Este documento describe la fibrosis quística, una enfermedad genética causada por mutaciones en el gen CFTR. Las principales manifestaciones clínicas son insuficiencia pancreática y enfermedad pulmonar crónica. Existen varios tipos de mutaciones asociadas con distintos fenotipos, siendo la más común la deleción F508. El diagnóstico molecular permite correlacionar genotipo y fenotipo, así como realizar asesoramiento genético.

1. Fibrosis Quistica
Enfermedad Fibroquistica del Páncreas
Mucovisidosis
Bioq. Raúl Horacio Lucero

2. Presentación Clínica
Insuficiencia pancreática exócrina, con sus consecuencias nutricionales.
Enfermedad pulmonar crónica (infecciónes recurrentes) Principal causa
de morbilidad y mortalidad.
Alteración de los valores de cloruro y sodio en el sudor.
El 95% de los varones son estériles por ausencia bilateral congénita de
vasos deferentes.
Complicaciones más frecuentes
íleo meconial (15%).
Cirrosis hepática.
Pólipos nasales.
Síndrome de obstrucción intestinal distal
Prolapso rectal.
Edemas y hematomas (generalmente en neonatos)

3. Defecto Básico
Mutaciones en el gen CFTR
(Regulador de la Conductancia Transmembrana de la Fibrosis
Quística)
Codifica una proteína involucrada en el transporte de iones a
través de la membrana celular.
Genética
Enfermedad monogénica.
Es la enfermedad autosómica recesiva más frecuente en la población blanca.
Probabilidad de tener un hijo afectado en una pareja de portadores es del 25%
Incidencia de 1 en 2500 nacidos vivos.
Frecuencia de portadores de 1 en 25.
Heterogeneidad alelica asociada a heterogeneidad clínica

4. Características Moleculares
Gen CFTR Proteína CFTR
Regulador de la Conductancia Glicoproteína integral de membrana
Transmembrana de la Fibrosis Quística. (1480 aa).
Canal de Cloro regulado por
Localización en el cromosoma 7. AMPcíclico.
Mapea en 7q 31. Dos motivos repetidos: con un
dominio transmembrana (TM1 y 2),
Región codificante: 250 Kb. un dominio de unión a nucleótidos
(NBF1 y 2) y un dominio
Constituido por 27 exones.
citoplasmático con función
reguladora (R).

5. CFTR

6. Mutaciones del gen CFTR
∆F508: Deleción de tres pares de bases en el exón 10, que implica
una pérdida de una fenilalanina en la posición 508 del péptido.
Esta presente en el 67% de los cromosomas provenientes de
afectados, a nivel mundial.
Hay grandes variaciones geográficas y étnicas.
Es la mutación más frecuente en todas las poblaciones a
excepción de los Judios Ashkenazis (W1282X).
Presenta alta frecuencia en el Norte de Europa (70%-80%),
y más baja en el Sur de Europa (50%-55%).
No se encontraron grandes deleciones.
Más de 1500 mutaciones asociadas a la enfermedad
Alrededor de 200 polimorfismos.
Algunas mutaciones tienen una alta frecuencia en grupos étnicos específicos.

7. Espectro de mutaciones
En la actualidad, se han identificado más de 1.500 cambios (mutaciones y
polimorfismos) en el gen CFTR. La mutación más común a nivel mundial es
una deleción de fenilalanina en posición 508 (p.F508del, sigla anterior ∆F508).
Sin embargo, las mutaciones comunes (p.F508del, p.G542X, p.G551D,
p.N1303K, p.W1282X) han mostrado diferentes frecuencias entre distintos
grupos étnicos y localizaciones geográficas. La mayoría de las restantes
mutaciones son menos frecuentes y generalmente se limitan a una región
geográfica o a la aparición familiar exclusiva.
Las mutaciones que provocan el cambio de un aminoácido por otro (en inglés
"missense") representan un 41% de las mutaciones asociadas a enfermedad;
las que provocan un codón de terminación prematuro (en inglés "nonsense"),
un 10%; las inserciones o deleciones que causan un cambio en el marco de
lectura (en inglés "frameshift"), un 18% y aquellas que alteran nucleótidos
conservados en sitios de unión intrón-exón y afectan el procesamiento del pre-
ARNm (en inglés "splicing"), un 13%.
Existen 3% de rearreglos genómicos (grandes deleciones o inserciones) y otro
1% que afecta la zona promotora. Se han publicado datos sobre alrededor de
un 14% de cambios neutros que no ocasionan enfermedad denominados
polimorfismos.

8. Características Clínicas de pacientes
Fibroquísticos
Fenotipo Severo Fenotipo
Moderado
Edad de diagnóstico Temprana Tardía
(1 a 2 años) (> de 10 años)
Función Pancreática IP SP
Estado Nutricional Pobre Bueno
Ileo Meconial Alta Incidencia (15%) No
Cl en sudor (> 80 mEq./l) 40-80 mEq./l
Fertilidad en hombres CBAVD CBAVD
Función pulmonar Variable Variable
Mutaciones asociadas 2 alelos severos 1 alelo moderado

9. Tipos de Mutaciones de acuerdo al Fenotipo
Mutaciones Severas Mutaciones Moderadas
∆F508 R117H
G542X A455E
G551D 3849 + 10 Kb C → T
R553X R334W
621 + 1 G → A R347P
W1282X R347H
N1303K R3529
1717 − 1 G → A 2789 + 5 G → A

10. Clases de Mutaciones del gen CFTR
G542X
W1282X ∆F508 G551D R117H
N1303k R334W 3849+10KbC→T
R1162X G551S
S549R R347P ALELOS 5T
R553X S1225
621+1G→T ∆I507 A455E

11. Polimorfismos
Pueden influenciar en el fenotipo
Más estudiado en el CFTR Alelos T (intrón 8)
El ejemplo más estudiado, con la mutación R117H:
R117H/∆F508 → 7T / 7T → CBAVD
CBAVD
R117H/∆F508 → 5T / 7T Test del Sudo
R117H/∆F508 → 5T / 5T patológico o límite
Enfermedad pulmonar leve a
moderada
Suficiencia pancreática exócrina
R117H/∆F508 → 7T / 7T Mujeres No sintomáticas

12. Resumen
Fenotipo pancreático fuertemente correlacionado con el genotipo.
Mutaciones usualmente asociadas a IP y otras a SP.
Insuficiencia Pancreática (IP) → severo
Suficiencia Pancreática (SP) → moderado
El diagnóstico temprano y las diferencias en los tratamientos serían los
responsables de la variabilidad en la severidad de la enfermedad
pulmonar, y de la ocurrencia de las complicaciones más comunes de la
Fibrosis Quística.
Existen otros factores genéticos, dentro y fuera del gen CFTR, así como
también factores ambientales.

13. APLICACIONES DEL DIAGNOSTICO
MOLECULAR
Asesoramiento Genético.
Familias con historia previa de FQ.
Cosanguineidad.
Diagnóstico de la enfermedad.
Individuos con síntomas clínicos sugestivos de FQ en los que
os métodos clásicos no son concluyentes.
Diagnóstico prenatal cuando por ultrasonido se detecta íleo
meconial, bolo ecogénico o bolo obstructivo.
Screening positivo.
Infertilidad masculina por ausencia bilateral de vasos deferentes.
(se estudia también a la pareja para los cálculos de riesgo).
Ovo donación y espermodonación.
Estudios de Correlación Genotipo/ Fenotipo
Terapéutica ?

14. DIFICULTADES PARA EL DIAGNOSTICO
MOLECULAR DE LA FIBROSIS QUISTICA
Gran espectro de mutaciones asociadas a la enfermedad.
Las diferentes mutaciones presentan grandes variaciones en sus frecuencias
en las diferentes poblaciones.
Grandes variaciones en el número de mutaciones para un análisis genotípico
completo.
Recomendación: Realizar estudios poblacionales para tener idea de la
frecuencia de mutaciones y poder establecer el rango de confianza.
Si existe historia de FQ en la familia, y no se determinó la mutación, realizar
estudios de ligamiento genético.
Quedan casos sin resolver.
Métodos costosos y laboriosos.

15. Metodos de Diagnostico Molecular
Metodos Directos Métodos Indirectos
Uso de diferentes técnicas Marcadores extra o intra génicos.
para detectar alteraciones
en el ADN. No especifican la mutación.
Son más complejos y laboriosos.
Uso de Kits comerciales
Búsqueda de nuevas mutaciones
DGGE.
SSCP.
TGGE.
Secuenciacion.

16. Ausencia Bilateral Congénita de Vasos Deferentes
(CBAVD)
Representa del 1 al 2% de la esterilidad masculina, y hasta el 25%
de la azoospermia obstructiva global.
Cuando está aislada es considerada como una entidad clínica
particular, pero debido a que está presente en el 95% de los
varones con Fibrosis Quística (FQ), Holsclaw propuso que los
varones con CBAVD presentarían una forma leve de FQ.
La hipótesis de Holsclaw fue corroborada años más tarde cuando fue
posible identificar y clonar el gen causante del defecto básico de
FQ detectándose mutaciones del CFTR en pacientes CBAVD.
Es causada por el mal desarrollo de los conductos mesonéfricos
generando agenesia o atresia del epidídimo, los vasos
deferentes, y las vesículas seminales.
Presenta un patrón de herencia autosómica recesiva.
.

17. La severidad de las manifestaciones clínicas de la FQ, está
relacionada con las diferentes clases de mutaciones del gen CFTR.
La CBAVD por su desarrollo, sería una forma de presentación FQ
ubicada en el extremo leve de un gradiente de expresión.
Los pacientes CBAVD presentan las mismas mutaciones que los
FQ pero con otra frecuencia y algunas variantes propias (IVS 8-5T).
Se comprobó una asociación entre la presencia de mutaciones y
sintomatología compatible con FQ en pacientes con CBAVD.
Si bien los pacientes CBAVD tendrían una forma
preponderantemente genital de FQ, en algunos ciertos síntomas
referidos exigen profundizar los estudios pulmonares y digestivos
propios de la patología FQ.

18. Diagnóstico de CBAVD
Ausencia de vasos deferentes, epidídimo y/o vesículas seminales en la
palpación y/o ultrasonografía.
Análisis bioquímico del semen :
Azoospermia.
Bajo volumen (< 0.5 cc)
pH< 7
Alta concentración de ácido cítrico
Ausencia de células redondas
Peroxidasa negativo.
Baja concentración de fructosa.

19. Asesoramiento
Los pacientes con CBAVD tienen espermatogénesis normal.
Actualmente es posible el tratamiento de su infertilidad.
Si la CBAVD está asociada con mutaciones en el CFTR, estos pacientes tienen
riesgo aumentado de tener hijos FQ o CBAVD, ya que tienen el 100% de
probabilidad detransmitir una copia alterada del gen.
La mujer debe ser estudiadas para las mutaciones FQ .

20. Zona regulatoria
250.000 pb (27 Exones) F508
Pérdida de
Fenilalanina en
posición 508
Deleción de 3 Nt (CTT) entre
los Nt 1652-1655

21. PCR(ΔF508)
Sangre Extracción de Alelo específica
periférica ADN
NORMAL Electroforesis
MUTADO
HOMOCIGOTA
HETEROCIGOTA

22. FREQUENT CYSTIC FIBROSIS MUTATIONS
Name Relative frequency Mutation Consequence
F508 67.2 Deletion de 3pb, Ex 10 Del Phe
G542X 3.4 G T, Ex 11 Gly Stop
W128X 2.1 G A, Ex 20 Trp Stop

23. Pacientes Hosp. Pediátrico (Rcia.)
F1 (4 a) 02-05-03 HOMO. M P/P F
31%
F2 (2 a) 19-05-03 HOMO. N E C TS +-
F3 (1 a) 04-06-03 HETE. M P/P TS +-
F
23%
F4 (7 a) 26-06-03 HETE. M CONTROL
F5 (21 a) 20-08-03 HETE M mamá
46% F6 (31 a) 20-08-03 HETE. M papá
F7 (7 a) 26-08-03 HETE. M P/P
F8 (1 a) 22-09-03 HETE. M PUL.
F9 (8 m) 29-09-03 HOMO. M PUL. TS +
F10 (3m) 26-04-04 HOMO. M PUL.
F11 (6 m) 30-04-04 HOMO. N F
F12 (3 m) 18-04-04 HOMO. N TS +
F13 (11 a) 01-07-04 HOMO. N TS +

24. PACIENTES ROSARIO
FR1 (21 a) HETE. M IP. Hna. F.
13% FR2 (34 a) HETE. M IP
FR3 HETE. M
20% FR4 HETE. M
FR5 (19 a) HETE. M TS + P/P
67% FR6 HOMO. M
FR7 (17 a) HOMO. M CONTROL P/P
FR8 (12 a) HOMO. N IP TS + P/P
FR9 (8 a) HETE. M IP Control
FR10 (15 a) HETE. M IP TS+ Control
FR11 (14 a) HOMO. M P/P TS+
FR12 (33 a)HF2 HETE. M P/P
FR13 HETE. M
FR14 HOMO. N
FR15 HETE. M

26. Foto de corrida electroforética en gel de agarosa al 2%. De izquierda a derecha:
w16d16,w17d17,w20d20,w20´d20´ ,mpm ,w21d21,w21´d21´,w-d- .
Paciente w16d16: Homocigota mutado
Paciente w17d17: Heterocigota mutado
Paciente w20d20: Heterocigota mutado
Duplicado paciente anterior w20´d20´: Heterocigota mutado
Mpm: Marcador de Peso molecular
Paciente w21d21: Homocigota normal
Duplicado paciente anterior w21´d21´ : Homocigota normal
w-d-: Control negativo