Este documento describe un experimento de cromatografía en columna para separar los pigmentos clorofila y carotenoides de las hojas de espinaca. Se extrajeron los pigmentos de las hojas usando acetona y hexano. Los pigmentos se separaron en una columna de sílice llenada con hexano, hexano-acetona y acetona. Se identificaron cuatro picos correspondientes a xantofilas, carotenos y clorofila a y b. La cromatografía en capa delgada confirmó la separación de los componentes.

1. Universidad de Guanajuato DCNE Lab. Química Orgánica I Prof. Dr.Eduardo Báez
García Práctica8: Cromatografía en Columna (CC) Andrea Ramírez
Mauricio
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (CC). SEPARACIÓN DE LOS PIGMENTOS CLOROFILA Y
CAROTENOIDES DE HOJAS DE ESPINACAS
INTRODUCCIÓN
En general los principios teóricos de la cromatografía plana (CF) y la cromatografía en columna son los mismos, la
diferencia entre estas dos técnicas radica en la configuración del sistema cromatografico, ya que la cromatografía
plana se realiza en un sistema abierto, mientas que en columna se trata de un sistema cerrado, además pueden
identificarse las siguientes diferencias[1]
:
1. En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias, mientras que en la de columna es por
tiempos o volúmenes.
2. En la cromatografía en columna la velocidad puede controlarse fácilmente dependiendo del gradiente de
presión mantenido en la columna, cosa que no se puede hacer en la plana.
3. El tiempo en la cromatografía plana está en función del tiempo que le tome al disolvente llegar a cierto
punto en la placa, independientemente de los componentes, mientras que en la de columna cada uno de
los componentes debe de atravesar completamente la columna.
4. Para la elección de la fase móvil de la cromatografía en columna debe realizarse de forma que eluya
todos los componentes de la muestra para que no se produzca estancamiento en la columna, mientras
que en la plana puede que algunos compuestos no migren y esto no afecta a los demás componentes.
La muestra que se someterá en el experimento es la espinaca una fuente de colorantes naturales, los cuales día
día están cobrando más fuerza en el mercado, a grandes rasgos se pueden agrupar en los siguientes grupos:
 Clorofilas: Que son los pigmentos fotosintéticos de las plantas. Están constituidas por un anillo de
porfirina y una cadena denominada fitol. El anillo de porfirina se encuentra en el grupo hemo de la
hemoglobina.Los nitrógenos pirrolicos se encuentran cooordinados a un ion Mg2+
.
 Antocianos: Son glucósidos cuyos aglicones son las antocianidas,derivadas del catión flavilio.Estas son los
responsables de los colores rojos,azulados o violetas de las frutas y flores.
 Carotenoides: Son isoprenoides responsables del color amarillo y naranja de platas y animales.
En la práctica se realizará la extracción de los pigmentos clorofila y carotenoides de hojas de espinacas, las cuales
contienen clorofilas que son los pigmentos verdes que actúan como moléculas fotoreceptoras principales de las
plantas. Hay dos formas diferentes que son la clorofila a y la clorofila b. Las dos formas son idénticas, excepto en
que un grupo metilo en la clorofila a es reemplazado por un grupo -CHO en la clorofila b. Tambien
encontraremos Feofitina a y Feofitina b que son idénticas a la clorofila a y clorofila b, respectivamente, excepto que
en cada caso un ion magnesio Mg2+ es reemplazado por dos iones hidrogeno H+.
Algunos de los valores de Rf que se esperan son los siguientes[2]
:
Las feofitinas pueden no estar presentes, ya que estas sustancias aparecen como resultado de la
descomposición de las clorofilas por efecto de la luz ,el aire y el agua durante la manipulación de
la espinaca.

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Los carotenoides son un grupo de pigmentos orgánicos,(tetraterpenos[3]
) con función antioxidante, se pueden
clasificar en carotenos y Xantofilas. Los carotenos son aquellos que poseen una coloración rojiza,mientas que las
xantofilas son aquellos responsables de la coloración
amarilla. La estructar más común de las xantofilas es la
siguiente
PARTE EXPERIMENTAL
Material:
 Tubo para centrifuga
 Mortero con pistilo
 Tubos de ensaye
 Pipeta Pasteur
 Soporte Universal
Reactivos:
 Hexano-Acetona 90:10
 Hexano-Acetona 70:30
 Acetona
 Acetona-Metanol 80/20
 Hexano
 Agua destilada
 Sulfato de Sodio Anhidro
Procedimiento:
PARTE A EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS: Pese 0.5 g de hojas de espinacas frescas corte las hojas en pequeños
trozos y colóquelas en un mortero junto con 1.0 ml de acetona fría. Muélalas con el pistilo, adicione mas acetona si
se requiere (0.5 a 1.0 ml) para continuar con la siguiente etapa. Usando una pipeta Pasteur transfiera la mezcla a un
tubo de centrífuga o tubo de ensaye, enjuague el mortero y pistilo con 1.0 ml de acetona fría y transfiera los
lavados al tubo. Tape el tubo y centrifugue la mezcla o bien agite cuidadosamente, ventile y deje reposar.Adicione
al tubo 2.0 ml de hexano y tápelo, agite la mezcla y ventile. Adicione 2.0 ml de agua, agite y ventile. Elimine la fase
acuosa (capa de abajo) con una pipeta Pasteur.
Usando una pipeta Pasteur, prepare una columna conteniendo arena al inicio y final de la columna y en medio silica
gel cubirendo la mayor parte de la pipeta. Coloque un pequeño tapón de algodón en la base de la pipeta (donde
empieza a estrecharse). Coloque la columna en posición vertical sostenida con una pinza y coloque el tubo de
ensaye bajo la columna. Con una pipeta Pasteur transfiera la capa de hexano a la columna. Cuando la solución se
haya drenado, adicione 0.5 ml de hexano a la columna para extraer los pigmentos del agente desecante. Evapore
el disolvente colocando el tubo de ensaye en un baño de agua (40-60°C) y orientando un flujo de nitrógeno o de
aire sobre la boca del tubo de ensaye. Disuelva el residuo en 0.5 ml de hexano. Tape el tubo con el extracto y
colóquelo en un lugar seguro hasta que tenga lista su columna para correr la cromatografía.
PARTE B CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

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Antes de correr la columna, prepare el siguiente material y líquidos. Prepare 5 tubos de ensaye y numérelos.
Prepare cuatro recipientes separados, en uno coloque 5.0 ml de hexano, en el siguiente 3 ml de la solución hexano
70% - acetona 30% (v/v); en otro 3 ml de acetona y en el cuarto 3 ml de la mezcla acetona 80% - metanol
20%.Usando una pipeta Pasteur adicione hexano a la columna. La columna debe estar completamente humedecida
por el disolvente. Drene el exceso de hexano hasta el nivel que el hexano alcance el tope de la alúmina. Una vez
que se haya adicionado el hexano a la alúmina, no debe permitirse que la columna se seque, si es necesario
adicione más hexano. .Adicione la mitad (0.25 ml) de los pigmentos disueltos previamente a la columna. Deje el
remanente en el tubo de ensaye para el procedimiento de cromatografía en capa fina. Continúe colectando el
eluente en el tubo número 1. A medida que la solución del pigmento penetra en la columna, adicione 1 ml de
hexano y drene hasta que el líquido alcance el nivel de la parte inferior de la silica. Adicione el primer disolvente y
onserve cual es el primer componente en salir, siga adicionando disolvente de manera que el componente recorra
toda la columna y coléctelo en un tubo de ensaye, una vez que el componente cambie de color, cambie también
de disolvente y agregue así sucesivamente hasta que todos los componentes salgan, es decir hasta que el líquido
salga transparente, tenga cuidado de no juntar componentes en un mismo tubo de ensaye.
PARTE C CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA. (CCF)
Prepare la fase móvil, en este caso es una mezcla de hexano 70% - acetona 30% y un vaso de precipitados de un
tamaño adecuado en donde quepa la placa sin doblarse. En la placa aplique las muestras obtenidas y un punto de
la mezcla original. Coloque la placa de CCF en el vaso de precipitados, asegurándose de que el volumen de
disolvente en la cámara de revelado quede debajo del nivel en donde se aplicó la muestra. Detenga la
cromatografía cuando el disolvente este a 0.5 cm de la orilla superior de la placa, marque la posición hasta donde
llega el solvente con un lápiz. Coloque la placa en luz UV para la identificación de cada uno de los componentes.
Calcule los Rf para cada componente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓn
Pues en los diferentes equipos se observan considerables variaciones, en general, todos
obtuvimos de 4-6 componentes todos en tonalidades amarillo y verdes, esto por la
presencia de xantofilas y carotenos, las lineas amarillas que se aprecian corresponden a las
xantofilas y los colores verdes a la clorofila presente en las hojas de espinaca, podemos
observar que en algunos equipos los componentes no migraron mientras que en otros la
mayoría de los componentes llegaron hasta el limite, esto puede deberse a que algunas
muestras fueran eveporadas del ciclohexano mientras que otras aun lo contenían, esto
pudo ocasionar variaciones en las migraciones.

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CONCLUSIÓN: La cromatografía en columna es un proceso más tardado que la CCF al igual puede haber
complicaciones cuando los componentes no son separados debidamente, para que los componentes vayan
saliendo en cierto orden es recomendable usar diferentes solventes con polaridades diferentes, empezando por los
de más baja polaridad e ir incrementándola poco a poco.En este tipo de cromatografía se ven implicadas otras
técnicas de laboratorio como son la extracción.Los compuestos encontrado en las hojas de espinaca fueron
xantofilas,carotenos y clorofila las responsables del color verde de las hojas.
REFERENCIAS:
[1]Tecnicas Analiticas de Separación M.Valcarcel Edit.Reverté Cap.Cromatografia Pag.400-416
[2] Experimentos de Química Orgánica. Anderson Guarnazio Franco. Sepración de pigmentos por
cromatografía.Pág108-110
[3] Fundamentos de química orgánica Bruice p. y. Edit.pearson Carotenoides pag.1078
Calculosde Rf’sennuestra
muestra:
Muestra problema:
Rf 1 =
3.6
4.6
= 0.782
Rf 2 =
1.6
4.6
= 0.347
Rf 3 =
0.8
4.6
= 0.173
Rf 4 =
0.4
4.6
= 0.086
1o
Fracción:
Rf 1 =
3.6
4.6
= 0.782
Rf 2 =
1.6
4.6
= 0.347
Rf 3 =
0.8
4.6
= 0.173
Rf 4 =
0.3
4.6
= 0.065
2o
Fracción:
Rf =
0.3
4.6
= 0.065
3o
Fracción:
Rf =
3.3
4.6
= 0.717
4o
Fracción, no se observaron manchas.
Comparando los resultados obtenidos con los teóricos expuestos en la introducción la muestra
contenía Carotenos,beta, tanto la clorofila a y b y las xantofilas, mientras que la feofitina no fue
encontrada pues durante el proceso pudo haberse descompuesto.