marcadores biomoleculares de cancer de pulmon

Biomarcadores moleculares y genómica
en el cáncer de pulmón
Javier de Castro Carpeño

RECOMENDABLE

RUTINARIO

Determinación de mutaciones
de EGFR

Determinación de EML4-ALK

EVIDENCIA
INSUFICIENTE
• Receptores de factores
de crecimiento y sus sistemas
de señalización intracelular:
- Otras metodologías
de determinación de la expresión
de EGFR (IHQ, FISH)
- Mutaciones de K-Ras
- Alteraciones en otras vías
PI3K/AKT, RAF, etc.
• Farmacogenómica:
- ERCC1, RRM1 y 2, BRCA1
- MKP-1, CHOK, EPOR
• Marcadores de angiogénesis
VEGF, moléculas de adhesión
(ICAM)
• Otros marcadores:
- p53, factor angiogénico VIII,
CD44, pRb, bcl-2, glutatiónS-transferasa, hMLH1 y 2
• Perfiles de expresión génica
microarray
• Perfiles de expresión de proteínas

En casos seleccionados.
(1) Otros factores pronósticos seleccionados: tipos histológicos.

BIOMARCADORES RUTINARIOS
En la actualidad, la presencia de mutaciones de EGFR puede considerarse crucial en un subgrupo de
pacientes con cáncer de pulmón no microcítico. Cuando estas mutaciones EGFR están presentes, el
comportamiento clínico del tumor y, sobre todo, la respuesta terapéutica a los inhibidores tirosincinasa de EGFR, dan lugar a una supervivencia que sobrepasa los dos años de mediana frente a menos
de doce meses del cáncer de pulmón convencional.

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Marcadores moleculares y Genómica en Oncología

Determinación de mutaciones de EGFR
EGFR es uno de los miembros de la familia de receptores de membrana con actividad tirosincinasa conocidos de forma global como ErbB. La activación de este receptor supone tanto un beneficio de proliferación como un importante freno a la apoptosis, pues implica rutas oncogénicas, tales como MAPK y
PI3K/Akt/PTEN/mTOR. Por ello, no es de extrañar que sea una de las principales dianas para su bloqueo
farmacológico. Este bloqueo dependerá del modelo de activación del receptor, ya sea por exceso de ligando, por exceso del propio receptor o por activación constitutiva debido a mutaciones del dominio intracelular que permiten la señalización en ausencia de ligando o de pareja de dimerización. En ese sentido, la sobreexpresión y las mutaciones del receptor (1) son los modelos de activación que mayor interés
diagnóstico han despertado en los pacientes con carcinoma no microcítico de pulmón (CPNM). Este interés se ha suscitado tanto por la disponibilidad de fármacos frente a esta diana como por la controversia
generada para garantizar la máxima fiabilidad en su identificación.
Así, numerosos estudios han evaluado el valor de diferentes técnicas, como la inmunohistoquímica, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación fluorescente in situ (FISH) para la identificación
de EGFR. La validez y aplicabilidad de estos procedimientos ha sido controvertida, ya que muchos estudios han sido retrospectivos y sin un grupo control para comparar. La estimación del valor predictivo positivo de la inmunohistoquímica, PCR y FISH ha sido del 6,5% al 82%, del 7% al 100% y del 11% al 89%,
respectivamente. A pesar de este inmenso rango, se ha publicado un metaanálisis que incluye a más de
5.000 pacientes, en el que se considera que los tres métodos pueden predecir una respuesta a gefitinib
(1). Por el contrario, tan sólo se dispone de un estudio que compare entre sí todos estos métodos para
predecir una respuesta, y se fundamenta en el tratamiento con erlotinib. En cualquier caso, la principal limitación de estas tecnologías es la hipótesis de partida, ya que la presencia de EGFR no supone, al menos a priori, una dependencia proliferativa de la célula que lo expresa. Además, cada una de estas tecnologías da información muy distinta sobre la diana, por lo que la conjugación de todas ellas limita en gran
medida la plausibilidad biológica que debería subyacer a cualquier metaanálisis de calidad.
A continuación se comentan las dos tecnologías con mayor valor teórico.
La FISH permite identificar, de forma simple y reproducible, el número de copias de un gen. Así, se ha encontrado una posible correlación entre el aumento del número de copias del gen EGFR contabilizadas
por FISH y la eficacia de los inhibidores de la tirosincinasa (1) a pesar de que está pendiente de demostrar in vivo que el aumento en el número de copias de EGFR implica un incremento en la señalización independiente de ligando, sobre todo con métodos enzimáticos.
La secuenciación de ADN, a través de variantes más o menos sofisticadas de la PCR, podría considerarse como el estándar en la identificación de secuencias predictoras de respuesta o resistencia a un fármaco. En este sentido, la eficacia de los inhibidores de la actividad tirosincinasa de EGFR se ha asociado
con la posibilidad de bloqueo de la vía de señalización aberrante que se pone en marcha por mutaciones
del receptor (2, 3, 4). La correlación entre la presencia de mutaciones de EGFR y la respuesta a gefitinib y
erlotinib ha quedado patente en estudios retrospectivos, con respuestas superiores al 65% y medianas
de supervivencia de 20 a 30 meses (5). Además, estudios prospectivos, que han empleado estos inhibidores en primera línea en pacientes con mutación, han confirmado estos resultados (6). En la actualidad,
el estudio español EURTAC está evaluando si el tratamiento con erlotinib produce un beneficio en la supervivencia libre de progresión frente a la quimioterapia, como tratamiento de primera línea, en pacientes
portadores de la mutación.
El estudio IPASS, realizado en pacientes asiáticos con un perfil clínico típico de adenocarcinoma y no fumador, ha demostrado que en los pacientes con mutación de EGFR, la administración de gefitinib es superior que la quimioterapia como tratamiento de primera línea en términos de supervivencia libre de progresión (7). Además, ha mostrado la mayor supervivencia de este subgrupo de enfermos portadores de

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INFORMACIÓN POR TUMORES

BIOMARCADORES MOLECULARES y GENóMICA EN EL CáNCER DE PULMóN
mutación EGFR. Este estudio ha permitido la indicación de gefitinib por la European Medicines Agency
(EMEA) para su administración en pacientes portadores de mutación EGFR.
De igual modo, el grupo español ha presentado el perfil clínico y evolutivo de más de 2.000 pacientes con
mutación EGFR (8). Se confirma el mejor pronóstico de los enfermos cuyos tumores tienen mutación y, a
pesar de que este tipo de pacientes suele entrar dentro del grupo de mujeres, con adenocarcinoma y no
fumadoras, hay un grupo significativo de pacientes que presenta otras características, por lo que los criterios clínicos no pueden reemplazar a la determinación de mutaciones.
Sin embargo, hoy se sabe que las mutaciones del exón 19 (pequeñas deleciones) y del 21 (mutaciones
puntuales que suponen una modificación en la secuencia proteica L858R) muestran una sensibilidad
diferente a los inhibidores de la tirosincinasa y que hay mutaciones en el exón 20 (T790M/L858R,
G719A y L861Q) que ofrecen una resistencia de novo o adquirida a los mismos. Además, el método
más común para detectar las mutaciones precisa de purificar el ADN de la muestra tumoral completa,
amplificar por PCR y secuenciar, con la limitación del tamaño dela muestra, habitualmente pequeña en
el CPNM. Por ello, se están desarrollando nuevos procedimientos que permitan una detección más
exacta, incluso con un material muy escaso, como el procedente de citologías por punción, esputo o
de líquido pleural (9). En este sentido, merece mención especial la detección de mutaciones en células
tumorales circulantes, que permite monitorizar la respuesta al tratamiento y predecir la progresión (10).
Dos estudios asiáticos que han comparado la administración de quimioterapia frente a inhibidores tirosinquinasa, en concreto gelitunib, como terapia de primera línea en pacientes con tumores EGFR mutados
han demostrado recientemente el impacto positivo en la supervivencia libre de progresión cuando se administra el inhibidor en primer lugar (11, 12). De igual modo, el estudio SATURN ha confirmado el beneficio con erlotinib como terapia de mantenimiento en la población EGFR mutada (13).
Recientemente, se ha publicado el resultado del tercer estudio realizado en la población asiática que ha
comparado la administración de quimioterapia frente a erlotinib en pacientes con tumores con mutaciones EGFR, confirmándose el beneficio en supervivencia libre de progresión del grupo tratado con erlotinib (14). Los resultados del estudio EURTAC, con un diseño similar al anterior, quimioterapia frente a erlotinib en pacientes con tumores portadores de mutaciones EGFR, han sido comunicados en ASCO de
2011 y están pendientes de publicación. De nuevo, existe un beneficio estadístico en supervivencia libre
de progresión cuando los enfermos son tratados con erlotinib frente a los que reciben inicialmente quimioterapia.
En resumen, los inhibidores de la actividad tirosincinasa de EGFR, como erlotinib (Tarceva®, OSI/Genentech, Boulder, CO/South San Francisco, California, EE. UU.) y gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Macclesfield, Reino Unido), pueden interferir la citada actividad y logran una tasa de respuesta objetiva del 10% al
27% en los pacientes con CPNM tras la progresión a quimioterapia. Este beneficio parece ser máximo en
los pacientes cuyas neoplasias son portadoras de mutaciones en los exones 19 y 21.

Métodos de medición
El estudio de mutaciones de EGFR deberá ser realizado en laboratorios que tengan una técnica homologada y reproducible para este procedimiento. Con el fin de obtener la máxima rentabilidad, dado el escaso material disponible, se deben aplicar las técnicas más sensibles para una mejor determinación de la
mutación de EGFR. En este sentido, existen diversas fases que son críticas para la excelencia en la determinación de las citadas mutaciones. En primer lugar, el material sobre el que se purificará el ADN tumoral debe ser evaluado por un patólogo experto que delimite la zona sobre la que se realizará la microdisección por láser, si está disponible, o la macrodisección sobre el portaobjetos donde está depositado
el corte de la pieza original. Si existe material suficiente, se debe realizar una tinción con hematoxilina-eosina en los cortes situados en los extremos del material para extracción, garantizando así que existe una
concentración similar en los cortes delimitados por ellos. En una segunda fase, debe garantizarse que la

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purificación del ADN es de suficiente calidad a través de los métodos estándares, evitando la secuenciación de smears o de ADN muy fragmentados, lo cual podría reducir la sensibilidad de la técnica. Además,
es necesaria la presencia de controles internos de calidad, así como grupos controles que garanticen la
existencia de la reacción. En relación con la metodología de PCR que se ha de emplear, es crítico el hecho de que se realice en centros con amplia experiencia en secuenciación automática, así como con dilatada experiencia en prestar servicio de secuenciación a centros externos. Por ello, se recomienda el
contacto directo con los distintos parques científicos nacionales o con los grupos con calidad contrastada en secuenciación automática, más allá de la selección aleatoria o fundamentada en la extrapolación
de prestigio desde campos ajenos a la misma. Además, se hace especial hincapié en la necesidad de la
extracción automatizada del ADN. Por último, tanto la PCR para hibridación de la secuencia problema,
como la necesaria para la secuenciación colorimétrica, deberían realizarse en el mismo centro, con lo que
se evitarían manipulaciones adicionales del material.
Actualmente se están desarrollando diversos anticuerpos monoclonales para la identificación de la mutación por técnicas de inmunohistoquímica. Los resultados preliminares confirman un buen rendimiento de
este procedimiento que, de confirmarse, permitirá facilitar la identificación de este tipo de pacientes.

RECOMENDACIÓN
Dados los últimos resultados, el análisis de mutaciones de EGFR se debería hacer en el mayor
número de pacientes posible. Ya que el problema en cáncer de pulmón es la presencia
de muestra tisular tumoral suficiente para la realización de la mutación, y aunque no hay un
consenso totalmente establecido, se recomienda la realización del análisis de mutaciones de
EGFR de forma sistematizada en los pacientes en los que se presume una mayor probabilidad de
encontrar dichas mutaciones, como son los enfermos que nunca han fumado o cuyos tumores
tienen una histología de carcinoma no escamoso o el género femenino.

BIOMARCADORES RECOMENDABLES
Determinación de EML4-ALK
El oncogen de fusión EML4-ALK fue descrito inicialmente en 2007 (15, 16) cuando se encontró una pequeña inversión dentro de una región del brazo corto del cromosoma 2 que daba lugar a una proteína quimérica con actividad tirosinquinasa y actividad oncogénica in vitro e in vivo. Esta proteína combinaba una parte del extremo N-terminal de la proteína “echinoderm microtubule-associated protein-like 4” (EML4) con el
dominio quinasa intracelular de la proteína “quinasa de linfoma anaplásico” (ALK) (17).
Además de EML44, ALK puede reordenarse con otras proteínas situadas en esa región del brazo corto
del cromosoma 2.
El reordenamiento de EML4-ALK es detectado mediante un procedimiento de FISH a través de una sonda
break apart.
Pronto se vio cómo EML4-ALK estaba presente en una pequeña proporción de pacientes con carcinoma
no microcítico de pulmón. En el primer estudio, 5 de 75 tumores de pulmón presentaban expresión de esta proteína, lo que suponía un 6,7% de incidencia. Estudios posteriores realizados mayoritariamente en
población asiática, con tumores potencialmente resecables y en estadios iniciales, detectaron el reordenamiento en una frecuencia inferior, del 1 al 4,9% (18, 19). Dado que en estos estudios se apuntaba un posible perfil clínico parecido al de los portadores de mutación EGFR, es decir, histología de adenocarcinoma
o ausencia de hábito tabáquico, se ha realizado el mayor estudio de detección sobre 141 pacientes que
debían reunir al menos dos de las características clínicas de adenocarcinoma, género femenino, historia
de ausencia de tabaquismo y raza asiática. En él, la frecuencia de mutación de EML4-ALK ha sido del

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13%, mientras que la de EGFR era del 22%. El perfil del paciente con mutación de EML4-ALK era de un
enfermo varón, más joven que los portadores de mutación EGFR y con ausencia de hábito tabáquico.
Además, 18 de los 19 pacientes con reordenamiento de EML4-ALK tenían un adenocarcinoma, con predominio del subtipo de células en anillo de sello. Por otra parte, no había diferencias en la respuesta a la
quimioterapia basada en platino si se comparaba con la población general (20). Además, se ha visto que
la presencia de mutación de ALK es mutuamente excluyente con la de EGFR o la de K-ras y que los pacientes portadores de mutación de ALK son resistentes a inhibidores tirosinquinasa de EGFR. Estos datos
clínicos son acordes con las observaciones preclínicas que mostraron mutación EML-ALK, en la línea celular H3122, resistente a erlotinib (18).
La importancia de la determinación de ALK radica en dos hechos: por una parte, en que estamos ante un
subgrupo de enfermos con cáncer de pulmón diferente en cuanto a origen y evolución tumoral. Por otra
parte, porque podrían ser tratados de una forma individualizada mediante inhibidores específicos de ALK.
PF-02341066 (actualmente denominado Crizotinib®, Pfizer) es un agente oral con capacidad de inhibición
dual de la actividad tirosinquinasa de ALK y del receptor MET/HGF que inicialmente demostró actividad
antitumoral en un ensayo fase I (21).
En octubre de 2010 se publicaron los primeros resultados con la experiencia de crizotinib en 82 pacientes
identificados con presencia de reordenamientos de ALK después de analizar muestras de,
aproximadamente, 1.500 pacientes (22). Se alcanzó una tasa de respuesta del 57% y un control de la
enfermedad en el 90%. Aunque sin datos de supervivencia, el 72% de los enfermos no había progresado
a los seis. Todos estos datos invitan a pensar en una gran eficacia terapéutica en estos grupos
seleccionados de enfermos. Por eso, actualmente se están realizando diferentes estudios en población
ALK positiva, uno comparativo frente a quimioterapia de segunda línea y otro en pacientes que ya han
progresado a las líneas habituales de tratamiento.

Para identificar los reordenamientos de ALK se realiza una técnica de FISH en muestras tumorales conservadas en parafina a través de una sonda break apart (Vysis LSI ALK Dual Color, Break
Apart Rearrangement Probe; Abbott Molecular, Abbott Park, IL).
Para definir una muestra como positiva, tiene que existir más de un 15% de células tumorales
con señales divididas, en una muestra de al menos 60 células.
Mediante inmunohistoquímica se pueden confirmar los resultados (anticuerpo monoclonal de ratón contra ALK [clone ALK1;DAKOUSA, Carpinteria, CA]).

RECOMENDACIÓN
Dados los interesantes resultados obtenidos, se recomienda la realización de la determinación
de reordenamientos de EML4-ALK en aquellos pacientes en los que se sospeche su existencia para
que puedan ser incluidos en los estudios actualmente en marcha con el agente inhibidor crizotinib.
Aunque la experiencia no es muy amplia por el momento, se recomienda realizar el estudio del
reordenamiento de ALK en pacientes con perfil clínico sugestivo, como enfermos no fumadores,
jóvenes o con histología de adenocarcinoma. Además, parece que las mutaciones de EGFR y de
KRAS son mutuamente excluyentes con las de ALK, por lo que en grupos en los que se ha
identificado una alteración molecular, el análisis de ALK no sería prioritario. Si se tiene en cuenta que
hasta el momento el estudio del reordenamiento de ALK se ha realizado en su mayor parte por
técnica de FISH y en tejido tumoral pero no en citología, se recomienda la máxima optimización de la
habitualmente escasa muestra tumoral a la hora de indicar análisis moleculares.

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BIOMARCADORES CON EVIDENCIA INSUFICIENTE
Receptores de factores de crecimiento y sus sistemas de señalización intracelular
• Otras metodologías de determinación de la expresión de EGFR (IHQ, FISH).
• Mutaciones de K-Ras.
• Alteraciones en otras vías PI3K/AKT, RAF, etc.
A pesar de la gran cantidad de estudios que han analizado diferentes receptores y vías de señalización oncogénica activadas, de todos ellos merece mención especial el valor predictivo y pronóstico
que puede aportar la determinación de la expresión de EGFR mediante la técnica de FISH.
En el análisis del subgrupo del ensayo BR.21, fue la expresión medida por FISH y no las mutaciones
de EGFR, la que predecía a la respuesta anti-EGFR (25).
Se han publicado datos que avalan el papel del FISH para predecir la respuesta a cetuximab, un anticuerpo monoclonal anti-EGFR (26). Más recientemente, se ha establecido un baremo de expresión inmunohistoquímica de EGFR con una correlación entre altos niveles de expresión y respuesta a cetuximab. Este procedimiento puede determinar en un futuro próximo la indicación de cetuximab en el
subgrupo de enfermos cuyos tumores tengan una alta expresión de EGFR (23).

Los estudios de FISH tienen el inconveniente de que no están disponibles en muchos centros y de
que precisan de sistemas de estandarización que marquen el número de copias del gen y el tipo
de anomalías genéticas. Aun así, es una tecnología muy reproducible y fácilmente implantable en la
mayoría de los centros. El entrenamiento que precisan los técnicos de Atención Primaria y los médicos especialistas en Anatomía Patológica, es muy inferior al necesario para la implantación de otras
tecnologías.
La técnica de inmunohistoquímica es de fácil realización y muy utilizada en patología, aunque el empleo de baremos o scores de expresión exige un entrenamiento mayor.

RECOMENDACIÓN
Actualmente, no se recomienda la determinación de otras técnicas para la expresión de EGFR en
sustitución de las mutaciones de EGFR a la hora de predecir la respuesta a inhibidores de la actividad tirosincinasa de EGFR.
Mutaciones de K-Ras
La activación de la vía mediada por Ras, especialmente a través de KRas, ocurre en un 30% de adenocarcinomas y en un 5% de carcinomas epidermoides (24). Además, la mutación que provoca la inactivación de NF1 RasGAP se describe en un 7% de CPCNP. Esta inactivación de NF1 RasGAP es
mutuamente excluyente con la de EGFR y provoca una estimulación de todas las isoformas de RAS,
aunque no se sabe si produce un efecto similar a los KRAS mutados o actúa más como mecanismo
de resistencia a los anti-EGFR.
Las mutaciones de KRAS en CPNM ocurren en los codones 12 y 13, y están asociadas al hábito tabáquico. Un metaanálisis con 28 estudios que evaluaron el papel de la mutación de KRas en CPNM demostraron un papel pronóstico negativo para todos los estudios (HR 1.30, P=.01) y de 1.52 (P=.02)
para los específicamente enfocados en el adenocarcinoma. A pesar de ello, muchos de estos trabajos
son retrospectivos, y el auténtico valor de las mutaciones de KRas como factor pronóstico y factor
predictivo de respuesta a la quimioterapia no ha podido ser completamente confirmado. Por el con-

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trario, la presencia de mutaciones de KRas sí se relaciona significativamente con la ausencia de mutaciones de EGFR y con la resistencia a los inhibidores tirosincinasa de EGFR.

RECOMENDACIÓN
Hasta el momento, la búsqueda de inhibidores específicos eficaces de KRas ha resultado infructuosa. Por eso, aunque la detección de mutaciones de KRas puede excluir razonablemente la existencia de mutaciones de EGFR o de ALK, su determinación no sería prioritaria, dada la escasez de
la muestra en CPCNP y la ausencia de un tratamiento específico eficaz.

Alteraciones en otras vías PI3K/AKT, RAF, etc.
A pesar de los avances realizados, actualmente solo se han podido identificar alteraciones moleculares en menos de un 50% de los CPNM. A excepción de la mutación de KRAS, la mayoría de mutaciones se han encontrado en una incidencia muy baja, inferior al 5%, y casi todas suelen ser mutuamente excluyentes.
Amplificación de MET
MET es el gen que codifica para el receptor del factor de crecimiento hepatocitario (HGFR) situado en
el cromosoma 7q21-q31. En series de pacientes no tratados con inhibidores EGFR, la presencia de
amplificación de MET se ha descrito entre el 1.4 y el 21% de CPNM. Esta variabilidad se debe a los
diferentes métodos de detección empleados. La amplificación de MET se ha descrito tanto en adenocarcinomas como en epidermoides, es independiente de la presencia de mutaciones de KRAS o de
amplificaciones de EGFR y puede ser oncogénica por sí misma. También, la amplificación de MET se
ha descrito en un 20% de los pacientes cuyos tumores tienen resistencia adquirida a los anti-EGFR.
Por el contrario, las mutaciones de MET son raras en CPNM.
Se están investigando diferentes inhibidores de MET, desde inhibidores de su actividad cinasa como
PF-02341066, GSK1363089 a anticuerpos como AMG 102. Algunos de ellos están mostrando resultados muy interesantes en enfermos con tumores con mutación EGFR que progresan a inhibidores de
EGFR por amplificación de MET.
Mutaciones de HER-2
HER-2 está sobreexpresado en un 20% de CPNM, pero la amplificación del gen solo ocurre en un 2%
de los casos. Las mutaciones se presentan en un 2% y suelen consistir en inserciones en el exón 20,
especialmente afectando a la secuencia Tir-Val-Met-Ala en el codon 776. Esta mutación aparece sobre todo en mujeres, nunca fumadores, adenocarcinomas y población asiática. Además, no están presentes en tumores que contengan mutaciones de EGFR o de KRas. Estas inserciones provocan una
activación constitutiva del receptor y las células tumorales que la contienen son sensibles a inhibidores tirosincinasa duales contra EGFR y HER-2 como lapatinib o BIBW 2292, pero no a inhibidores exclusivos de EGFR.
Mutaciones de BRAF
En CPNM, la incidencia de mutaciones de BRAF se sitúa entre el 1 y 3%, no se localizan en la misma
posición clásica del melanoma y son mutuamente excluyentes con las de KRas y EGFR. Las mutaciones de BRAF producirán un aumento de la actividad cinasa que conducirá a una activación constitutiva de MAPK2 y MAPK3 implicada en el desarrollo del CPCNP.

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Se están desarrollando inhibidores específicos de BRAF como PLX4032 que ha demostrado su eficacia en melanomas con mutación de BRAF.
Mutaciones de MAPK2
En CPCNP se han descrito mutaciones somáticas de MAP2K1 en un 1% de casos, sobre todo en
adenocarcinomas. Estas mutaciones son mutuamente excluyentes con EGFR, KRAS, HER2, PIK3CA
y BRAF. Las mutaciones situadas en las posiciones Lys57Asn y Gln56Pro conducen a una ganancia
de función, y las células que las portan demuestran sensibilidad a inhibidores que no compiten con el
dominio de ATP como AZD6244 aunque algunas mutaciones son resistentes a este agente.
Mutaciones de la vía de PI3K
Las mutaciones en el gen PI3KCA son muy poco frecuentes en CPNM, donde su incidencia se sitúa en el
2%. Las mutaciones se localizan en el exón 9, en los residuos Glu542 y Glu545 que codifican para la subunidad catalítica. Suelen ser tan frecuentes en la variante epidermoide como en el adenocarcinoma y
pueden estar presentes incluso en pacientes con mutación de EGFR. Estas mutaciones producen una
ganancia de la función enzimática in vitro y activan la vía señalizada por la proteincinasa B. Por otra parte,
la amplificación de PI3KCA también se ha visto en CPNM, sobre todo en carcinomas epidermoides, hombres y fumadores, y no necesariamente asociadas a la presencia de mutaciones.
Pequeñas moléculas inhibidoras que tienen como diana PI3K y mTOR han mostrado actividad antitumoral en modelos animales, pero en la etapa de desarrollo clínico precoz dan una modesta actividad.
Mutaciones de AKT
El gen que codifica para la proteincinasa B, AKT1 puede sufrir mutaciones en menos del 1% de CPCNP,
y se han identificado solo en población occidental y en la variante de carcinoma epidermoide. La principal mutación en AKT1 tiene lugar en la posición Glu171Lis, y provoca un escape al control de PI3K.

RECOMENDACIÓN
En el momento actual, el estudio de diversas vías de señalización y de sus proteínas asociadas
debe considerarse eminentemente experimental, aunque resultados en MET y BRAF parecen
prometedores y alguno podría incorporarse en un futuro no muy lejano.

Farmacogenómica
• ERCC1, RRM1 y 2, BRCA1.
• MKP-1, CHOK, EPOR.

ERCC1
ERCC1 (excision repair cross complementation group 1) es una proteína implicada en la reparación
del ADN que se ha relacionado con la resistencia al platino y con la evolución de la enfermedad.
ERCC1 es un componente del complejo de reparación de nucleótidos (NER) y resulta crucial para la
reparación del ADN dañado por el platino y otros genotóxicos. ERRC1 se expresa principalmente en
el núcleo de la célula y sus niveles de expresión varían considerablemente.
La determinación de ERCC1 se ha realizado mediante técnicas semicuantitativas, así como los niveles de
ARNm ERCC1, o por análisis cuantitativo en tiempo real en tejidos en fresco o parafinados. Una sobreexpresión de ERCC1 se ha relacionado con una supervivencia menor en casos avanzados (27) y con una

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menor respuesta a la quimioterapia (28). Asimismo, la quimioterapia adyuvante basada en cisplatino se
ha mostrado eficaz sólo en los pacientes cuyos tumores tienen una baja expresión de ERCC1, medida
por inmunohistoquímica (hazard ratio ajustada para muerte, 0,65; IC del 95%: 0,50-0,86; p = 0,002) (29).

Subunidad M1 de la ribonucleótido reductasa (RRM1)
La subunidad M1 de la ribonucleótido reductasa (RRM1) es un componente regulador del complejo ribonucleótido reductasa, que tiene una función básica en la conversión de nucleótidos en desoxinucleótidos, esencial en la síntesis de ADN. RRM1 se expresa principalmente en el núcleo y sus niveles
de expresión son variables.
RRM1 se ha relacionado con la resistencia a la gemcitabina (30). Niveles elevados de RRM1 producirían resistencia, mientras que niveles bajos se asociarían con sensibilidad a la gemcitabina de forma
dosis-dependiente (31).
Además, la alta expresión de RRM1 se ha relacionado con un peor pronóstico en los pacientes tratados con gemcitabina y cisplatino con medianas de supervivencia de 3,6 meses frente a 13,7 de los
pacientes con niveles bajos de RRM1 (32). La adición de un alcaloide de la vinca parecía eliminar el
efecto de la expresión de RRM1 sobre la supervivencia. De hecho, los niveles de RRM1 no parecen
afectar la citotoxicidad mediada por docetaxel, vinorelbina o etopósido, pero sí la de los antifolatos,
como el metotrexato o el pemetrexed.

Timidilato sintetasa
La timidilato sintetasa (TS) es una enzima involucrada en la síntesis de ADN, responsable de la producción de timidina. La TS se expresa en el citoplasma y en el núcleo celular de forma variable.
La TS es fundamental para mantener el depósito de timidina y sus niveles son predictores de respuesta al 5-fluorouracilo en los tumores digestivos. El interés de la TS en el CPNM se ha suscitado al
ser relacionada con la resistencia al antimetabolito pemetrexed.
Parece ser que los niveles de expresión de la proteína y su ARNm son mayores en el carcinoma epidermoide que en el adenocarcinoma (33). Unos niveles elevados de TS se han relacionado con un
peor pronóstico en el CPNM (34). Por el contrario, unos niveles bajos de TS podrían predecir una mayor respuesta a los inhibidores de TS, como pemetrexed y, por tanto, una mejor evolución. Hay diversos estudios en marcha que están confirmando la relación de la TS con la eficacia a pemetrexed. Los
resultados preliminares sugieren que los niveles de esta enzima pueden informar sobre la sensibilidad
a pemetrexed.

BRCA1
El gen BRCA1 fue descrito en 1994 como gen de susceptibilidad al cáncer de mama y de ovario.
BRCA1 tiene como función la reparación del ADN dañado. La expresión de BRCA1 está controlada
por varios mecanismos, por lo que puede alterarse por mutaciones del gen o modificaciones epigenéticas de su expresión. Se ha observado que las líneas celulares deficientes de BRCA se muestran resistentes a los taxanos, aunque serían más sensibles a la acción de los platinos (35). No obstante, este hecho no se repite en todos los tipos de líneas celulares tumorales y su mecanismo de acción
todavía debe ser definido.
Estudios del Grupo Español de Cáncer de Pulmón (GECP) han mostrado que los pacientes con niveles bajos de BRCA1 tenían una mejor supervivencia que aquellos con niveles altos. Además, la tasa
de respuesta era superior (67% frente al 58%) en los pacientes con tumores que expresaban niveles
bajos de BRCA1 (36). Este trabajo se realizó con PCR en tiempo real en muestras parafinadas, pero

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otro estudio, realizado mediante inmunohistoquímica, no encontró asociación entre la expresión de
BRCA1 y la respuesta al tratamiento (37).

El estudio de las diferentes dianas relacionadas con la sensibilidad o la resistencia a diferentes quimioterápicos se ha empleado en diversos procedimientos: inmunohistoquímica, determinación de
ARNm o de la proteína. Además, estos métodos se han realizado sobre tejido fresco o sobre tejido
conservado en parafina. Por todo ello, se necesita una estandarización de los métodos de medición,
como primera medida, antes de confirmar los resultados obtenidos en estudios de investigación.

RECOMENDACIÓN
En la actualidad, el estudio farmacogenómico en el CPNM sigue estando situado en el campo
de la investigación. Hay datos que apuntan su posible aplicación en la práctica clínica.
En un estudio prospectivo, donde se pudo seleccionar el tipo de quimioterapia en función
de los niveles de ERCC1 y RRM1 mediante PCR cuantitativa en tiempo real, se obtuvo una mayor
tasa de respuesta y un incremento en la supervivencia (38).
Si los estudios actualmente en marcha obtienen datos congruentes con los previos, podría
valorarse en un futuro próximo su incorporación a la práctica asistencial.

Marcadores de angiogénesis VEGF, moléculas de adhesión (ICAM)
El estudio pivotal ECOG 4599 sentó la indicación de bevacizumab en asociación con quimioterapia
para el tratamiento de primera línea de tumores no epidermoides (39). En los primeros 160 pacientes
incluidos en el estudio, se analizaron de forma prospectiva los niveles plasmáticos de VEGF, bFGF, la
soluble intercellular adhesion molecule (ICAM) y la E-selectina (40). A pesar de que los niveles de
VEGF se asociaron con la respuesta al bevacizumab, sólo los niveles bajos de ICAM se relacionaron
con un beneficio del bevacizumab en la supervivencia libre de progresión. No obstante, estos resultados deben ser confirmados en estudios posteriores.

Dado que no hay ningún factor identificado de respuesta a antiangiogénicos, se debe continuar la investigación tanto en la muestra del tumor como en la sangre.

RECOMENDACIÓN
En la actualidad, no hay ningún factor capaz de determinar la respuesta a los antiangiogénicos,
ni tampoco ningún factor relacionado con el desarrollo de toxicidad. Por todo ello, se debe
continuar desarrollando una labor investigadora en este campo.
Se recomienda incluir estudios de biomarcadores relacionados con la angiogénesis
en los ensayos a realizar.

Perfiles de expresion génica; microarrays de cADN o de oligonucleótidos
La aplicación de técnicas de alto rendimiento ha permitido realizar el estudio de perfiles de expresión génica que han buscado una relación pronóstica del CPNM (41), una clasificación más objetiva que la fundamentada en la anatomía patológica (42) o una búsqueda de predicción de la respuesta al tratamiento (43).

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Los estudios de perfiles de expresión génica necesitan perfeccionar varios aspectos, como la técnica de
realización, la homogeneización de los grupos evaluados y la mejora de los sistemas informáticos
de análisis de datos. De forma global, podría indicarse que existen dos conceptos de plataformas muy
diferentes: por un lado, las plataformas fundamentadas en oligonucleótidos y, por otro, aquéllas fundamentadas en cADN. Ambos tipos se basan en la hibridación de secuencias por características de complementariedad entre las bases de la muestra problema y las depositadas en los soportes sólidos de cada plataforma. Además de la variabilidad intrínseca de ambas plataformas, existen distintos modelos
comerciales cuyas características concretas dependen de la inclusión de un mayor o menor número de
copias de regiones de expresión conocidas, así como de la presencia de regiones denominadas EST. Incluso, la actualización de las secuencias incluidas es esencial para garantizar la fiabilidad de los datos
procedentes de estas plataformas de distintas casas comerciales. En resumen, hay muchas variantes y
poca estandarización, lo cual ha llegado al límite de permitir distintos perfiles de expresión para predecir
iguales resultados.

RECOMENDACIÓN
En el momento actual, el estudio de perfiles de expresión génica es un procedimiento
experimental sin ningún tipo de aplicación clínica estándar.

Perfiles de expresión de proteínas
Aunque resulta muy atrayente el hecho de determinar un perfil de proteínas que pueda predecir la
evolución de la enfermedad o la respuesta al tratamiento, por el momento, pocos estudios han sido
realizados en el CPNM, por lo que se trata de un área en fase de experimentación (44).

RECOMENDACIÓN
En el momento actual, el estudio de perfiles de expresión proteica es un procedimiento
experimental

OTROS FACTORES PRONÓSTICOS BIOLÓGICOS
Diferenciación de los diversos tipos histológicos de cáncer de pulmón
En la actualidad, la definición del cáncer de pulmón de acuerdo a los tipos histológicos es muy importante, ya que permite establecer la estrategia terapéutica a considerar y concretar el tipo de tratamiento.
Los principales tipos histológicos del CPNM son el adenocarcinoma, el carcinoma epidermoide y el
carcinoma de célula grande, según ha definido la Organización Mundial de la Salud (OMS) (45). La incidencia de estos tres tipos ha cambiado en los últimos años, de forma que se ha incrementado el
adenocarcinoma al tiempo que se va reduciendo el carcinoma epidermoide (46).

Carcinoma epidermoide
Este carcinoma suele originarse en los bronquios proximales y tiende a estar localizado. El diagnóstico histológico se basa en la presencia de áreas de queratinización, ya que la existencia de puentes intercelulares es un rasgo menos objetivo. Con frecuencia se asocia con fenómenos inflamatorios, especialmente cuando hay cavitación y necrosis. Sin embargo, si no hay queratinización y las células
son muy indiferenciadas, el diagnóstico es más complicado. Estas células más indiferenciadas suelen

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proceder de las capas basales del epitelio escamoso y pueden dar lugar a variantes, como el carcinoma basaloide o el de célula grande, que tienen una evolución peor al tener un comportamiento más
agresivo (47). Para diagnosticar correctamente estas formas más indiferenciadas, será preciso realizar
inmunohistoquímica con el objeto de determinar la presencia de las citoqueratinas 7 y 20 y la expresión de p63. Además, será preciso realizar el diagnóstico diferencial con el carcinoma de célula pequeña, por lo que habrá que llevar a cabo la inmunohistoquímica de marcadores neuroendocrinos,
como sinaptofisina, cromogranina o enolasa neuronal específica.

Adenocarcinoma
El adenocarcinoma suele tener una gran variabilidad de formas histológicas y el 80% son mixtos (48). Se
origina en la superficie del epitelio alveolar o en las glándulas mucosas de los bronquios, por lo que tiende a localizarse en las zonas periféricas. A pesar de ello, en el momento del diagnóstico es frecuente la
afectación metastásica incluso en ausencia de síntomas clínicos. Tiene una asociación con el tabaquismo, aunque un subgrupo de adenocarcinomas aparecerá en los pacientes no fumadores, especialmente
en mujeres. El aspecto histológico se caracteriza por la presencia de glándulas y mucina o estructuras
papilares. También puede presentar un patrón sólido que habrá que diferenciar del carcinoma epidermoide. En este caso, la determinación de TTF-1 permitirá el diagnóstico de adenocarcinoma.
Mención especial merece el carcinoma bronquioloalveolar (BAC). Se trata de una variante de adenocarcinoma de crecimiento más lento, con un comportamiento clínico diferente y una mejor evolución.
Desde el punto de vista histológico, los criterios diagnósticos se han restringido en los últimos años y
se limitan a la presencia de un crecimiento lipídico a lo largo de los septos en ausencia de invasión del
parénquima. Además, los BAC pueden desarrollar dos tipos, el mucinoso y el no mucinoso. Por tanto,
aplicando estos criterios estrictos, su incidencia es reducida, ya que las formas mixtas deben ser consideradas como variantes convencionales de adenocarcinoma (49).

Carcinoma de célula grande
Este carcinoma es el menos frecuente de los CPNM y su incidencia va paulatinamente en descenso.
Esto se debe a que se trata de un diagnóstico de exclusión, ya que muchos de ellos son realmente
formas poco diferenciadas del carcinoma epidermoide o del adenocarcinoma. Por tanto, a medida
que se definen mejor los dos tipos principales de CPNM, el diagnóstico de carcinoma de célula grande se reduce. Sin embargo, la clasificación de la OMS sigue admitiendo el grupo de carcinoma indiferenciado de célula grande para tumores sin rasgos que permitan decantarse hacia uno u otro tipo.
Prueba de la dificultad que conlleva el diagnóstico de este tipo de cáncer de pulmón es que los estudios que analizan la variabilidad secundaria al observador han objetivado que las mayores diferencias
se presentan en el grupo de carcinomas indiferenciados (50).
Además, la clasificación de la OMS ha hecho una distinción del grupo considerado sarcomatoide con
inclusión de variedades muy raras, como el rabdoide, el linfoepitelial o el de células claras.
Por otra parte, es preciso diferenciar el subtipo de carcinoma neuroendocrino de célula grande, que
será identificado mediante marcadores neuroendocrinos (51). Se trata de una entidad con un comportamiento clínico diferente al carcinoma de célula pequeña y a otras formas de CPNM, por lo que deberá ser considerado como un grupo diferente en la práctica clínica.

Utilidad clínica: valor predictivo y valor pronóstico
La importancia de los subtipos histológicos en el CPNM puede justificarse por diversas razones:
cada tipo de carcinoma procede de células con diferente origen embriológico y surge de distintas

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localizaciones anatómicas (vía central o periférica), con lo que las funciones de las mismas serán diferentes y, por tanto, la respuesta al tratamiento o la evolución pueden discurrir en función de estos
factores. En segundo lugar, algunas mutaciones son más frecuentes en ciertos tipos histológicos
como, por ejemplo, las de KRAS (52) o EGFR (53), que se asocian más frecuentemente con adenocarcinomas. Por ello, un tratamiento específico contra una diana podría depender, también, del tipo
histológico donde esa diana es más relevante en el desarrollo de la neoplasia. De igual modo, los
distintos quimioterápicos actúan sobre ciertas vías celulares cuya función puede variar según el tipo histológico del tumor. En este sentido, los niveles de timidilato sintetasa o de ERCC1, relacionados con la resistencia a pemetrexed y platino, respectivamente, pueden ser más elevados en los
carcinomas epidermoides.

El tipo histológico como factor predictivo
Datos de dos estudios aleatorizados en fase III de quimioterapia, un análisis retrospectivo del estudio
pivotal de pemetrexed frente a docetaxel en segunda línea (54, 55) y un análisis prospectivo del ensayo que comparó cisplatino y gemcitabina frente a cisplatino y pemetrexed en primera línea de tratamiento (56) han atribuido un valor significativo al subtipo histológico en relación con la respuesta al
tratamiento. De este modo, los pacientes con carcinoma no epidermoide tuvieron más supervivencia
cuando fueron tratados con pemetrexed, mientras que los del carcinoma epidermoide tuvieron peor
evolución con pemetrexed. Un tercer estudio, que comparó dos dosis de pemetrexed en segunda y
tercera línea, mostró el mismo resultado (57).
Para confirmar el auténtico valor predictivo que la histología puede tener sobre el tratamiento oncológico, los estudios a realizar deberían incluir un test de interacción que analizara esta posible relación
(58, 59). Dado que para este tipo de análisis se necesitarían estudios de mucho mayor tamaño muestral, muchas veces inviables de realizar, la mayoría de los trabajos carecen del poder necesario para
detectar esta interacción (60). Por tanto, muchos ensayos siguen estableciendo análisis de subgrupo
predeterminados o realizados de forma retrospectiva.

Relación del tipo histológico con el tratamiento con bevacizumab
En el estudio aleatorizado en fase II que objetivó el beneficio de la adición de bevacizumab a la quimioterapia basada en carboplatino y paclitaxel (61) se observó que la mayor respuesta se producía
en el grupo de pacientes con tumores no epidermoides. Además, se produjeron varios casos de hemorragia pulmonar mortal relacionada con el bevacizumab en enfermos con carcinoma epidermoide.
No obstante, no se sabe si este incremento de la incidencia de hemorragia está directamente relacionado con el subtipo histológico epidermoide o con un mayor riesgo de sangrado de los tumores
centrales y cavitados, que en su mayoría son del tipo epidermoide. Por todo ello, los dos ensayos en
fase III realizados para confirmar la eficacia de bevacizumab en el CPNM sólo incluyeron tumores no
epidermoides.

Relación del tipo histológico con el tratamiento con inhibidores de la tirosincinasa
del EGFR
A pesar de que el carcinoma epidermoide es que el tiene una mayor expresión del EGFR, la mejor respuesta a los inhibidores de la tirosincinasa del EGFR se ha observado en los pacientes cuyos tumores
tienen mutaciones activadoras del receptor, aunque todavía no se conoce el mecanismo exacto de
actuación de estos agentes. Dado que la mayoría de las mutaciones suelen observarse en los adenocarcinomas, el tipo histológico podría ser orientativo a la hora de estimar la existencia de mutaciones
que predicen la respuesta a este tratamiento. No obstante, se ha observado también un beneficio a

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los inhibidores de la tirosinquinasa en los pacientes con carcinomas epidermoides. De hecho, el estudio BR.21, que dio la indicación de emplear erlotinib como tratamiento de segunda o tercera línea del
CPNM, concluyó que el tipo histológico per se podría ser más un factor pronóstico de la enfermedad
que un factor predictivo de respuesta al fármaco (62).

El tipo histológico como factor pronóstico
En una revisión de 408 publicaciones, realizadas entre 1982 y 2007, que exploraban el valor pronóstico o predictivo de la histología en el CPNM, sólo se identificaron unas 30 que aportaban una relación
concluyente (63). Once de ellas encontraron asociación con la evolución pronóstica y siete sugerían
una predicción de la respuesta a la quimioterapia. Además, 14 publicaciones identificaron un valor
pronóstico o predictivo cuando se empleaban inhibidores del EGFR.
La ausencia de resultados concluyentes se ha debido a la falta de una metodología homogénea, con
un material histológico insuficiente y con una variación en la clasificación de subgrupos. A pesar de
estas dificultades, se sugiere que la histología podría ofrecer una información pronóstica y predictiva
relevante, por lo que los futuros estudios deberán ser diseñados teniendo en cuenta el análisis de los
subtipos histológicos.

Diferencias entre biopsia y citología
La citología da una información limitada de la celularidad tumoral y no permite obtener datos sobre
la arquitectura del tumor. Por ello, en la actualidad se recomienda la obtención del diagnóstico de
neoplasia mediante biopsia por fibrobroncoscopia. Es evidente que el tamaño de la muestra, que
se consigue por vía endoscópica, es muy reducido, pero suele ser suficiente para realizar un diagnóstico apropiado del tipo histológico. En un estudio comparativo entre biopsias bronquiales y
biopsias obtenidas por toracotomía, hubo buena correlación entre ambos métodos (κ= 0,70) (64).
Las principales discrepancias en el diagnóstico histológico se dieron cuando existía necrosis extensa o ausencia de diferenciación, y es que se estima que puede haber una heterogeneidad tumoral importante en cerca de un 45% de los carcinomas estudiados (65).
Una vez conseguido el material adecuado, se debe realizar un diagnóstico anatomopatológico del
cáncer de pulmón que diferencie los tipos histológicos de forma precisa. Para ello, será necesario
aplicar la técnica de inmunohistoquímica comentada previamente: citoqueratinas 7 y 20, determinación de marcadores neuroendocrinos, queratina, TTF-1 y p63.

RECOMENDACIÓN
El diagnóstico de CPNM debe definir el tipo histológico concreto, haciendo la distinción
entre epidermoide y no epidermoide, lo que permitirá decidir si el paciente es candidato
a tratamiento con bevacizumab o pemetrexed.
Además, el tipo histológico podría sugerir la realización de un estudio de mutaciones en EGFR
para el tratamiento con inhibidores de la tirosincinasa. De hecho, el adenocarcinoma es
el que se asocia con mayor frecuencia a las mutaciones. Por ello, ante un paciente que reúna
un perfil clínico sugestivo de ser portador de una mutación EGFR, es decir, no tener hábito
tabáquico previo, ser del sexo femenino o de raza asiática, debería asegurarse la presencia
de un diagnóstico anatomopatológico de carcinoma no epidermoide, sin ser aceptable
el diagnóstico aislado de carcinoma no microcítico de pulmón.

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