PROCEDIMIENTO DE OPERACION DE LOS EQUIPOS HPLC SERIE 1200 DE LONGITUD DE ONDA VARIABLE

1. PROCEDIMIENTO DE OPERACION DE LOS EQUIPOS HPLC SERIE 1200 DE LONGITUD
DE ONDA VARIABLE
1. OBJETIVO:
Operar de forma adecuada los equipos HPLC de la serie 1200, para garantizar la
calidad de los resultados de los análisis que en ellos se realicen.
2. RESPONSABILIDAD:
2.1. Q.F. programador responsables del uso del equipo.
2.2. Jefe de Control de Calidad, responsable de hacer cumplir el presente
procedimiento.
3. FRECUENCIA:
Diaria, de acuerdo al programa de análisis por cromatografía liquida del área de Control
de Calidad y/o Desarrollo Analítico si así lo requiere.
4. MATERIALES:
4.1 Equipo HPLC Serie 1200 VWD con Detector de Longitud de Onda variable:
Marca: AGILENT, Modelo: Cuaternario.
4.2 Equipo HPLC Serie 1200 DAD-RID con Detector de Arreglo de Diodos y Detector
de Índice de Refracción: Marca: AGILENT, Modelo: Cuaternario.
4.3 Fases móviles, de acuerdo al producto en análisis.
4.4 Columnas cromatograficas, de acuerdo al producto en análisis.
5. PROCEDIMIENTO:
5.1 Observaciones Preliminares:
5.1.1 El analista debe estar provisto de los EPP’s necesarios de acuerdo al tipo
solvente a usar.
5.1.2 Verificar que los cuatro canales (A, B, C Y D) cuenten con su filtro de
entrada de solvente, nunca los utilice sin filtro, pues se puede generar
obstrucciones en el equipo.
5.1.3 Verificar que no existan burbujas de aire en los canales, si lo hubiese,
eliminarlos mediante la purga de todos los canales.
5.1.4 Los disolventes y fases móviles siempre se deben filtrar a través de filtros
de 0,45 μm, ya que las partículas pequeñas pueden bloquear
permanentemente los capilares y las válvulas.
5.1.5 Cambiar los solventes cada dos días o vuelva a filtrarlos (filtro de 0,45 μm).
En caso del agua filtrarla y cambiarla diariamente.

2. 5.1.6 Verificar que no existan obstrucciones en ninguna parte del equipo.
5.1.7 Compruebe regularmente las fritz de la válvula de purga. Se puede
identificar una fritz bloqueada por la existencia de capas negras o
amarillas en su superficie o de una presión mayor de 10 Bares, cuando
se bombee agua a una velocidad de 5 ml/min con la válvula de purga
abierta. Si es necesario considerar el cambio de fritz.
5.1.8 Asegurar que la cantidad de fase móvil sea la suficiente para terminar con
el análisis.
5.1.9 Asegurar que el recipiente de desechos sea de capacidad suficiente
para contener los desechos del producto en análisis, purga y lavado.
5.1.10 No deje nunca la fase móvil en el instrumento durante varios días sin flujo.
5.1.11 En caso de no usar el equipo por más de 2 días, purgar todos los canales
con agua por 10 minutos, luego con metanol grado HPLC y finalmente con
una mezcla 80:20 de Metanol y Agua, para evitar la proliferación de
microorganismos en el equipo.
5.2 Operación:
5.2.1 Acondicionamiento del Sistema Cromatografico:
a) Abrir la válvula de purga de la bomba girándola en el sentido contrario a las
agujas del reloj.
b) Purgar el canal con la fase móvil de trabajo por lo menos 10 minutos. El
tiempo de purga aproximado es de 10 minutos por cada canal a la velocidad
de flujo de 3 a 5 mL/min (purgar todos los canales con al menos 30 mL). Se
recomienda purgar cada canal individualmente, en caso de hacerlo de manera
múltiple, revisar primero la compatibilidad de los solventes que se han usado
en cada canal. Los disolventes de selección para la purga son los siguientes
de acuerdo al propósito:

3. c) Colocar la columna manteniendo su dirección de flujo y ajustar los conectores
manualmente.
d) Acondicionar la columna a la mitad del flujo de trabajo durante 30 minutos con
la fase móvil correspondiente, hasta observar línea base, incrementar
paulatinamente el flujo cada 0,5 mL/min, hasta llegar al flujo de trabajo. La
presión máxima originada debe ser de 120 bares.
NOTA: En caso de realizar un análisis en fase normal, realizar la purga de los
cuatro canales con Isopropanol durante 15 minutos cada uno, utilizando
posteriormente un volumen muerto para garantizar que el detector se haya
estabilizado por completo. Luego seguir según c y d.
5.2.2 Encendido del Equipo:
a) Encender el computador de la forma convencional.
b) Encender los módulos del equipo en el siguiente orden: detector, termostato
(compartimento de columna), inyector automático, bomba y desgasificador de
vacío, presionando su respectivo botón ubicado en la parte inferior izquierda
de cada módulo. Si se observa el equipo en su conjunto la dirección de
encendido es de abajo hacia arriba.

4. c) Esperar que inicialice el sistema para luego ingresar al software.
5.2.3 Manejo del Sofware:
a) Ingresar al software presionando los íconos Instrument Online e
Instrument Offline ubicado en la pantalla principal del escritorio.
b) Se visualiza la pantalla principal del software, el indicador de estado del
sistema en online se evidencia a través de 3 colores:
•En rojo, “Not Ready”: indica que el equipo no está preparado.
•En verde, “Ready”: indica que el equipo está preparado.
•En azul, “Running”: indica que el equipo empezó la secuencia
programada.

5. c) Encienda la lámpara del detector, la bomba y el inyector automático
dando clic en el botón System On (Sistema encendido) ubicado en la
pestaña Instrument o en los botones bajo los iconos del módulo en la
interfase gráfica del usuario.
d) Después de algunos segundos, cada indicador del módulo (la bomba,
compartimento de la columna termostatizada y el detector se iluminará
en verde y el estado del sistema cambiará a “Ready”.

6. 5.2.4 Creación de Métodos:
a) El método se puede crear en el Online o en el Offline, dependiendo de
la elección del analista, y del proceso de un análisis previo, pues
durante un análisis en el online no puede crearse ningún método.
b) Para la creación de un método nuevo, seleccionar la pestaña Method:
Edit Entire Method:

7. c) En la primera ventana de dialogo mantener activos los 4 items, luego
presionar OK.
d) En la ventana de Method Comments, se colocan todos los parámetros del
método importantes, que no aparecen automáticamente en el reporte de
análisis; estos parámetros son: Principio activo, nombre del producto y
presentación, tipo de columna cromatografica empleada, flujo y
presión de trabajo aproximada, luego presionar OK.

8. e) En la siguiente ventana: Set up Pump, colocar los siguientes datos:
• En Flow: Colocar el flujo de trabajo.
• En Stop time: Colocar el tiempo de duración de la corrida
cromatografica.
• En Presion Limits: Colocar los rangos de presión, máximo 400 bar y
mínimo 0 bar.
• En Solvents: Colocar el nombre de los solventes que se ubican en los
canales y activar el (los) canales correspondientes a la(s) fase(s) móvil
(es).

9. NOTA: En caso de realizar una gradiente lineal o isocrática o la
combinación de ambos, realizarlo en el Timetable, para ello se emplean
las pestañas Insert, cut, paste, etc, de acuerdo a lo que indique la técnica
analítica.
• Luego presionar OK y salir de la ventana.
f) En la siguiente ventana: Set up Injector, colocar el volumen de inyección,
luego presionar OK.
NOTA: Para optimizar el tiempo de corrida, seleccionar la opción Overlap
Injection Cycle en la misma ventana y colocar el tiempo en minutos en el cual el
inyector tomará la muestra del siguiente vial programado en la secuencia.
Normalmente se debe colocar 2 minutos antes del Stop time. No utilizar esta
opción en métodos en gradiente.

10. g) En la ventana Column Thermostat Method colocar lo siguiente: En Column
Switching Valve: seleccionar el numero de columna a usar, este puede ser
column 1 o column 2. En temperature: de acuerdo al número de columna
seleccionada, colocar la temperatura de la columna indicada en la técnica
analítica. Tener precaución en el uso de MORE. El rango de temperatura va
desde 10 grados por debajo de la temperatura ambiente a 80 ºC. Luego
presionar OK.
h) Colocar la longitud de onda a usar en la ventana del detector, la cual
dependerá del detector del equipo HPLC 1200 que se este empleando (VWD,
DAD o RID). Para comprender este item referirse al instructivo particular.

11. i) Cuando se use dos longitudes de onda usar el Timetable, luego hacer clic en
OK. (Esta opción es solo para el detector VWD).
j) Colocar la longitud de onda de trabajo en la ventana Signal Details,
seleccionar la(s) longitud(es) disponibles en Available Signals, luego presionar
Add Method, luego presionar OK. Si no se sigue este paso el método no
será valido y el análisis no será correcto. En el caso de detectores DAD y
RID referirse al instructivo en particular.

12. k) Las siguientes ventanas corresponden a los parámetros de integración, que
pueden ser modificados durante procesamiento de los resultados, por ello en
la ventana Edit Integration Events, generalmente se presiona OK para
continuar.
l) Colocar las opciones específicas del reporte en las ventanas Specify Report:
• En Quantitative Results: Colocar la forma de calcular, basado en área.
• En Calculation Factors: Seleccionar que calcule con los datos del data
file.
• En ISTD Correction: Seleccionar estándar interno dependiendo si el
método lo requiere.
• En Style: seleccionar el estilo del reporte short u otro.

13. • En Destination: seleccionar solamente screen para programar la
secuencia y seleccionar printer, al momento del procesamiento de
resultados
• Luego presionar OK:
m) En Instrument Data curves: presionar OK para continuar.

14. n) En la ventana Run time Checklist mantener la selección automática, agregar
Save Method whit Data y presionar OK.
o) Finalmente guardar el método, para ello hacer clic en Method y seleccionar
Save Method as… y colocar el nombre del método y guardar en la ruta
establecida. Para nombrar el método referirse al instructivo particular.

15. NOTA: Todos estos parámetros del método pueden variarse individualmente
utilizando la pestaña Instrument o desde la interfase grafica una vez que el
método haya sido creado.
5.2.5Creación de Secuencias:
a) Las secuencias se puede crear en el Online en el Offline.
b) En la pestaña Sequence seleccionar New sequence template.
c) Ingresar a la pestaña de Sequence, comenzar seleccionado Sequence
parameters:

16. d) Colocar los datos siguientes:
• En Operador Name: Colocar el nombre del analista.
• En Data File: Seleccionar la ruta en la cual se guardará el subdirectorio.
• En Subdirectorio: Colocar el nombre de la carpeta en la cual se
almacenarán las corridas.
• En Prefix: Colocar los dos primeros dígitos del mes y día de análisis y
el equipo coloca automáticamente un correlativo (Ejm: 0103-0001).
• En Path of Method to Run: Mantener la opción de According to runtime
checklist, para iniciar con las corridas cromatográficas.
• En Wait: Colocar el tiempo después del cual inyectará la muestra.
• En Shutdown: Colocar el check y seleccionar una de las opciones:
Stand bye , shutdown, pumpall off, lamp off, dependiendo del propósito
al finalizar el análisis.

17. e) Seleccionar Sequence Table ubicarse sobre la línea para resaltarla, luego
presionar Append line las veces necesarias para aumentar el número de
líneas que conformaran la secuencia para crear la secuencia propiamente
dicha, luego presionar OK.
• En Vial: Colocar el número de vial en el cual se ubicarán el(los)
estándar(es) y muestra(s).
• En Sample Name: Colocar el nombre del vial según sea estándar o
muestra.
• En method Name: Colocar el nombre del método que usará la
secuencia.
• En Iny/Vial: Colocar el número de inyecciones por vial.
• En Sample type: Seleccionar según corresponda estándar (Calibration)
o muestra (Sample).
• En Cal level: colocar el número de nivel de acuerdo al número de
estándares.

18. f) Finalmente para guardar la secuencia seleccionar Save Sequence Template
as…, colocar el nombre de la secuencia de acuerdo al instructivo particular y
guardar.
5.2.6 Programación de la corrida cromatografica:
a) Luego de la creación del método y la secuencia, seleccionar Reset Injector (en
el grafico del autosampler), para guardar el brazo del inyector, retirar el
portaviales para colocar los viales del producto en análisis, luego verificar su
ubicación de manera que corresponda a la secuencia creada.

19. b) Proceder al acondicionamiento del equipo de acuerdo al ítem 2.5.1.
c) Acondicionar la columna de acuerdo a lo especificado en la técnica analítica y
hasta conseguir línea base.
d) Realizar una inyección de prueba, para ello y de acuerdo al cromatograma
obtenido colocar el tiempo de corte de la corrida.
e) Seleccionar la pestaña Run Sequence para que comience la secuencia
programada.

20. 5.2.7 Procesamiento de Resultados:
a) El procesamiento de resultados se puede realizar en online u offline.
b) Ubicar la pestaña View y seleccionar Data Análisis.
c) Ubicar en la pestaña File: Load Signal , las corridas cromatográficas de
acuerdo a la secuencia con que fue guardada.

21. d) Seleccionar una corrida de estandar y una corrida de muestra. En la pestaña
Integration, ingresar a Integration Events para colocar los parámetros de
integración del piso en análisis.

22. e) Luego guardar los cambios en el método presionando el símbolo
f) En la pestaña de Sequence: Sequence Table, colocar los factores de la
muestra.

23. g) Ingresar a la pestaña Calibration: Calibration Table, para colocar el factor de
dilución del estándar y presionar OK

25. h) En la pestaña Calibration: Calibration Settings, colocar el intervalo de
tiempo para el tiempo de retencion (por default es 5%) , las unidades en que
se presentaran los resultados (mg/mL, mg, etc) y mantener las condiciones de
calibración en: Linear: Include: Iqual, luego presionar OK.
i) Colocar en Report: Specific Report, el calculo por areas (ESTD), el tipo de
reporte (Short, salvo que se trate de un SST) y en Signal Option se coloca los
rangos de tiempo y de señal en la que se requiere presentar el pico del analito
en el cromatograma a reportar, así como se activa la opción de presentar
todas las corridas a la misma escala.

26. j) Para la impresión del reporte ubicar la pestaña Sequence: Sequence Ouput y
seleccionar lo que se desea imprimir mediante la activación de tres opciones:
7,8 y 9; para los resultados y la calibración y 6 para imprimir los
cromatogramas , luego volver a la pestaña Sequence y seleccionar Partial
Sequence, para seleccionar lo que se va a imprimir.
k) Paso siguiente aparecerá la secuencia; seleccionar las corridas a calcular,
colocando un check en los espacios ubicados debajo de Sel (lado izquierdo de
los números consecutivos), luego presionar Run Sequence.

27. l) Se visualiza el cuadro denominado Partial Sequence, en el cual va
aumentando la barra de color azul cuando llega al 100% indica el inicio de la
impresión.

28. 5.2.8 Apagado del Equipo:
a) El análisis termina con el lavado de la columna y la limpieza del sistema
cromatográfico.
b) Retirar la fase móvil y purgar el sistema.
c) Colocar en la ventana principal del sofware: Cerrar (la X de la parte superior
derecha de la ventana), el equipo automáticamente indica si se desean apagar
los módulos, seleccionar OK en todas las ventanas.
d) Apagar todos los módulos manualmente presionando su respectivo botón
ubicado en la parte inferior izquierda de cada módulo (desgasificador, bomba,
autosampler, termostato, detector), en sentido contrario a como fueron
encendidos, es decir de arriba hacia abajo.