La fotosíntesis.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Trabajo Práctico Nº 10
Fotosíntesis. Reacción de Hill
La fotosíntesis es un proceso en virtud del cual los organismos con clorofila,
como las plantas verdes, las algas y algunas bacterias, capturan energía en forma
de luz y la transforman en energía química que la almacenan en las uniones de las
moléculas orgánicas que sintetizan. La fotosíntesis posee una fase lumínica y una
fase oscura (aunque también se produce en presencia de luz)
La fase luminosa, fase clara, fase fotoquímica o reacción de Hill es la primera
etapa, en la cual se obtiene energía química en forma de ATP y NADPH, a partir
de la disociación de moléculas de agua, formando oxígeno e hidrógeno. La energía
creada en esta fase, será utilizada durante la fase oscura, para la sintetizar
glucosa y otros carbohidratos a partir del CO2
La fase luminosa se realiza en la cadena transportadora de e- del cloroplasto, en
los complejos clorofila-proteína que se agrupan en unidades llamadas
fotosistemas que están en los tilacoides (membranas internas) de los
cloroplastos
Objetivo: comprobar la generación de poder reductor durante la fase luminosa
de la Fotosíntesis. Como aceptor final de los electrones de la fotólisis del agua se
empleará un oxidante artificial, 2,6 diclorofenolindofenol (DPIP). Se evaluará el
efecto de diferentes factores (oscuridad, inhibidor de la fotólisis y calor) sobre
la reacción
Fundamentos:
La Reacción de Hill es la reacción fotoquímica en la que los electrones
provenientes de la fotólisis del agua producen la reducción de un oxidante
natural (NADP+) o artificial (2,6 diclorofenolindofenol, sales férricas, etc.)
En este Trabajo Práctico se pondrá de manifiesto la reacción de Hill, que ocurre
en los cloroplastos, para lo que utilizaremos DPIP como oxidante artificial, que en
su forma oxidada es azul y en la forma reducida es incolora. Adicionalmente
pueden observarse burbujas, debido al oxígeno liberado en la reacción
Cátedra de Biología 1

2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
Material:
Material de
laboratorio
Muestra Reactivos
Mortero Hojas de
espinacas
Solución de sacarosa 0,5 M
Baño de Hielo Buffer Fosfato pH 7
Cuchillo Inhibidor
Embudo 2,6 diclorofenolindofenol
Centrífuga con tubos
Gasa
Arena (lavada)
Portalámpara con
lámpara de 75 w
Hielo
Pipeta Pasteur
Papel aluminio
Buffer Fosfato: 0,167 grs K2HPO4 + 0,209 grs KH2PO4, disueltos en 100 ml de
agua
DPIP: 0,2 grs de diclorofenolindofenol disueltos en 100 ml de agua, dejar reposar
24 hs y filtrar
2 DPIP + 2 H2O 2 DPIPH2 + O2
Procedimiento:
A. Aislamiento de cloroplastos
1. Utilizar aproximadamente 8 hojas medianas de espinaca (deben estar bien
verdes y turgentes ), eliminar los pecíolos y la nervadura central y
cortarlas en pequeños trozos. Este procedimiento, así como todos los
demás pasos en los que se utilice la suspensión de cloroplastos, deben
realizarse en baño de hielo y con soluciones frías para conservar la
estructura de las organelas de interés
Cátedra de Biología 2
Luz, cloroplastos

3. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
2. En un mortero colocado en baño de hielo poner las hojas cortadas junto a
una cucharadita de arena (previamente lavada) y 50 ml de solución fría de
sacarosa 0,5 M. Triturar por 2 o 3 min hasta lograr un extractivo de color
verde oscuro
3. Filtrar a través de gasa para eliminar restos vegetales groseros
4. Centrifugar el filtrado en 4 tubos durante 5 min a 2000 rpm para eliminar
el material celulósico. La mayor parte de los cloroplastos quedarán en
suspensión en el sobrenadante
5. Colectar los sobrenadantes y centrifugarlos durante 10 min a 3000 rpm.
Descartar los sobrenadantes y resuspender suavemente los sedimentos
que contienen los cloroplastos en 3 ml de buffer fosfatos de Ph 7 frío,
usando una pipeta Pasteur. Reunir las suspensiones de cloroplastos en un
único tubo ( suspensión A ) mantenido en frío hasta el momento de usar
B.
1. Colocar una suspensión de la suspensión A entre porta y cubreobjetos y
observar al microscopio
2. Tomar 3 ml de la suspensión A y calentar hasta ebullición durante 2
minutos ( Suspensión B)
3. Rotular cinco tubos ( números 1 al 5 ) para ser utilizados según el esquema
siguiente
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
(*)
Tubo 4 Tubo 5
Buffer Fosfato 0,1 M pH
7
7 ml 7 ml 7 ml 7 ml 7 ml
Inhibidor - - - 1 gota -
Suspensión A 1 ml - 1 ml 1 ml 1 ml
Suspensión B - 1 ml - - -
DPIP 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota -
Luz + + - + +
( * ) El tubo 3 debe estar recubierto con papel aluminio antes de colocar los
reactivos
4. Colocar cada uno de los reactivos en el orden listado, manteniendo los tubos en
baño de hielo
Cátedra de Biología 3

4. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Alimentación
Ingeniería en Alimentos
5. Mezclar bien el contenido de los tubos por inversión de los mismos 2 veces.
Para tapar se puede emplear un trocito de polietileno
6. Para exponer los tubos a la luz colocar la gradilla frente a una lámpara de 75 w
durante 10 min
7. Observar si se produjeron cambios de coloración
8. Justifique lo ocurrido en cada tubo
Cuestionario
1. ¿Cuáles son los primeros auxilios en caso de accidente con 2,6
diclorofenolindofenol?
Cátedra de Biología 4