PCR

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE
MOQUEGUA
TITULO:
Mapa Conceptual - Artículos de Ingeniería Genética
CURSO:
Biotecnología
DOCENTE:
Dr. Hebert Hernan Soto
Gonzales
ESTUDIANTE:
Rubiliz Silvana Huancco Bravo
Ciclo:
VII Ciclo
Fecha y lugar:
27 de Junio del 2021, Ilo

2. OPTIMIZACIÓN Y VALIDACIÓN DE UNA PCR EN TIEMPO REAL PARA LA
RÁPIDA IDENTIFICACIÓN DE BACILLUS THURINGIENSIS, SIMULADOR
DE BACILLUS ANTHRACIS
Álvarez, Larigauderie, Ortega, Granja y Cabria.
Realizado por
Desarrollar y validar una PCR
en tiempo real para la rápida
identificación
B. thuringiensis para
entrenamiento de la unidades
operativas
Metodología
Cepa HD-1 de B.
thuringiensis subsp. kurstaki
del
Objetivo
laboratorio de Biología
Molecular del INTA.
obtenido del
Cultivo enriquecido, proceso
periódico, se incubó y se
purifico el ADN total.
Introducción
Dado la Homología y la nula
patogenidad-humano
simulador del B. anthracis
B. thuringiensis: bacteria
patógena
insectos, nemátodos,
protozoos y platelmintos
para
La toxicidad: las proteínas
cristal (cry)
Extracción y cuantificación
del ADN molde
La cuantificación, calculo de
los egs
Resultados y Discusión
A 60°C: reduce el LOD hasta
la dilución 10^-6
aumenta la eficiencia de la
reacción de amplificación al
93%,
Optimización del ensayo
el rango lineal del ensayo
abarca las 6 primeras
diluciones.
Conclusiones
Validación del ensayo
Tanto la inclusividad como la
exclusividad: 100%.
Se ha optimizado y validado
una PCR en tiempo real
La eficiencia y linealidad del
método fueron adecuadas
Dicha qPCR: una elevada
sensibilidad
con un
LOD de 13 egc
es el
el
=(cantidad * 6,022x10^23) /
(longitud * 1x10^9 * 650).
y

3. Optimización de la PCR
cualitativa en tiempo real
El ensayo, la sonda de
hidrolisis, la amplificación
Para optimizar el ensayo:
(58, 60 y 62°C).
Los productos de la qPCR:
gel agarosa 2%
El valor R2 igual a 0,9993.
Límite de detección del
método
La dilución 10^-6 son
positivos, dilución 10^-7 son
15 resultados positivos y 5
negativos, 10^-8 son 12
positivos y 8 negativos.
Inclusividad y exclusividad
un valor de Cq inferior a 38
banda de 69 pb en la cepa
HD-1 de B. thuringiensis
subsp. kurstak
Validación del ensayo:
Eficiencia, linealidad y límite
de detección
La pendiente de la curva
estándar, coeficiente de
correlación R^2 y menor
concentración de ADN
Determinación del cutoff
value
descubrir proteínas
insecticidas inéditas.
Actualmente: 75 familias de
genes cry
La PCR: análisis de cepas
de B. thuringiensis
para
Este simulador:
entrenamiento de la NBQ de
las FAS
y
Esta qPCR es especifica
para el gen cry1A
Se implementaron diferentes
PCRs en tiempo real.
identificar distintas cepas de
B. thuringiensis
para

4. Evaluación inicial del método:
preparo dos escenarios
biológicos
Primero: atentado ferroviario
Segundo: laboratorio
clandestino
La inclusividad y la exclusi -
vidad : 100%
Evaluación inicial del método
se obtuvo una identificación
positiva de B. thuringiensis
LOD es mayor que la
de otras qPCR especificas
Ninguna de las 24 cepas
no diana utilizadas mostró un
resultado positivo.
Es importante disponer de un
ensayo molecular rápido,
sensible y específico
la identificación de B.
thuringiensis, simulador de
B. anthracis
Información Obtenida:
https://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1887-85712018000200084
Inclusividad y exclusividad: 1
cepa DIANA, 24 cepas no
diana respectivamente