La secuenciación de próxima generación está cambiando el paradigma de las pruebas genéticas clínicas. Actualmente hay disponibles numerosas pruebas moleculares que incluyen pruebas de un solo gen, paneles de genes y secuenciación de exomas o secuenciación del genoma. En consecuencia, los médicos encargados se enfrentan al dilema de seleccionar la mejor herramienta de diagnóstico para sus pacientes con condiciones genéticas. Las pruebas de un solo gen son a menudo más apropiadas para condiciones con características clínicas distintivas y heterogeneidad mínima de locus. Las pruebas de panel de genes basadas en la secuenciación de próxima generación, que se pueden complementar con la hibridación genómica comparativa de matriz y otros métodos auxiliares, proporcionan un enfoque amplio y factible para trastornos heterogéneos. La secuenciación del exoma y la secuenciación del genoma tienen la ventaja de ser imparciales respecto de qué conjunto de genes se analizan, lo que permite la interrogación paralela de la mayoría de los genes en el genoma humano. Sin embargo, las limitaciones actuales de la tecnología de secuenciación de próxima generación y nuestras capacidades de interpretación variable evidencian la importancia de la secuenciación del exoma o la secuenciación del genoma como enfoques de diagnóstico independientes o de primera elección. Un interés creciente en la medicina personalizada exige la aplicación de la secuenciación del genoma en el diagnóstico clínico, pero se deben abordar grandes desafíos antes de que se pueda realizar todo su potencial. Aquí, proponemos un algoritmo de prueba para ayudar a los médicos a optar por la herramienta de diagnóstico molecular más adecuada para cada escenario.

1. 444
REVISIÓN © Colegio Américano de Genética Médica y Genómica
INTRODUCCIÓN
La tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) se ha
adaptado rapidamente a las pruebas clínicas y está cambiando
radicalmente el paradigma del diagnóstico clínico. En algunos casos,
la tecnología ayuda a poner fin a la larga búsqueda de una causa
genética, conocida como la "odisea diagnóstica". Estos cambios son
evidentes por el rápido aumento en la cantidad de laboratorios que
ofrecen pruebas basadas en NGS. La variedad de enfermedades para
las cuales se ofrecen las pruebas y el número de dichas pruebas está
determinado por los médicos. A partir de abril de 2014, el Registro de
Pruebas Genéticas enumeró más de 450 paneles clínicos NGS
dirigidos a enfermedades que comprenden múltiples genes
disponibles tanto en el sector comercial como en laboratorios clínicos
afiliados a la educación. Actualmente, hay aproximadamente 10
laboratorios clínicos que ofrecen secuenciación de exoma (ES); la
secuenciación del genoma (GS) también está disponible en un
puñado de laboratorios.
La tecnología NGS tiene el atractivo de reducir el tiempo y el costo
de las pruebas, especialmente cuando la secuencia implica un mayor
número de genes, pero ¿es la mejor herramienta de diagnóstico en
todos los escenarios clínicos? ¿Aún tiene lugar un análisis de un solo
gen específico? Para los paneles genéticos, ¿incluir más genes es
siempre mejor? ¿Por qué elegir las pruebas de panel de genes cuando
ES puede proporcionar información sobre todas las regiones de
codificación y está cada vez más disponible?
Es posible que ES se haya convertido en la prueba de primer nivel
ordenada por los médicos para evaluar las causas genéticas. Se
plantea la cuestión de qué papel desempeña el clínico en la
realización de una evaluación clínica detallada del paciente para
elegir la mejor herramienta de diagnóstico. Por lo tanto, se necesita
con urgencia una visión general exhaustiva que compare los
diferentes enfoques de prueba y el bosquejo de las indicaciones para
cada tipo de prueba. En esta revisión, evaluamos estas opciones de
pruebas genéticas en términos de indicaciones clínicas, desafíos en la
interpretación y notificación de variantes de secuencia, así como
fortalezas y limitaciones técnicas. También proponemos un
algoritmo de prueba que puede ayudar a los médicos a optar por la
herramienta de diagnóstico molecular más apropiada para cada
escenario.
INDICACIONES PARA UN SOLO GEN, PANEL DE
GENES Y PRUEBAS ES
El poder de las pruebas basadas en NGS ha sido demostrado en
múltiples casos. Un ejemplo extremo es una GS de 50 horas ofrecida
en unidades de cuidados intensivos neonatales que posibilitó un
diagnóstico genético en dos niños.1 Sin embargo, es fundamental
tener en cuenta que el enfoque tradicional (por ejemplo, el análisis de
un solo gen y el análisis de metilación) aún tiene gran valor para
muchos trastornos. En un análisis retrospectivo de 500 pacientes,
Enviado el 2 de mayo de 2014; aceptado el 7 de agosto de 2014; Publicación anticipada en línea 18 de septiembre 2014. doi:10.1038/gim.2014.122
La secuenciación de próxima generación está cambiando el paradigma de las
pruebas genéticas clínicas. Actualmente hay disponibles numerosas pruebas
moleculares que incluyen pruebas de un solo gen, paneles de genes y
secuenciación de exomas o secuenciación del genoma. En consecuencia, los
médicos encargados se enfrentan al dilema de seleccionar la mejor
herramienta de diagnóstico para sus pacientes con condiciones genéticas.
Las pruebas de un solo gen son a menudo más apropiadas para condiciones
con características clínicas distintivas y heterogeneidad mínima de locus. Las
pruebas de panel de genes basadas en la secuenciación de próxima
generación, que se pueden complementar con la hibridación genómica
comparativa de matriz y otros métodos auxiliares, proporcionan un enfoque
amplio y factible para trastornos heterogéneos. La secuenciación del exoma y
la secuenciación del genoma tienen la ventaja de ser imparciales respecto de
qué conjunto de genes se analizan, lo que permite la interrogación paralela
de la mayoría de los genes en el genoma humano. Sin embargo, las
limitaciones actuales de la tecnología de secuenciación de próxima
generación y nuestras capacidades de interpretación variable evidencian la
importancia de la secuenciación del exoma o la secuenciación del genoma
como enfoques de diagnóstico independientes o de primera elección. Un
interés creciente en la medicina personalizada exige la aplicación de la
secuenciación del genoma en el diagnóstico clínico, pero se deben abordar
grandes desafíos antes de que se pueda realizar todo su potencial. Aquí,
proponemos un algoritmo de prueba para ayudar a los médicos a optar por
la herramienta de diagnóstico molecular más adecuada para cada escenario.
Genet Med, publicación anticipada en línea 18 de septiembre de 2014
Palabras clave: secuenciación de exomas; panel de genes; pruebas de
diagnóstico molecular; secuenciación de próxima generación; prueba de un
solo gen.
Los dos primeros autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
1Emory Genetics Laboratory, Departamento de Genética Humana, Emory University, Atlanta, Georgia, EE.UU.; 2 División Clínica, Departamento de Genética Humana, Emory
University, Atlanta, Georgia, EE. UU. Correspondencia: Yuan Xue (yuan.xue@emory.edu)
Resolver el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular
para los trastornos mendelianos en la era de la secuenciación
de próxima generación: un solo gen, panel de genes o
secuenciación del genoma/exoma
Yuan Xue, PhD, FACMG1
, Arunkanth Ankala, PhD1
, William R. Wilcox, MD,
PhD2
and Madhuri R. Hegde, PhD, FACMG1
Traducción por Eyder A. Rodríguezenetics
medicine

2. 445
Resolviendo el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos | XUE et al REVISIÓN
casi el 50% recibió un diagnóstico genético a través de enfoques
tradicionales, con la mayoría de estos pacientes recibiendo
diagnósticos en la primera o segunda visita a la clínica de genética.2
Además, las limitaciones actuales de la tecnología NGS evitan que
sea una prueba estándar; no puede detectar de forma fiable los
cambios de número de copias, los cambios de repetición de tripletes,
y así sucesivamente. Esta situación es similar a la hibridación
genómica comparativa de matriz (aCGH) en citogenética, que se
ha convertido en la prueba de primer nivel para la evaluación de
anomalías cromosómicas asociadas con discapacidad intelectual
(ID), autismo y anomalías congénitas múltiples, que sustituyen al
cariotipo.3 Sin embargo, el cariotipo todavía se necesita como
prueba citogenética complementaria porque aCGH no puede
detectar ciertos reordenamientos cromosómicos, como
translocaciones equilibradas. Por lo tanto, es esencial que los
médicos entiendan las fortalezas y limitaciones de las pruebas
moleculares para elegir el método apropiado para cada paciente. Las
indicaciones y ejemplos para pruebas de un solo gen, paneles
genéticos y ES se resumen en la Tabla 1.
Prueba de un solo gen
Se prefiere la prueba de un solo gen cuando las características
clínicas y otros resultados de las pruebas para un paciente son
típicas de un trastorno particular y se establece la asociación entre
el trastorno y un gen específico. La sensibilidad clínica de una
prueba de un solo gen es alta porque el fenotipo y otros hallazgos
apuntan claramente a un trastorno que está asociado con un gen.
También hay una clara ventaja interpretativa para el enfoque de un
solo gen porque la probabilidad de descubrir múltiples variantes de
confusión de significación clínica desconocida (VUS) es mínima.
No hace falta decir que la sospecha de un gen basado en los
hallazgos clínicos requiere experiencia clínica. Por ejemplo, el gen
FGFR3 es el único que se sabe que está asociado con la
acondroplasia. La prueba de un solo gen de FGFR3 detecta
mutaciones en el 99% de los pacientes con acondroplasia y, por lo
tanto, es el enfoque más eficiente en términos de costo y tiempo.4 Sin
embargo, el médico necesita tener conocimiento de los hallazgos
clínicos y radiográficos diagnósticos de la acondroplasia para
seleccionar la prueba genética correcta.
Paneles de genes
Para muchos trastornos, la variabilidad clínica y la heterogeneidad de
los locus genéticos son lo suficientemente importantes como para
que el enfoque de un panel de genes sea apropiado para un
diagnóstico molecular eficiente y oportuno (ver Cuadro 1, Caso 1).
La transformación de la prueba de un gen a la vez a un panel de genes
producido por NGS no solo aumenta la sensibilidad analítica a las
pruebas de diagnóstico de ADN, sino que también simplifica el
proceso de toma de decisiones para los médicos encargados. Desde la
introducción de NGS en la práctica clínica, el número y la variedad
de trastornos para los que se ofrecen las pruebas de panel de
multígenos se han incrementado drásticamente. La Tabla 1 enumera
las indicaciones y ejemplos de cuándo un panel de genes es más
apropiado que otras opciones de prueba.
El número de genes para las mismas indicaciones clínicas o
similares puede variar significativamente entre los diferentes
laboratorios clínicos. Por ejemplo, hay al menos cuatro laboratorios
clínicos que ofrecen un panel de genes de epilepsia, con un número
de genes que oscila entre 70 y 377. La diferencia obvia en el número
de genes incluidos en los paneles resulta de la evidencia de la
asociación de la enfermedad y rigurosidad de los criterios de
inclusión utilizados por los laboratorios de prueba. Aunque algunos
laboratorios pueden preferir incluir todos los genes posibles que
están incluso remotamente asociados con el fenotipo de interés con
la esperanza de un mejor rendimiento diagnóstico, otros
laboratorios adoptan un enfoque más conservador y eligen incluir
solo aquellos genes que tienen pruebas sólidas de asociación con la
alteración. Los genes vinculados con una enfermedad basados
únicamente en estudios de asociación o informes únicos con
frecuencia terminan por no ser causales del fenotipo cuando se
Tabla 1 Indicaciones para un solo gen, panel de genes y pruebas de ES
Opción de prueba Indicaciones Ejemplos Referencia
Prueba de un solo gen 32Heterogeneidad mínima de locus CFTR para CF
FGFR3 para acondroplasia;
PAH para PKU
4,33Hallazgos clínicos distintivos (por ejemplo, radiografía, evaluación bioquímica)
apuntan claramente a un gen específico.
Limitaciones de la tecnología de secuenciación de NGS para detectar trastornos y
trastornos trinucleotídicos repetidos con anomalías epigenéticas.
Frágil X; Prader-Willi y
síndrome de Angleman
34,35
16
36
Panel de genes Heterogeneidad Panel de distrofia muscular
Panel de miocardiopatía
Panel de epilepsia 37
38Panel de RASopatías
Autismo, ID 39
Trastornos con diagnóstico de fenotipo diferencial superpuesto
Trastornos que comparten una manifestación, pero pueden tener una
presentación global completamente diferente.
Enfermedades asociadas a genes de una vía o estructura común
ES/GSa
Heterogeneidad extrema y cambios de novo son las principales mutaciones
Dos o más probables fenotipos no relacionados en un paciente Albinismo oculocutáneo y neutropenia 40
Síndrome de Kabuki 41No hay característica fenotípica clave presente en el momento en que se solicita la
prueba
El fenotipo es indistinto, y la verdadera causa subyacente no es fácil de identificar
Diarrea congénita; Síndrome de
Zellweger
42,43
CDG, trastorno congénito de glicosilación; FQ, fibrosis quística; CFTR, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística; ES, secuenciación exómica; FGFR3, receptor
3 del factor de crecimiento de fibroblastos; GS, secuenciación genómica; ID, discapacidad intelectual; NGS, secuenciación de próxima generación; PAH, fenilalanina hidroxilasa; PKU,
fenilcetonuria; RASopatías, un grupo de trastornos genéticos causados por variantes patógenas en los genes que codifican los componentes de la ruta de proteína quinasa activada por
Ras/mitógeno (MAPK).
La selección de aES/GS se basa en el costo y la capacidad para el análisis de rendimiento. Generalmente se realiza GS a una profundidad menor que ES; el costo de realizar el ensayo,
realizar el análisis y el almacenamiento es más que eso para ES.eneticsmedicine
GENÉTICA en MEDICINA | Volumen 17 | Número 6 | Junio de 2015

3. 446
XUE et al | Resolver el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos.REVISIÓN
acumulan más evidencias. Sin embargo, un médico que no tenga
conocimiento de este problema puede realizar un pedido pensando
que "más es mejor" y optar por una prueba de panel que ofrezca la
mayor cantidad de genes. Incluso para ES, la cuestión de qué genes
son relevantes para el fenotipo del paciente es fundamental. El
análisis bioinformático en laboratorios que realizan ES primero se
centra en una lista de genes primarios basada en el fenotipo clínico
particular.
Se pueden tomar en cuenta varias consideraciones al decidir
qué genes se incluirán en un panel. Primero, los genes con una
fuerte asociación de enfermedades ciertamente están incluidos; la
capacidad de interpretar los hallazgos de estos genes es mucho
mejor porque hay suficiente evidencia establecida. Estos genes
pueden ya ofrecerse en los laboratorios de diagnóstico clínico como
prueba de un solo gen, pero ofrecerlos como panel puede ahorrar
costos y tiempo. En segundo lugar, los genes asociados con trastornos
que tienen fenotipos superpuestos con los de los trastornos primarios
en el panel genético pueden incluirse para el diagnóstico diferencial.
Por ejemplo, el gen SLC2A2 para el síndrome de Fanconi-Bickel
puede incluirse en el panel del gen de la enfermedad de
almacenamiento de glucógeno porque cuando un paciente se
presenta con hipoglicemia en ayunas, se consideran los diagnósticos
del síndrome de Fanconi-Bickel y la enfermedad de almacenamiento
de glucógeno. Por el contrario, los criterios de exclusión también
deben considerarse. Por ejemplo, los genes para trastornos
peroxisomales no deben incluirse en un panel de genes de trastornos
de almacenamiento lisosómico porque otras herramientas de
diagnóstico (perfiles bioquímicos aquí) pueden ayudar a diferenciar
estos dos grupos de trastornos entre sí. De igual manera, uno debe
decidir si incluir genes para ciertos fenotipos asociados con formas
sindrómicas y no sindrómicas. Por ejemplo, cuando un paciente se
presenta con estatura baja, puede ser aislado o sinónimo. Existen
manifestaciones clínicas o metabólicas definidas para algunas
condiciones de estatura corta sindrómicas que las diferencian
claramente de la baja estatura aislada. Sin embargo, la existencia de
fenotipos más leves o atípicos y la penetrancia incompleta de algunas
mutaciones pueden conducir a la inclusión de genes sindrómicos en
un panel. Claramente, la selección de genes adecuada para los paneles
requiere una asociación entre los médicos y los genetistas de
laboratorio porque el panel de genes tiene que tener sentido para el
médico que lo ordena desde un punto de vista clínico.
El descubrimiento de genes avanza a un ritmo muy rápido como
resultado de la tecnología NGS. La investigación ha generado y está
generando una abrumadora cantidad de información secuencial. Sin
embargo, es esencial tener en cuenta que la validación de estos genes
recientemente descubiertos asociados con un cierto fenotipo
requiere análisis funcionales y/o genéticos, especialmente cuando la
identificación se basa en unas pocas familias o casos simplex. Incluir
estos genes inmediatamente en un panel o análisis de ES puede ser
engañoso. La falta de conocimiento sobre estos genes y las variantes
asociadas dará como resultado una gran cantidad de VUS, lo que
limita la utilidad clínica de la prueba. En un estudio que involucra
genes asociados con la ID ligada a X, 10 de los 100 genes
inicialmente incluidos en el panel de ID ligado a X basado en NGS
parecen ser de patogenicidad dudosa tras el reanálisis, porque las
variantes truncadas y las mutaciones previamente publicadas en
estos genes de hecho tienen una frecuencia relativamente alta en la
base de datos de Exome Variant Server (http://
evs.gs.washington.edu/EVS), que proporciona información de
variación de la población general.5
Secuenciación de exoma
Sin duda, la ES es ahora la herramienta más utilizada para el
descubrimiento de genes de enfermedad mendeliana.6,7 Es probable que
las mejoras en la bioinformática y la tecnología de secuenciación
aumenten aún más la tasa de éxito para el descubrimiento de genes.
Cuando se considera para el diagnóstico clínico, se informa que el ES
tiene un rendimiento diagnóstico de ~ 25-28% .8 De hecho, se observó
una tasa mucho más alta de ~ 50% en un estudio piloto diferente en el
cual la evaluación predeterminada más estricta se aplicó para seleccionar
pacientes adecuados para ES.9
Desde un punto de vista económico, un
Recuadro 1 Ejemplos de casos de nuestro laboratorio clínico
que demuestran las utilidades clínicas de diferentes opciones
de prueba.
Caso 1: Mujer de 44 años con diagnóstico clínico de distrofia muscular
de cintura escapular. La secuenciación inicial del gen CAPN3 no
identificó una mutación. Posteriormente, el análisis de deleción/
duplicación de CAPN3 fue realizado por aCGH y no se detectó ninguna
deleción o duplicación. Un año después, se ordenó la secuenciación de
SGCG, que no detectó una mutación, pero no se informó amplificación
del exón 8. Para evaluar una posible deleción homocigótica del exón 8,
se recomendó terapia génica dirigida aCGH. aCGH detectó una
deleción intragénica en un alelo y una deleción contigua de 1,3 Mb de
12 genes, incluido el SGCG, en el otro alelo. Este caso ilustra la utilidad
de los paneles genéticos dado el número de pruebas negativas de un solo
gen y el tiempo necesario para establecer un diagnóstico. Las pruebas de
panel de genes complementadas con otros métodos pueden ser un
enfoque eficiente en comparación con las pruebas secuenciales de un
solo gen para enfermedades heterogéneas como las distrofias
musculares.
Caso 2: se envió una muestra de un niño de 5 años para ES. Este
individuo tenía hiperreflexia, espasticidad y una sospecha clínica de
paraplejía espástica roja. El análisis de secuenciación previo de genes de
paraplejia espástica múltiple, incluidos ATL1, BSCL2, KIAA0196,
KIF5A, NIPA1, REEP1, SPAST, SPG7, SPG11, CYP7B1 y ZFYVE26, a
través de pruebas de panel de un solo gen y multígenos no identificó
ninguna variante patógena. Sin embargo, ES identificó un VUS
homocigoto c.1483A> G (p.M495V) en el gen DDHD1 de este
individuo. La DDHD1 está asociada a la paraplejia espástica recesiva
autosómica, enfermedad tipo 28 (OMIM 609340), que se caracteriza por
una espasticidad y debilidad de inicio temprano, lentamente progresiva
de la extremidad inferior, así como por hiperreflexia. El análisis de
secuencia dirigida de esta variante detectó una copia de la misma en la
madre y el padre de este individuo, lo que indica que cada padre es un
portador. Hasta la fecha, solo se han reportado seis pacientes de tres
familias con mutaciones truncadas en DDHD1. Aunque es posible que
se requiera un análisis funcional adicional para establecer la
patogenicidad de esta variante, ES posiblemente establezca el
diagnóstico en este individuo. En este caso, aunque las pruebas de panel
(que carecían de DDHD1) no proporcionaron un diagnóstico, ayudó a
descartar genes conocidos, lo que proporcionó soporte para los
hallazgos de ES.enetics
medicine

4. 447
Resolviendo el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos | XUE et al REVISIÓN
estudio reciente ha demostrado que, en comparación con múltiples
pruebas de un solo gen o de bajo rendimiento, la ES tiene el potencial
de proporcionar un beneficio de costo significativo para los pacientes
que permanecen sin diagnosticar después de algunos enfoques
tradicionales.2 ES ha tenido éxito con mayor frecuencia en los casos
en que no depende del conocimiento a priori de la condición
genética. Este enfoque "libre de hipótesis" no se centra en un
conjunto de genes, por lo que es una mejor herramienta de
diagnóstico para ciertos escenarios clínicos (Tabla 1). En el informe
Yang et al.8, la tasa más alta de diagnóstico positivo fue en el grupo de
pacientes con un trastorno neurológico inespecífico, lo que indica
que la ES es el último recurso para el diagnóstico cuando ningún
síntoma específico apunta a una herramienta diagnóstica específica.
Independientemente de lo que induzca a un médico a referir
para ES, es fundamental que toda la información clínica y los
hallazgos de otras evaluaciones estén disponibles para el genetista
molecular clínico para ayudar a interpretar la gran cantidad de
variantes de secuencia generadas a través de ES. Aunque ES
puede pasar por alto el enfoque dirigido por hipótesis de la
secuenciación de un conjunto de genes candidatos, la
interpretación de las variantes depende en gran medida de tener
un fenotipo bien caracterizado. El componente más crucial de
cualquier algoritmo de prueba es la evaluación clínica. ES no es un
sustituto para tomar una historia completa y un fenotipo preciso. Se
pueden requerir evaluaciones adicionales después de ES para hacer
un diagnóstico final. Como lo señalaron Hennekam y Biesecker10, "las
habilidades de diagnóstico de los especialistas médicos pasarán de un
modo de diagnóstico diferencial de prueba anterior a NGS a un modo
de evaluación de diagnóstico posterior a NGS". Esto significa que se
puede usar una prueba de NGS como una herramienta de cribado que
ofrece un puñado de posibilidades, lo que permite a los médicos
realizar una evaluación adicional enfocada y eficiente del paciente. El
esfuerzo de colaboración entre los médicos y los laboratorios de
diagnóstico será más importante a medida que ES se generalice en las
pruebas genéticas.
Aunque los paquetes de exoma disponibles comercialmente
fueron diseñados para cubrir todo el exoma, no ofrecen una
cobertura completa de todos los exones de los genes, incluido el
subconjunto de los genes asociados a la enfermedad conocidos.
Para que ES pase de ser una prueba de detección a una prueba de
primer nivel independiente, primero debe ofrecer una cobertura
completa de todos los exones de al menos los genes asociados a la
enfermedad conocidos. Una verdadera prueba de ES médica
completa tendrá que proporcionar una cobertura completa para
todos los exones de todos los genes conocidos relevantes para la
enfermedad (~ 4,600 genes), mientras se mantiene la cobertura de
todos los 18,000 genes restantes, y tener la capacidad de detectar
variantes a lo largo del espectro completo de mutación de cada uno
de estos genes para hacer a ES la prueba de primer nivel en la
genética molecular. Este enfoque centrado en el gen de la enfermedad
Presentación clínica sugestiva de una condición genética
• Características clínicas distintivas
• Historia familiar de trastorno específico
• Bioquímica indicativa, rayos X o
ensayos complementarios, etc.
• Múltiples preocupaciones inespecíficas
• Autismo y discapacidad intelectual
• No hay panel genético disponible
• Gen único involucrado
• Sospecha de trastornos
repetitivos epigenéticos o triples
• Múltiples genes involucrados
• Secuenciación
de gen único
• Análisis de
triple repetición
• Análisis de metilación
Ensayo de panel de
genes NGS
complementado con
análisis de exón CNV
Negativo después
de 1a y 2a
visita(s) Trío genoma/
exoma
preferido
Negativo
Microarreglo
Investigación:
Descubrimiento de genes
Exoma/genoma:
Negativo
Figura 1 Algoritmo de pruebas genéticas moleculares. * Esta sugerencia se basa en el estudio de Shashi et al.2
Prueba de gen único Panel de genes Secuenciación exómica
Nivel de
fenotipo
Desórdenes genéticos heterógeneos
Nivel de gen
Características específicas apuntan a
un trastorno asociado a un gen
Genes causantes de la enfermedad Genes asociados a la enfermedad bien definidos
Nivel de
variante No HI
Problemas
técnicos
Sanger tradicional: Estándar para
secuenciación
Menos VUS que la secuenciación exoma
Menos probabilidades de encontrar IFs
Necesita la confirmación de Sanger
Cobertura global mayor que la secuenciación exómica
Sanger completa con cobertura de 100%; ensayos complementarios
como matrices de genes dirigidas para detectar deleciones/
duplicaciones.
Características no específicas;
heterogeneidad extrema (por ej. , DI)
Todos los 20,000 genes con 4,600
genes médicamente bien definidos
Gran cantidad de VUS
Potencial para encontrar IFs
Necesita la confirmación de Sanger
La cobertura se ve comprometida.
Ningún Sanger completa
DI, discapacidad intelectual; HI, hallazgo incidental; NGS, secuenciación de próxima generación; VUS, variantes de importancia desconocida.eneticsmedicine
GENÉTICA en MEDICINA | Volumen 17 | Número 6 | Junio de 2015
Tabla 2 Comparación entre un solo gen, panel de genes y pruebas de ES
VUS mínimo

5. 448
XUE et al | Resolver el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos.REVISIÓN
está obligado a reducir el costo y acortar tanto la secuenciación
como el tiempo de informe, al tiempo que aumenta
simultáneamente el rendimiento analítico. Además, dado que los
resultados negativos de una prueba tan exhaustiva son más
definitivos, los ensayos médicos de ES también sirven como una
valiosa herramienta de descubrimiento de genes; es decir, los
laboratorios de investigación pueden buscar mutaciones en los
genes restantes que actualmente no están asociados con
enfermedades (ver algoritmo de prueba, Figura 1, para más
detalles). Es importante tener en cuenta que con nuevos
descubrimientos y asociaciones de genes-enfermedades que salen a
la luz rápidamente, la lista de objetivos de genes relevantes para la
enfermedad crecerá, y el ensayo deberá actualizarse periódicamente.
Recientemente se lanzó un gran esfuerzo para diseñar un ensayo de
exoma médico como una colaboración entre múltiples laboratorios
de diagnóstico clínico (M.R.H., datos no publicados y A.B. Santani
et al., Comunicación personal).
PANEL DE GENES VERSUS ES
Uno puede cuestionar la necesidad de las pruebas de panel de genes
en la era NGS. ¿Por qué los médicos no solo seleccionan ES, dado
que cubre las regiones de codificación? Se han publicado informes
sobre limitaciones y desafíos en la aplicación clínica de ES, incluidos
algunos que mostraron la probabilidad de que en este enfoque
falten variantes y diagnósticos11,12. Desde perspectivas técnicas
y de presentación de informes, existen diferencias significativas
entre estas dos pruebas basadas en NGS ( Tabla 2).
Paneles genéticos dirigidos basados en NGS combinados
con métodos complementarios proporcionan un enfoque
integral y factible para el diagnóstico genético
Actualmente, los ES que usan kits disponibles en el mercado
seleccionan ~92% del exoma, y después de la secuencia, la cobertura
disminuye a ~80-85%, lo que produce la deserción de varios exones
críticos en genes asociados a la enfermedad. Los paneles de genes
dirigidos típicamente cubren todos los exones de los genes incluidos
en los paneles y pueden complementarse con otras pruebas, como el
análisis de eliminación/duplicación. Por lo tanto, aunque se puede
pensar que ES es una prueba de detección, las pruebas de panel
dirigidas de múltiples genes son un diagnóstico de enfermedad
verdaderamente comprehensivo o una prueba de descarte, con la
advertencia de que pueden ocurrir mutaciones patógenas fuera de los
exones. En la búsqueda de un diagnóstico, ser capaz de descartar
genes y enfermedades puede ser útil (ver Recuadro 1, Caso 2). Sin
embargo, una prueba de panel de genes basada en NGS no es una
prueba de diagnóstico independiente desde una perspectiva técnica.
Las pruebas de panel clínicas ofrecidas a veces se complementan con
la secuenciación de Sanger para rellenar exones de baja cobertura y
sin cobertura y para confirmar las variantes detectadas por NGS, pero
a menudo se complementan con aCGH para detectar
simultáneamente cambios en el número de copias del nivel de exón
en genes dirigidos. Aunque las contribuciones de este tipo de cambios
pueden ser bajas para la mayoría de las enfermedades de un solo gen,
ayudan a descartar el(los) gen(es) y pueden proporcionar un
diagnóstico. Complementar las pruebas de NGS con la secuencia de
Sanger es inevitable, al menos con las actuales tecnologías de captura
y secuenciación de objetivos, que sistemáticamente no amplifican
ciertas regiones debido a varios factores que incluyen homología de
secuencia con pseudogenes,13,14 contenido rico en GC,15,16 regiones
altamente repetitivas y otras complejidades de secuencia. La
secuenciación de Sanger también se puede usar para "completar"
datos faltantes de bases o regiones que son compatibles con un
número insuficiente de lecturas para llamar a las variantes con
confianza. Se genera una lista proactiva de estas regiones con paneles
de genes NGS para garantizar la cobertura total de las regiones de
interés.17 Tenga en cuenta que dicho relleno solo es factible para
pruebas de panel porque la proporción de regiones problemáticas
aumenta significativamente a medida que se secuencian más bases
por ES.
A diferencia de las pruebas de panel genético, ES se ve
comprometida por la cobertura, dada la gran cantidad de la región
objetivo (62 Mb, 1-2% del genoma). Aunque se ha descubierto que la
expansión de un panel específico al incluir más genes relacionados
con la enfermedad mejora el rendimiento diagnóstico de los paneles
de NGS para ciertas enfermedades, la ES tiene una sensibilidad
clínica significativamente menor y una tasa de falsos negativos más
alta. Se estima que un promedio del 10% de todo el exoma carece de
una cobertura aceptable de 20×. Una comparación de nivel de
nucleótidos de cobertura de lectura para varias variantes patógenas
conocidas en genes de trastorno neuromuscular indicó que hasta un
11-18% de las mutaciones carecerían de la cobertura de 20×
recomendada por ES, lo que daría lugar a falsos negativos (A. Ankala
et al., datos no publicados). Además, un análisis en todo el exón de la
homología por la presencia de pseudogenes o pseudoexones indicó
que 3.000 genes tienen al menos un exón que tiene un pseudoexón
con homología de secuencia que varía de 97 a 100%. El análisis de
tales regiones puede dar falsos positivos, como se discutió en otra
parte.14 Por el contrario, el relleno Sanger complementario de estas
regiones genómicas refractarias a NGS confiere una alta sensibilidad
clínica y especificidad en las pruebas de panel. Los estudios sugieren
que los genes interrogados a través de pruebas de panel tienen una
cobertura de cuatro a cinco veces mayor que ES.
Debido a las limitaciones de la tecnología, la tasa de falsos positivos
para NGS, especialmente para inserciones y deleciones, sigue siendo
muy alta, lo que requiere un segundo método para confirmar
cualquier hallazgo de NGS. La secuenciación de Sanger todavía es
considerada la prueba estándar para la secuenciación. Se informa que
las tasas de falsos positivos en las pruebas de NGS oscilan entre 14 y
27%.8,16,17 Estas llamadas de secuencia generalmente tienen fracciones
de alelos desiguales, puntajes de mapeo deficientes o datos de
secuencia que indican una alineación subóptima a la secuencia de
referencia.8 Por lo tanto, es necesario un segundo método para
eliminar los falsos positivos, mientras que todas las variantes
notificables con posible significado clínico deben verificarse antes de
informar. El proceso de confirmación puede ser muy engorroso
cuando se necesita confirmar un gran número de variantes nuevas,
como en el caso de ES. Como han informado muchos estudios, la
confirmación de Sanger representa la mayor parte del tiempo de
respuesta, lo que no es práctico ni rentable para los laboratorios
clínicos.
Desafíos significativos con la interpretación e informes de
variantes
El mayor obstáculo para la aplicación clínica de rutina de las
pruebas de NGS es la interpretación de la gran cantidad de
variantes de secuenciación. Dependiendo del tipo de conjunto de
enriquecimiento del exoma utilizado, el número de variantes varía
entre 20,000 y 50,000 por exoma.7 Incluso después de la
aplicación de varios parámetros de análisis y filtros
bioinformáticos, al menos 150 a 500 variantes privadas no
sinónimas o de sitio de empalme son preseleccionadas comoenetics
medicine

6. 449
Resolviendo el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos | XUE et al
REVISIÓN
posibles variantes patógenas en cada caso de SE. La interpretación y
el informe de estas variantes en el contexto del fenotipo del paciente
es una tarea enorme para los laboratorios de diagnóstico clínico.
Nuestra capacidad actual para analizar e interpretar eficientemente la
información colectiva no está a la par con nuestras capacidades de
secuenciación.
Ambas bases de datos públicas y disponibles
comercialmente son importantes para evaluar la patogenicidad
de las variantes. Sin embargo, la información de estas fuentes
y la literatura publicada puede contener información ambigua e
insuficiente que, si no se evalúa cuidadosamente, puede llevar a
una sobrevaloración de la patogenicidad, causando un diagnóstico
incorrecto. De hecho, un estudio que involucró una cohorte de
1,000 individuos encontró que 221 variantes únicas observadas en
566 instancias independientes, todas las cuales habían sido
clasificadas como causantes de enfermedad en la Base de Datos de
Mutación Humana de Gen, eran de hecho benignas o VUS basadas
en la evidencia reportada.18 Un estudio de Xue et al.19 encontró
que los individuos sanos portan 40-110 variantes clasificadas por
la base de datos de mutaciones génicas humanas como mutaciones
que causan enfermedades. Recientes proyectos de secuenciación y
genotipado a gran escala han revelado un número
sorprendentemente grande de variantes de pérdida de función -
que tradicionalmente se han considerado en el contexto de la
enfermedad mendeliana grave- en los genomas de individuos
aparentemente sanos.20 Los criterios de clasificación de variantes
recientemente publicados (2014) del American College of
Medical Genetics and Genomics (ACMG) enumeran los estudios
funcionales como uno de los componentes más importantes para
la clasificación de variantes. Sin embargo, los estudios funcionales
deben evaluarse cuidadosamente, especialmente cuando se usa una
sola enzima viral o bacteriana para estudiar el proteoma humano
funcionalmente diverso. Por lo tanto, es importante reconocer que
las predicciones experimentales, al igual que las predicciones
computacionales, son informativas pero a menudo no definitivas.
Todos estos puntos enfatizan la complejidad de la interpretación
de la variante y la necesidad de mejorar la anotación de los alelos
de la enfermedad tanto en las bases de datos de mutaciones como
en la literatura primaria.
Un punto importante a considerar es el tremendo aumento
de VUS revelado en las pruebas basadas en NGS, especialmente
para las variantes sin sentido novedosas y raras. Es razonable
decir que ES genera considerablemente más VUS que un panel
de genes. Incluso con la ayuda de bases de datos variantes y la
literatura, la gran mayoría de las variantes de secuencia se
clasifican como VUS. La clasificación de VUS se considera si la
variante nunca se ha informado en ninguna de las bases de
datos y no es del tipo con una clara patogenicidad (es decir,
desplazamiento del marco, codón de parada o mutaciones del
sitio de empalme). El análisis adicional, como los estudios de
los padres para ayudar con la clasificación, está garantizado para
VUS. Sin embargo, el límite entre mutaciones verdaderas y
variantes raras que no causan enfermedades a menudo sigue
siendo difícil de alcanzar. Incluso si se encuentra una variante
aparentemente patógena en un individuo afectado con un raro
trastorno mendeliano, puede no ser una enfermedad, ya que
puede ser una variante rara única de esa única familia. Con
más individuos de diferentes grupos étnicos secuenciados a través
de NGS, inevitablemente se revelarán variantes más raras. En la
mayoría de los laboratorios clínicos, los VUS se incluyen en el
informe de un paciente, aunque la notificación de VUS tiene una
utilidad clínica limitada porque la relevancia clínica de la VUS no es
directa. La mayoría de los médicos no tomarán ninguna medida
basada únicamente en una variante clasificada como VUS. Sin
embargo, si el fenotipo asociado con mutaciones en el gen es similar
al del paciente, entonces las pruebas de diagnóstico adicionales
(como enzimáticas o metabolicas) pueden ser útiles, cuando estén
disponibles. Aunque de utilidad limitada en el momento, la
reclasificación de un VUS a patógeno puede ocurrir en el futuro a
medida que haya más información disponible. Ocasionalmente, estas
variantes se usan como mutaciones candidatas con fines de
investigación. Además, generalmente no se recomienda realizar
pruebas y reportar VUS en un entorno de diagnóstico prenatal con
fines predictivos, ya que puede conducir a un aborto indebido.
Otro desafío al realizar una secuenciación a gran escala, como ES
o GS, es el potencial para detectar hallazgos incidentales (IF). Las
IF se definen como hallazgos no relacionados con la indicación para
obtener la prueba de secuencia, pero que son de valor médico para la
atención del paciente. La tasa de IF notificable puede oscilar entre 1
y 8,8%, dependiendo de la calidad de la secuencia, la selección de
variantes, la cohorte de sujetos y si el laboratorio está utilizando la
lista de genes recomendada por el Grupo de trabajo ACMG.21,22 A
menudo se incluyen para análisis ES o GS a miembros de la familia
no afectados con objeto de detectar cambios de novo en el
probando; por lo tanto, las IF también tienen implicaciones para
estos miembros de la familia no afectados. Determinar si, cuáles y
cómo se devuelven las IF al paciente es cada vez más importante y
controvertido. Por ejemplo, ha habido un debate sobre si informar
las mutaciones asociadas con afecciones de inicio tardío (por
ejemplo, cáncer de mama) en un niño evaluado. Desde el punto de
vista del médico, no es una simple tarea aconsejar a los pacientes y
sus familias antes o después de las pruebas con respecto a los
hallazgos de IF. Actualmente, todavía hay una falta de consenso
sobre qué se debe devolver a los pacientes que lo reciben (o si
incluso se requiere consentimiento) y cómo se deben manejar. Hay
estudios en curso para ayudar a resolver estos problemas. El
Consorcio de Investigación Exploratoria de Secuenciación Clínica
estableció los criterios preliminares para la identificación de genes
procesables.21,23,24 La pregunta clave es, ¿qué tipo de IF beneficiarían
al probando y a los familiares del probando sin agregar una carga
innecesaria a la familia? Las cuestiones relacionadas con la salud
bioética, económica y los resultados informados por los pacientes y
los resultados psicosociales definitivamente deben considerarse.
También es de esperar que ES identifique todo tipo de otras
variantes, como el estado del portador para trastornos autosómicos
recesivos y variantes farmacogenéticas. Se recomienda que los
laboratorios tengan políticas específicas con respecto a estos
problemas en el lugar cuando se realizan las pruebas clínicas de ES.
Se sugiere un proceso de consentimiento informado en el
asesoramiento genético previo a la prueba para alertar al paciente
sobre la posibilidad de dichos resultados, así como sobre los criterios
para lo que se informa. Se ha implementado una estrategia de
informes que utiliza informes enfocados para variantes relacionadas
con fenotipos, mutaciones médicamente procesables, estado de
portador y variantes farmacogenéticas e informes ampliados para
variantes deletéreas o VUS no relacionadas con el fenotipo de la
enfermedad.8 Inmediatamente después de la reunión anual de
ACMG 2014, la Junta Directiva del ACMG recomendó que los eneticsmedicine
GENÉTICA en MEDICINA | Volumen 17 | Número 6 | Junio de 2015

7. 450
XUE et al | Resolver el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos.REVISIÓN
pacientes tengan la oportunidad de optar por no recibir IF como
parte del proceso de consentimiento informado. Para complicar aún
más este paisaje, como se mencionó anteriormente, las pruebas ES o
GS no se pueden optimizar para la cobertura de variantes asociadas
con estos IF. Además, todas las variantes notificables de pruebas
basadas en NGS deben validarse a través de otro método. Los
números de VUS e IF encontrados en ES aumentan drásticamente la
carga de trabajo en los laboratorios clínicos, lo que genera problemas
de tiempo y costo de respuesta. Las pruebas de los paneles de genes
específicos de la enfermedad pueden evitar o reducir
significativamente los problemas de las IF; los pacientes no recibirán
ninguna IF con un panel específico porque solo se analizan los genes
relevantes para el fenotipo.
PRUEBA DEL ALGORITMO
Aquí, proponemos un algoritmo de prueba molecular para elegir
entre un análisis dirigido, análisis de panel genético y ES (Figura 1).
Este algoritmo es una modificación del propuesto en el estudio de
Shashi et al.2 Este algoritmo de prueba puede ayudar a aumentar la
sensibilidad clínica de las pruebas moleculares y reducir el costo y el
tiempo de la prueba en general para el diagnóstico de los pacientes.
En nuestra opinión, las pruebas de panel genético a través de NGS
son un componente crítico de la estrategia de prueba por los motivos
enumerados anteriormente. Como se discutió, una evaluación clínica
exhaustiva es el paso clave para elegir qué prueba genética es la mejor
para el paciente. A través del análisis específico (prueba de gen único,
análisis de repetición de triplete y análisis de metilación),
aproximadamente la mitad de todos los pacientes en clínicas
genéticas reciben un diagnóstico en su primera o segunda visita2. Si
se trata de heterogeneidad genética, un panel de genes es mucho más
útil en casos como los que involucran trastornos neuromusculares,
displasias esqueléticas, ciliopatías o pérdida de la audición. Los
fenotipos de estos trastornos son distintivos, especialmente a una
edad temprana. A menudo, los resultados de ensayos radiográficos y/
o bioquímicos ayudarán a reducir el número de genes candidatos y
facilitarán la interpretación de la variante. Además, se sabe que un
número finito de genes causa estos trastornos de acuerdo con el
conocimiento disponible en ese momento. Las variantes generadas a
través de estos paneles relacionados con la enfermedad son
interpretables.
Sin embargo, para casos como el autismo y la ID, una
microarrays cromosómica más una prueba de X frágil seguida por
ES puede ser la ruta de diagnóstico molecular más apropiada.
Estos trastornos tienen una gran heterogeneidad genética, y se
estima que las mutaciones en más de 1.000 genes diferentes
pueden causar ID.25. Es importante destacar que las mutaciones de
novo representan una causa importante de ID. A través de GS, el
grupo Gilissen26 alcanzó un estimado acumulativo (incluido ES)
del 62% del diagnóstico genético concluyente, de los cuales el 60%
se debió a eventos de novo. Ocho casos en el estudio de Gilissen et
al.26 son variantes estructurales de novo identificadas a través de
GS que no pueden ser recogidas por microarrays. Por lo tanto, ES/
GS con pruebas de tríos (incluidos los padres) debe ser el enfoque
preferido para la identificación después de pruebas de primer
nivel, como microarrays y pruebas de X frágiles, retornadas con
resultados negativos. Además, los pacientes con resultados ES
negativos realmente proporcionan un gran recurso para la
investigación, como la detección de genes si se sospechan
trastornos mendelianos y se puede obtener el consentimiento.
RESUMEN
Actualmente, se dispone de una variedad de pruebas de diagnóstico
molecular porque la tecnología NGS ha entrado en el campo del
diagnóstico clínico, incluidas pruebas de un solo gen, pruebas de
panel genético, ES y GS. Como resultado, los médicos encargados se
enfrentan al acertijo de elegir la mejor herramienta de diagnóstico
para pacientes con presuntas condiciones genéticas. Las pruebas de
un solo gen tienen valor para situaciones en las que hay
características clínicas distintivas y una heterogeneidad mínima de
locus. La prueba del panel de genes es más costo-efectiva que un
enfoque de un solo gen para los trastornos en los que el diagnóstico
clínico es difícil o hay múltiples genes implicados. ES y GS tienen la
ventaja de ser menos sesgadas con respecto a qué conjunto de genes
probar, a diferencia de la secuenciación dirigida, que presupone que
las anomalías de relevancia clínica se confirman en el panel de genes.
Sin embargo, las limitaciones técnicas de NGS y las dificultades de
interpretación y presentación de informes relacionadas con ES y GS
hacen que estos enfoques sean difíciles y altamente complejos. Los
factores de riesgo no relacionados con la condición del paciente en
los exámenes ES y GS complican aún más el panorama. Además,
actualmente se requiere la secuenciación de aCGH y Sanger para
complementar las deficiencias de NGS para detectar todo el espectro
de mutaciones y validar los hallazgos de NGS. Por lo tanto, es crucial
que los médicos comprendan las diferencias y dificultades en cuanto
a las tecnologías, la interpretación de las pruebas, la importancia
clínica y los problemas éticos, ya que son responsables en última
instancia de ordenar y comunicar los resultados de las pruebas a los
pacientes. Nuestro algoritmo de prueba puede dar a los médicos
ideas que ayudarán a resolver el enigma de las pruebas moleculares.
PERSPECTIVAS
A medida que la tecnología continúa mejorando, las pruebas basadas
en NGS pueden convertirse en independientes, sin la necesidad de
confirmación a través de un segundo método. El cien por ciento de
concordancia de la detección de variante entre Sanger y NGS se ha
logrado en estudios recientes cuando se aplicaron ciertos
criterios.27,28 La tecnología de secuenciación de "tercera generación"
con lecturas más largas tiene el potencial de detectar trastornos de
expansión repetida de trinucleótidos y ofrecerá una mayor solución
integral para el diagnóstico molecular. GS, que evita cualquier sesgo
de captura y tiene aún más cobertura, es probable que sustituya
cualquier forma de secuencia con captura. Los cambios de número
de copia y las variantes que se encuentran en regiones que no
codifican pueden ser detectados por GS. Esto ya se ha utilizado con
gran éxito en entornos específicos para aclarar el diagnóstico
molecular e incluso para guiar la terapia29-31. Es probable que en
un futuro próximo, un único flujo de trabajo de laboratorio
simplificado sustituya a la mayoría de las otras pruebas de
secuenciación porque los precios de secuencia siguen
disminuyendo como se predijo. La única diferencia para cada
paciente sería el conjunto de genes analizados apropiados para
la indicación clínica específica. La secuenciación del genoma
puede ser una prueba genética de una sola vez que proporcionaría la
base para un seguimiento de por vida. El reanálisis periódico y la
interpretación de los datos de GS basados en la condición del
paciente y el conocimiento actualizado seguramente serán de
progresión inevitable. La era de la medicina genómica ha
comenzado y ofrece tremendas oportunidades y desafíos a las
antiguas normas de la práctica médica. No obstante, problemasenetics
medicine

8. 451
Resolviendo el enigma de las pruebas de diagnóstico molecular para los trastornos mendelianos | XUE et al
REVISIÓN
tales como la falta de conocimiento sobre la interpretación de las
variantes, el desacuerdo sobre la liberación de IF, la alta demanda de
almacenamiento de datos, los procedimientos inadecuados de
consentimiento informado para las pruebas genéticas, y una mano de
obra limitada de genetistas clínicos y asesores genéticos deben
abordarse antes de que nos demos cuenta de todo el potencial de esta
emocionante tecnología.
REVELACIÓN
Y.X., A.A. y M.R.H. trabajan para un laboratorio de diagnóstico sin
fines de lucro. W.R.W. declara no tener conflicto de intereses.efere
ces
1. Saunders CJ, Miller NA, Soden SE, et al. Rapid whole-genome sequencing
for genetic disease diagnosis in neonatal intensive care units. Sci Transl Med
2012;4:154ra135.
2. Shashi V, McConkie-Rosell A, Rosell B, et al. The utility of the traditional medical
genetics diagnostic evaluation in the context of next-generation sequencing for
undiagnosed genetic disorders. Genet Med 2014;16:176–182.
3. South ST, Lee C, Lamb AN, Higgins AW, Kearney HM; Working Group for
the American College of Medical Genetics and Genomics Laboratory Quality
Assurance Committee. ACMG Standards and Guidelines for constitutional
cytogenomic microarray analysis, including postnatal and prenatal applications:
revision 2013. Genet Med 2013;15:901–909.
4. Xue Y, Sun A, Mekikian P, et al. FGFR3 mutation frequency in 324 cases from the
international skeletal dysplasia registry. Mol Genet & Genom Med, in press.
5. Piton A, Redin C, Mandel JL. XLID-causing mutations and associated genes
challenged in light of data from large-scale human exome sequencing. Am J
Hum Genet 2013;93:368–383.
6. Gilissen C, Hoischen A, Brunner HG, Veltman JA. Unlocking Mendelian disease
using exome sequencing. Genome 2011;11:64.
7. Gilissen C, Hoischen A, Brunner HG, Veltman JA. Disease gene identification
strategies for exome sequencing. Eur J Hum Genet 2012;20:490–497.
8. Yang Y, Muzny DM, Reid JG, et al. Clinical whole-exome sequencing for
the diagnosis of mendelian disorders. N Engl J Med 2013;369:1502–1511.
9. Need AC, Shashi V, Hitomi Y, et al. Clinical application of exome sequencing in
undiagnosed genetic conditions. J Med Genet 2012;49:353–361.
10. Hennekam RC, Biesecker LG. Next-generation sequencing demands next-
generation phenotyping. Hum Mutat 2012;33:884–886.
11. Bloch-Zupan A, Jamet X, Etard C, et al. Homozygosity mapping and candidate
prioritization identify mutations, missed by whole-exome sequencing, in
SMOC2, causing major dental developmental defects. Am J Hum Genet
2011;89:773–781.
12. Eisenberger T, Neuhaus C, Khan AO, et al. Increasing the yield in targeted
next-generation sequencing by implicating CNV analysis, non-coding exons
and the overall variant load: the example of retinal dystrophies. PLoS ONE
2013;8:e78496.
13. Coonrod EM, Durtschi JD, Margraf RL, Voelkerding KV. Developing genome
and exome sequencing for candidate gene identification in inherited disorders:
an integrated technical and bioinformatics approach. Arch Pathol Lab Med
2013;137:415–433.
14. Mueller PW, Lyons J, Kerr G, Haase CP, Isett RB. Standard enrichment methods
for targeted next-generation sequencing in high-repeat genomic regions.
Genet Med 2013;15:910–911.
15. Shen P, Wang W, Krishnakumar S, et al. High-quality DNA sequence capture
of 524 disease candidate genes. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:6549–
6554.
16. Valencia CA, Ankala A, Rhodenizer D, et al. Comprehensive mutation analysis
for congenital muscular dystrophy: a clinical PCR-based enrichment and next-
generation sequencing panel. PLoS ONE 2013;8:e53083.
17. Jones MA, Rhodenizer D, da Silva C, et al. Molecular diagnostic testing for
congenital disorders of glycosylation (CDG): detection rate for single gene
testing and next generation sequencing panel testing. Mol Genet Metab
2013;110:78–85.
18. Dorschner MO, Amendola LM, Turner EH, et al.; National Heart, Lung, and
Blood Institute Grand Opportunity Exome Sequencing Project. Actionable,
pathogenic incidental findings in 1,000 participants’ exomes. Am J Hum Genet
2013;93:631–640.
19. Xue Y, Chen Y, Ayub Q, et al.; 1000 Genomes Project Consortium. Deleterious-
and disease-allele prevalence in healthy individuals: insights from current
predictions, mutation databases, and population-scale resequencing. Am J
Hum Genet 2012;91:1022–1032.
20. MacArthur DG, Balasubramanian S, Frankish A, et al.; 1000 Genomes Project
Consortium. A systematic survey of loss-of-function variants in human protein-
coding genes. Science 2012;335:823–828.
21. Berg JS, Amendola LM, Eng C, et al.; Members of the CSER Actionability
and Return of Results Working Group. Processes and preliminary outputs for
identification of actionable genes as incidental findings in genomic sequence
data in the Clinical Sequencing Exploratory Research Consortium. Genet Med
2013;15:860–867.
22. Lawrence L, Sincan M, Markello T, et al. The implications of familial incidental
findings from exome sequencing: the NIH Undiagnosed Diseases Program
experience. Genet Med 2014; e-pub ahead of print 1 May 2014.
23. Berg JS, Adams M, Nassar N, et al. An informatics approach to analyzing the
incidentalome. Genet Med 2013;15:36–44.
24. Goddard KA, Whitlock EP, Berg JS, et al. Description and pilot results from a
novel method for evaluating return of incidental findings from next-generation
sequencing technologies. Genet Med 2013;15:721–728.
25. van Bokhoven H. Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.
Annu Rev Genet 2011;45:81–104.
26. Gilissen C, Hehir-Kwa JY, Thung DT, et al. Genome sequencing identifies major
causes of severe intellectual disability. Nature 2014;511:344–347.
27. Sikkema-Raddatz B, Johansson LF, de Boer EN, et al. Targeted next-generation
sequencing can replace Sanger sequencing in clinical diagnostics. Hum Mutat
2013;34:1035–1042.
28. Strom SP, Lee H, Das K, et al. Assessing the necessity of confirmatory testing for
exome-sequencing results in a clinical molecular diagnostic laboratory. Genet
Med 2014;16:510–515.
29. Welch JS, Link DC. Genomics of AML: clinical applications of next-generation
sequencing. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011;2011:30–35.
30. Welch JS, Westervelt P, Ding L, et al. Use of whole-genome sequencing to
diagnose a cryptic fusion oncogene. JAMA 2011;305:1577–1584.
31. Worthey EA, Mayer AN, Syverson GD, et al. Making a definitive diagnosis:
successful clinical application of whole exome sequencing in a child with
intractable inflammatory bowel disease. Genet Med 2011;13:255–262.
32. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus
statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr
1998;132:589–595.
33. Scriver CR. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8th edn.
McGraw-Hill: New York, 2001:1667–1724.
34. Warren ST, Sherman SL. The fragile X syndrome. In: Scriver CR, Beaudet AL,
Sly WS, Valle D (eds). The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease ,
8th edn. McGraw-Hill: New York, 2001:1257–1289.
35. Glenn CC, Driscoll DJ, Yang TP, Nicholls RD. Genomic imprinting: potential
function and mechanisms revealed by the Prader-Willi and Angelman
syndromes. Mol Hum Reprod 1997;3:321–332.
36. Mook OR, Haagmans MA, Soucy JF, et al. Targeted sequence capture and
GS-FLX Titanium sequencing of 23 hypertrophic and dilated cardiomyopathy
genes: implementation into diagnostics. J Med Genet 2013;50:
614–626.
37. Lemke JR, Riesch E, Scheurenbrand T, et al. Targeted next generation sequencing
as a diagnostic tool in epileptic disorders. Epilepsia 2012;53:1387–1398.
38. Lepri FR, Scavelli R, Digilio MC, et al. Diagnosis of Noonan syndrome and
related disorders using target next generation sequencing. BMC Med Genet
2014;15:14.
39. Ku CS, Polychronakos C, Tan EK, et al. A new paradigm emerges from the
study of de novo mutations in the context of neurodevelopmental disease. Mol
Psychiatry 2013;18:141–153.
40. Cullinane AR, Vilboux T, O’Brien K, et al.; NISC Comparative Sequencing
Program. Homozygosity mapping and whole-exome sequencing to detect
SLC45A2 and G6PC3 mutations in a single patient with oculocutaneous
albinism and neutropenia. J Invest Dermatol 2011;131:2017–2025.
41. Zaidi S, Choi M, Wakimoto H, et al. De novo mutations in histone-modifying
genes in congenital heart disease. Nature 2013;498:220–223.
42. Choi M, Scholl UI, Ji W, et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and
massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:19096–
19101.
43. Majewski J, Wang Z, Lopez I, et al. A new ocular phenotype associated with an
unexpected but known systemic disorder and mutation: novel use of genomic
diagnostics and exome sequencing. J Med Genet 2011;48:593–596.eneticsmedicine
GENÉTICA en MEDICINA | Volumen 17 | Número 6 | Junio de 2015