocolo para prácticas de biología molécular en 2 de bachillerato

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Protocolo practicas de biología molecular

  1. 1. Protocolo Prácticas de Biología Molecular 1. Introducción: En esta práctica se pretende ilustrar la aplicación de los métodos utilizados en el análisis forense para la identificación biológica y la obtención de la huella genética. Para lograr esta identificación Podemos realizar el análisis por PCR de dos tipos de secuencias de DNA repetitivo existentes en el genoma humano: una secuencia Alu y un locus VNTR. Ambas son polimórficas, es decir, poseen más de un alelo por locus. En el primer caso, el amplificado de Alu es dimórfico, pues muestra la presencia o ausencia de la inserción de una secuencia Alu. La ventaja de este locus es que es relativamente fácil de amplificar y al tener sólo dos alelos, simplifica los análisis estadísticos poblacionales. La estructura corta y repetitiva de los VNTRs los hace más difíciles de amplificar y sus numerosos alelos complican los análisis estadísticos. Por otra parte, el elevado polimorfismo de estas secuencias asegura un alto número de diferentes genotipos en cada clase. Tales diferencias entre ambos loci ilustran las ventajas y desventajas de su utilización en diferentes aplicaciones. En principio usaremos uno de los dos LOCI. 1.1. Identificación de secuencias Alu (TPA-25) En este experimento, se utiliza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar una secuencia nucleotídica del cromosoma 8 y verificar la inserción (o no) dentro del gen del activador del plasminógeno tisular (TPA) de una copia de una secuencia Alu. Existen muchas regiones en el genoma humano que muestran variabilidad inter-individual. Tales regiones se denominan polimórficas y ofrecen las bases para la diagnosis de enfermedades de origen genético, la identificación forense y las pruebas de paternidad. La familia Alu pertenece al grupo de secuencias de DNA repetitivo definido como elementos cortos dispersos (SINEs) que se encuentran distribuidos por todo el genoma de primates y humanos. En los pasados 65 millones de años, estas secuencias se han amplificado mediante transposición vía un RNA intermediario, hasta 1.000.000 copias, lo que representa el 5 % del total del DNA genómico. Se cree que las secuencias Alu derivan del gen 7 SL RNA que codifica el componente de RNA de la partícula de reconocimiento de señal que interviene en la síntesis protéica. Los elementos Alu tiene un tamaño de unas 300 pb, y su nombre deriva de un lugar de reconocimiento para el enzima de restricción Alu I que se encuentra en la mitad de la secuencia. Se estima que entre 500 y 2000 secuencias Alu son exclusivas del genoma humano. Unas pocas de éstas se han insertado recientemente, en el último millón de años, y no están fijadas en la especie humana, de forma que puede encontrarse variación inter-individual. Uno de tales elementos Alu, TPA-25, se encuentra dentro de un intrón del gen del activador del plasminógeno tisular. Esta inserción es dimórfica, es decir, que está presente en unos individuos y no en otros. Por esto, la PCR puede utilizarse para verificar si tal secuencia se encuentra o no en un individuo particular. En este experimento, utilizamos unos cebadores complementarios a las regiones que flanquean el lugar de inserción de la secuencia TPA-25, para amplificar un fragmento de 400 pb., si se encuentra la secuencia TPA-25, o de 100 pb. si no está tal secuencia. Cada uno de los tres posibles genotipos (homocigotos para la presencia de TPA-25 que dan lugar a una banda de 400 pb.), heterocigotos (dos bandas de 400 y 100 pb.) u homocigotos para la ausencia de TPA-25 (una sola banda de 100 pb.), pueden ser identificados mediante una electroforesis en un gel de agarosa.
  2. 2. 1.2.- Identificación de los alelos de un locus VNTR (D1S80): Los análisis basados en el perfil de DNA se centran fundamentalmente en las regiones hipervariables del genoma. A este grupo pertenecen las Repeticiones en Tandem de Número Variable (VNTRs). Un locus de DNA perteneciente a estas regiones es el denominado D1S80 (Kasai et al., 1991). Se localiza en el cromosoma 1 y está compuesto por repeticiones de 16 nucleótidos. El número de repeticiones varía de un individuo a otro, y habitualmente oscilan en el rango entre 15 y 41 (Budowle et al., 1995). Esta variabilidad en el número de repeticiones, es decir, de alelos, hace a este locus muy útil para el análisis de los perfiles de DNA. La fuente de DNA molde es una muestra de varios miles de células obtenidas de la mucosa bucal de forma no agresiva. Las células se recogen mediante centrifugación y se resuspenden. Las células se lisan y se centrifugan para eliminar los restos. Una muestra del sobrenadante conteniendo el DNA genómico se mezcla con la Taq polimerasa, los cebadores, los 4 deoxinucleótidos, y el cofactor cloruro de magnesio. A continuación se realizan los ciclos de desnaturalización, complementación y elongación de la hebra de DNA. 2. Objetivo: A fin de comparar los genotipos de diferentes individuos, se cargan en un mismo gel el resultado de amplificaciones con distintas muestras de DNA. Después de la electroforesis se puede determinar si un individuo es homocigoto o heterocigoto según aparezcan una o dos bandas en el gel, y el tamaño de éstas. 3. Materiales a usar: Primers: Los primers para la secuencia D1S80 son: D1S80-5’: 5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3' D1S80-3’: 5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTG-3' Los primers para la secuencia Alu son: Alu-5’: 5’-GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT-3’ Alu-3’: 5’-CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT-3’ Reactivos: • 0.9% sodio cloruro • Isopropanol • Etanol • Agua destilada • Tampón de carga • Agarosa • Tampón de extracción: (200 mM Tris-ClH pH 8, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) • Tampón TBE • 1 microgramo/ml GelRed (sustitutivo del Bromuro de Etidio) • Kit de amplificación por PCR: Nucleótidos, Taq Polimerasa, Buffer. Equipo y materiales • Micropipetas y puntas: 10-200 μl, 0.5-10 μl • Pipetas pasteur • Tubos Eppendorf de 1.5 ml, 0.2 ml PCR • Recipiente de deshechos, Baño de agua 65ºC.
  3. 3. • Termociclador (en nuestro caso tres baños de agua a distintas temperatura. • Microcentrifuga Practica 1: Extracción y purificación de DNA 1. Raspar el interior de la mejilla vigorosamente con un palillo 2. Colocar el palillo en un tubo eppendorf limpio y añadir 1 ml. de agua destilada. Agitar vigorosamente durante unos segundos. Retirar el palillo y centrifugar en microfuga durante 45 segundos. 3. No alterar el pellet. Si esto ocurre, centrifugar otra vez. 4. Eliminar todo el agua posible sin alterar el pellet. 5. Agitar en en tubo eppendorf en 200 µl de tampón de extracción. Añadir otros 400 µl de tampón de extracción y agitar el tubo vigorosamente. 6. Incubar a 65 °C durante 10 min. 7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min. 8. Transferir todo sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf con cuidado de no alterar el pellet. 9. Añadir un volumen igual de isopropanol frío por la pared del tubo (300 µl) y mezclar con cuidado. 10. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min. 11. Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el precipitado. 12. Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore el isopropanol. 13. Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo. 14. Añadir unos 500 µl de etanol al 70% (hasta unos 2/3 del tubo), agitar vigorosamente hasta que se resuspenda el pellet y centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos. 15. Vaciar los tubos nada más salir de la centrífuga, con cuidado de no eliminar el precipitado. 16. Secar el precipitado durante varios minutos dejando el tubo abierto para que se evapore el etanol. 17. Observar el DNA como un precipitado blanco en el fondo del tubo. 18. Se pueden repetir los pasos los pasos del 14 al 17 para purificar el DNA. 19. Resuspender en 50 µl de agua destilada y estéril y guardar a -20ºC hasta su utilización.
  4. 4. Práctica 2: amplificación de fragmentos por PCR Se rotulan dos tubos de PCR (0,2 µl) para identificar tanto quien hace la reacción como el locus que se va a amplificar. Instrucciones del kit de DNA polimerasa de Promega: Component     Final  Volume     Final  Concentration   5X  Green  or  Colorless  GoTaq®  Flexi  Buffer1     10μl     1X   MgCl2  Solution,  25mM1     2–8μl     1.0–4.0mM   PCR  Nucleotide  Mix,  10mM  each     1μl     0.2mM  each  dNTP   upstream  primer     Xμl     0.1–1.0μM   downstream  primer     Yμl     0.1–1.0μM   GoTaq®  G2  Flexi  DNA  Polymerase  (5u/μl)     0.25μl     1.25u   template  DNA     Zμl     <0.5μg/50μl   Nuclease-­‐Free  Water  to     50μl     1Thaw  completely,  and  vortex  thoroughly  prior  to  use. Lo que vamos a hacer:     MIX         por  X   reacciones    Component     POR  REACCIÓN   15   Reacciones   5X  Green  or  Colorless  GoTaq®  Flexi  Buffer1     10   150   microlitros   MgCl2  Solution,  25mM1     2   30   microlitros   PCR  Nucleotide  Mix,  10mM  each     1   15   microlitros   upstream  primer  (100  microMolar)   0,5   7,5   microlitros   downstream  primer  (100  microMolar)   0,5   7,5   microlitros   GoTaq®  G2  Flexi  DNA  Polymerase  (5u/μl)     0,25   3,75   microlitros   template  DNA     4   60   microlitros   Nuclease-­‐Free  Water     31,75   476,25   microlitros   TOTAL   50   750   microlitros   Condiciones de la PCR: Condiciones de amplificación para D1S80: 94º 3 min. 94 º C 1 min., 65ºC 1 min., 72ºC 1 min., 25 ciclos 72º 10 min. Condiciones de amplificación para Alu: 94ºC 4 min. 94ºC 1 min., 60ºC 2 min., 72ºC 2 min., 25 ciclos 72ºC 10 min.
  5. 5. Práctica 3: Electroforesis en gel de agarosa y análisis de resultados Fabricar el Gel de agarosa al 2%: Para 100 ml de gel: • 2 gr de agarosa • 1 µl de GelRed • 100 ml de TBE Calentar el TBE con la agarosa hasta que hierva, dar unas vueltas continuamente para evitar que se queme. Verter sobre la cama, poner el peine y esperar a que se enfríe en la nevera. Se saca el gel y se coloca en la cubeta de electroforesis. Cargar 20 µl de cada muestra. Poner a correr el gel a 100V durante 60-90 minutos. El ADN migra hacia el polo positivo (negro) porque está cargado negativamente. Ver los resultados con la lámpara UV.

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