PRACTICA REALIZADA EN LA UPC SOBRE ANÁLISIS DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS DIFERENTES PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS Y ACCESORIOS QUE SE ENCUENTRAN EN LOS DIFERENTES TIPOS DE VEGETALES

2. INTRODUCCIÓN
La fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque
convierte la energía de la radiación solar en energía química que puede ser
usada por todas las formas de vida. La fotosíntesis comprende dos
reacciones globales diferenciadas. En la primera se realiza la transducción de
energía, y en la segunda la reducción y fijación del carbono.
Los pigmentos fotosintéticos son los únicos que tienen la capacidad de
absorber la energía de la luz solar y hacerla disponible para el aparato
fotosintético. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre
varios pigmentos, clorofila a, clorofila b, algunas xantofilas y carotinas.
Todos estos pigmentos son insolubles en agua, pero se disuelven fácilmente
en algunos solventes orgánicos.
Además de las clorofilas y carotenoides, muchas plantas poseen otros
pigmentos, tales como antocianos, flavonoles, etc.

3. En este trabajo práctico realizaremos experimentos de extracción de
diferentes pigmentos vegetales, tales como: clorofilas a y b, xantofilas,
carotenoides y pigmentos antocianicos. Se analizaran las características
de estos diferentes pigmentos fotosintéticos y accesorios que se
encuentran en los diferentes tipos de vegetales que usaremos. Luego se
identificaran los diferentes pigmentos que se encuentran en las hojas de
espinaca, con el uso de un cromatograma. Se realizara la separación de
las xantofilas a partir de un extracto de espinaca. Se determinaran las
características físicas y químicas de las clorofilas y pigmentos
antocianicos y por último se explicara porque hay cambios de coloración
en las flores, cuando se someten a diferentes PH.
Esperamos que con estas aplicaciones podamos lograr los objetivos de
esta práctica y conocer de esta manera los diferentes pigmentos que se
encuentran en las frutas hojas y flores de una planta.

4. OBJETIVOS
GENERAL
Analizar las características de los diferentes pigmentos fotosintéticos y
accesorios que se encuentran en los diferentes tipos de vegetales.
ESPECÍFICOS
 Identificar los diferentes pigmentos que se encuentran en las hojas de
espinaca, con el uso de un cromatograma.
 Realizar la separación de las xantofilas a partir de un extracto de
espinaca.
 Determinar las características físicas y químicas de las clorofilas.
 Determinar las características físicas y químicas de los pigmentos
antocianicos.
 Explicar porque hay cambios de coloración en las flores, cuando se
someten a diferentes Ph.

5. DESARROLLO
METODOLOGICOENSAYO
RECURSOS-TÉCNICOS
1. MATERIALES
 Papel absorbente.
 Papel filtro
 Mortero de porcelana.
 Embudo
 Beaker
 Caja de Petri
 Tubos de ensayo.
MATERIAL BIOLÓGICO
 hojas frescas de espinacas o frijol.
 Arena de cuarzo.
REACTIVOS.
• Alcohol al 95 %.
 NaOH al 5 %.
 Ácido acético glacial.
 CuSO4
 Carbonato de calcio.

6. EQUIPOS:
 Grapadora
 Lámpara
RECURSOS HUMANOS
Vianys Gomez Arias, Sharon Gutiérrez, Mimí Parra, Taideth
Arias y Ailin Acosta. Con la asesoría del docente Gustavo
Rohenes Gale, licenciado en biología de la universidad
industrial de Santander (UIS).
RECURSOS ECONÓMICOS:
 Hojas de espinacas
 Papel absorbente.
 Papel filtro

7. Con una balanza pesar 5-8 gramos
de hojas de espinacas.
En un beaker adicionar agua y
sumergir las hojas de espinacas.
Agregamos carbonato de calcio.
Colocamos a hervir durante 2
minutos.
con papel absorbente secamos las
hojas.
En un mortero de porcelna
trituramos.
Adicionamos alcohol al 95% y
seguimos triturando.
Descantamos y filtramos la
disolucion de pigmentos con un
papel filtro.
Agregamos 50 ml de
alcohol al macerado.
Ensayo 1.1
En un frasco con lados
planos y paralelo
vertimos el extracto
Con la ayuda de la lampara
iluminamos con luz fuerte
por medio de un haz.
Fluorescencia

8. RESULTADOS Y ANALISIS
Ensayo N 1 EXTRACCIÓN DE LOS PIGMENTOS VEGETALES
1.1. Cuando una solución de clorofila es iluminada con luz blanca o azul se produce
un fenómeno de excitación molecular. La luz emitida por fluorescencia es siempre
de mayor longitud de onda y de menor energía que la luz incidente, pues siempre
algo de esa energía se disipa en forma de calor.
Esta emisión de luz por parte de la clorofila, demuestra que es capaz de realizar
reacciones fotoquímicas.
Las clorofilas son poco estables in vitro, especialmente bajo iluminación intensa. El
átomo central de magnesio es fácilmente reemplazado por hidrógeno, dando lugar a
las feofitinas respectivas, pigmentos de color pardo oliva.
Los pigmentos migran a distintas velocidades de acuerdo a su solubilidad. De este
modo se puede efectuar una separación entre ellos y cada compuesto puede ser
definido por una magnitud específica denominada Rf (relación de frente), que tiene
valores entre 0 y 1.

9. SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFIA

11. Ensayo 1.2

13. 5 ml del extracto + 1 ml de agua (control)
Se presenta un color más claro en la disolución no se observa un
cambio significativo con respecto a la muestra.
5 ml del extracto + 1 ml de NaOH al 5 % Se presenta un color verde biche en la disolución.
5 ml del extracto + 1 ml de ácido acético glacial Se presenta un color verde intenso.
5 ml del extracto + 1 ml de CuSO4 al 5 % Se presenta una coloración más verde.

14. Al igual que la clorofila en la estructura, las feofitinas son en realidad
productos de descomposición. Están "gastando" clorofila que ha perdido un
ion pero que permanece en la hoja y continúa brindando a la hoja su color.
El ion perdido proviene del componente de magnesio.
La clorofila puede sufrir distintos tipos de alteraciones. La más frecuente,
es la pérdida del átomo de magnesio, formando la llamada feofitina, de un
color verde oliva con tonos marrones, en lugar del verde brillante de la
clorofila. Esta pérdida del magnesio se produce por sustitución por dos
iones H+, y consecuentemente se ve favorecida por el medio ácido.
La pérdida es irreversible en medio acuoso, por lo que el cambio de color de
los vegetales verdes es un fenómeno habitual en procesos de cocinado,
enlatado, etc. La clorofila b es algo más estable que la clorofila a. Hay que
tener en cuenta que los vegetales son siempre ácidos, y que en el
tratamiento térmico se liberan generalmente ácidos presentes en vacuolas
en las células, y que hacen descender el pH del medio.

15. En la clorofila puede hidrolizarse el enlace éster que mantiene unido el grupo
fitol. Esta hidrólisis está catalizada por el enzima clorofilasa, presente en los
vegetales verdes. La estructura que queda al eliminarse el fitol recibe el
nombre de clorofilida. Su color es semejante al de la clorofila, y
consecuentemente su formación no representa un problema desde ese punto de
vista, e incluso son algo más estables que las propias clorofilas frente a la
pérdida del magnesio
La feofitina es capaz de unir eficientemente iones de Zn o de Cu en el lugar
que ocupaba el magnesio, formando pigmentos estables y de color verde
atractivo. La toxicidad del cobre limita su uso, pero los complejos cúpricos de
clorofilas o clorofilidas están autorizados en la Unión Europea como colorantes
alimentarios en algunos productos.

17. Tomamos una remolacha
cortamos en tajadas bien
delgadas.
Adicionamos en un
beacker que contiene 100
ml de agua destilada.
Colocamos a hervir
durante 20-30 minutos.
Luego que este ebfriado
el extracto procedemos
hacer el filtrado.
Al observar los cambios
de color determinar su
PH con el peachimetro.
Despues gota a gota
agregamos disolucion
de acido acetico al 0,2
N.
Con el peachimetro
determina su PH
nuevamente.
En un tubo de ensayo
agregamos 5 ml del
extracto.
Continuamos
adicionando acido; para
ver si ocurre cambios.
determinar su PH.
Repetimos el
procedimiento; pero con
una disolucion de NaOH
al 0,1 N.
Anotamos los cambios
dados y los PH
producidos.

18. Pigmento Reactivo Observación Imagen
Extracto de
remolacha
Al introducir las
tajaditas de
remolacha al beaker
con agua destilada
hirviendo, a medida
que fue
aumentando la
temperatura estas
fueron presentando
decoloración. para
medir el pH se
utilizó el pH-metro y
el pH de esta
solución fue de 5.90

19. Extracto de
remolacha
Ácido acético
Luego de
agregarle el ácido
acético se
observa una
coloración
amarilla
Y también se le
tomó el pH que
fue de 2.83, lo
cual indica que el
pH es acido.
Extracto de
remolacha
Hidróxido de
sodio
Se observa una
coloración
purpura y su pH
fue de 11.33, lo
cual indica que el
pH es básico.

20. Lo que obtuvimos de la extracción fue la Betanina, un
pigmento que se conocen colectivamente como betalaínas. La
betanina es una sustancia que consiste en el extracto
acuoso de la raíz de la remolacha roja Beta vulgaris. Se
extrae generalmente tras la cocción en agua, y presenta un
color rosado. Las betalaínas y las antocianinas son
mutuamente excluyentes, por lo que cuando se encuentran
betalaínas en una planta, estarán ausentes las antocianinas,
y viceversa.
El pH obtenido del extracto inicial, fue de 5.90, un valor
adecuado, ya que el pH normal de las verduras se encuentra
entre 4.6 y 6.4, lo que hace que se prolongue la conservación
de las verduras e inhiba la reproducción de
microorganismos.

21. Luego al añadir las gotas de ácido acético la solución cambio a
un color amarillo, debido al descenso de su pH a 2,83, lo que
indica que se acidifico aún más. Este cambio ocurrió porque el
ácido acético tiene la capacidad de ceder protones (H+). En
disolución acuosa, el ácido acético puede perder el protón del
grupo carboxilo para dar su base conjugada, el acetato. Su
pKa es de 4,8 a 25 °C, lo cual significa, que al pH
moderadamente ácido de 4,8, la mitad de sus moléculas se
habrán desprendido del protón. Esto hace que sea un ácido
débil.
En el caso de las betalaínas, al ser ionizables en medio ácido,
sufren cambios de color tanto a un pH por debajo de 3.5
pero no se hidrolizan por lo cual se pueden utilizar para
alimentos ácidos. Su máxima estabilidad está entre pH 5 y 6.
Con el NaOH su pH aumento convirtiéndose en una solución
alcalina, pero manteniendo prácticamente el color original.

22. Ensayo 2.2
PIGMENTOS ANTOCIANICOS
FLORES
En un frasco pequeño con
agua; agregamos flores
blancas, azules y rojas.
Colocamos el frasco en una capsula
de petri de mayor tamaño que la base
del frasco.
Vertir en la capsula un poco de
hidroxido de amonio
concentrdo.
Tapamos con un frasco
invertido. para crear una
atmosfera de vapor al rededor
de las flores.
Repetir el procedimiento con
HCl concentrado.
Anotar el cambio de color
en las flores en cada
procedimiento.

24. Las antocianinas identificadas fueron La delfinidina la cual brinda
colores azules a las flores, como el caso de las violetas. Como casi todas
las demás antocianidinas, es sensible a la acidez (pH) del medio, y cambia
de color desde el azul en medios básicos a rojo en soluciones ácidas.
La Peonidina provee a las flores el color purpura-roja. Como la mayoría
de las antocianidinas, es sensible al pH y cambia su color de rojo al azul
cuando su valor de pH sube. Esto se debe a que las antocianidinas son
unos cromóforos altamente conjugados. Cuando el pH cambia se ve
alterado el grado de la extensión de la conjugación (casi el doble), que
también altera la longitud de la onda de la energía luminosa absorbida por
la molécula. (Las antocianidinas naturales son más estables en un
medioambiente de pH bajo; a pH 8.0 la mayoría se convierte incoloro.) A
un pH 2.0, la peonidina posee un color rojo cereza; a un pH 3.0 rosa
amarillento; a un pH 5.0 un morado-rojo como la uva y a un pH 8.0 un azul
profundo; a diferencia de muchos anthocyanidinas,

25. Las Antoxantinas son un tipo de pigmentos Flavonoide, característicos
de las plantas. Son pigmentos solubles en agua con un rango de color
que va desde el blanco o incoloro, hasta el crema o amarillo, a menudo
en los pétalos de las flores. El color de las antoxantinas es
generalmente blanco en medio ácido y amarillo en un medio alcalino.
Estos pigmentos son muy susceptibles a cambios en el color con
minerales y iones metálicos, similar a lo que sucede con las
Antocianinas. Los pétalos blancos de la flor se pusieron amarillos en
presencia de vapores de amoniaco, por su contenido de flavonas y/o
flavonoides.
La reacción del amoniaco con el agua produce iones hidróxido, los
cuales, explican el sabor y demás propiedades de las soluciones
alcalinas.

26. FLORES TRATADAS CON ÁCIDO CLORHÍDRICO (HCL)
CONCENTRADO.

27. Las antocianinas son las responsables de la coloración, rojo azul y violeta.
Su estabilidad está determinada por el grado de oxidación, la
temperatura, la fuerza iónica, la acidez y la interacción con otros
radicales y moléculas complejas. moléculas en las que se produce el efecto
batocrómico, que consiste en que al cambiar la acidez, es decir el pH, se
pasa del rojo anaranjado en condiciones ácidas, como el de la
pelargonidina, al rojo intenso-violeta de la cianidina en condiciones
neutras, y al rojo púrpura-azul de la delfinidina, en condiciones alcalinas.
El pH tiene efecto en la estructura y la estabilidad de las antocianinas. La
acidez tiene un efecto protector sobre la molécula. En soluciones acuosas
a valores de pH inferiores a 2, básicamente la totalidad del pigmento se
encuentra en su forma más estable de ion oxonio o catión flavilio de color
rojo intenso. El ion flavilio es susceptible al ataque nucleofilico por parte
del agua. Este es deficiente en electrones y por lo tanto muy reactivo, lo
que lo hace muy sensible a cambos de pH.

28. Las antocianinas tienen su máxima expresión de color a PH ácidos, y su
forma incolora se produce a pH neutros o alcalinos.
Los cambios de pH son factores muy importantes en determinación de
antocianinas ya que éstas son más estables en un medio ácido que en un
medio neutro o alcalino.
Una de las propiedades más singulares de las antocianinas es su capacidad
para cambiar de color en función del pH, mostrando una amplia gama de
tonos, desde el rojo, pasando por el púrpura o el azul, hasta el amarillo (al
aumentar el pH), de modo que actúan como indicadores naturales del pH.
Esto es debido a que su estructura experimenta una amplia variedad de
transformaciones moleculares en función de la concentración de protones.

29. Ensayo 3.1
SEPARACION DE XANTOFILAS
En una balanza pesar 20 gr
de hojas de espinaca
(spinacea oleracea)
Elimine las nervaduras de
las hojas.
Colocar pedazos de
hojas en un mortero.
Macerar poco a poco
adicionando pequeñas de
hojas y de alcohol etilico
al 90%.
siga macerando hasta
obtener una pasta suave.
Filtre el extracto hasta
obtener una disolucion de
clorofila pura.
Vierta 5 ml del filtrado en
un tubo de ensayo.
Adicione un volumen
adicional ala gasolina.
Tapar con un corcho y
gire el tubo invirtiendolo
suavemente varias
veces.
Observe la separacion
de la xantofila del
extracto de la clorofila.

30. Ensayo N 3 SEPARACION DE XANTOFILAS

31. El alcohol tiene la propiedad de extraer algunas características de los
compuestos con los cuales es mezclado, por esta razón permite la
separación de la xantofila en la disolución.
Al momento de añadirse la gasolina que a su vez permite el arrastre y
separación de clorofila. Ya que este tiene afinidad por algunos
pigmentos como lo es con la clorofila y es llamado separador.

33. • Se determinaron las características físicas y químicas de las
clorofilas y antocianinas La estructura de la moléculas de
clorofila tiene dos partes: un anillo de porfirina (sustituida
con pequeños grupos enlazados, sustituyentes) y una cadena
larga llamada fitol. El anillo de porfirina es un tetrapirrol,
con cuatro anillos pentagonales de pirrol enlazados para
formar un anillo mayor que es la porfirina, el color verde
en los vegetales es debido a la presencia de estos pigmentos
llamados clorofila a y clorofila b. Las antocianinas
pertenecen al grupo de los flavonoides y son glucósidos de
las antocianidinas, es decir, están constituidas por una
molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le
une un azúcar por medio de un enlace glucosídico, son
responsables de una gama muy amplia de colores, desde el
incoloro hasta el púrpura.

34. • Las antocianinas tienen la capacidad para cambiar de color en
función del pH, mostrando una amplia gama de tonos, desde
el rojo, pasando por el púrpura o el azul, hasta el amarillo (al
aumentar el pH), de modo que actúan como indicadores
naturales del pH. Esto es debido a que su estructura
experimenta una amplia variedad de transformaciones
moleculares en función de la concentración de protones. En
medio acido las flores, mantuvieron su color ya que las
antocianinas son más estables en medios ácidos que en
medios alcalinos. En el medio alcalino perdieron su color.
• Se encontraron otros pigmentos llamados betalaínas estos
son metabolitos secundarios de las plantas nitrogenados que
actúan como pigmentos rojos y amarillos. Las betalaínas y las
antocianinas son mutuamente excluyentes, por lo que cuando
se encuentran betalaínas en una planta, estarán ausentes las
antocianinas, y viceversa. A este grupo pertenece la
betanina, responsable del color de la remolacha