medios de cultivo de referencia

1. Aseguramiento de calidad
CULTIVOS DE REFERENCIA
Norma ISO 17025
Bqca. QM Alicia I. Cuesta,
Consultora Internacional de la FAO

2. Objetivos de la clase
1. Cultivos de referencia: definición y requisitos.
2. Preservación y mantenimiento de cultivos de referencia.
3. Proveedores de cepas de referencia.
4. Manejo y uso de cultivos de referencia

3. Cultivos de referencia:
Cultivos de referencia:
REQUISITO
REQUISITO
Para acreditar o mantener la acreditación de un ensayo,
el laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de
referencia.
El número y la elección del género y especie de las mismas
dependerá
de los ensayos que se efectúan
y las necesidades particulares de estos últimos.

4. Cultivos de referencia:
Cultivos de referencia:
REQUISITO
REQUISITO
SON NECESARIOS PARA DEMOSTRAR
TRAZABILIDAD.
El laboratorio debe elaborar e implementar un
procedimiento documentado para
el uso y manejo de cultivos de referencia.

5. ¿ Para qué son necesarios los
cultivos de referencia ?
)Evaluación de la calidad de los
medios de cultivo.
)Realizar controles de calidad
interno durante la ejecución de
los ensayos.
)Realizar controles de calidad de
reactivos.
)Pruebas confirmatorias.
Ejemplo prueba de CAMP
)Validar métodos.

6. Cultivos de referencia:
Cultivos de referencia:
Definición:
Término colectivo que se refiere
a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.
 Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).
Genéticamente estables.( ESTABILIDAD)
( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas)
Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).
Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperación.
Requisitos:

7. Cultivos de referencia:
Cultivos de referencia:
En todos los casos la manipulación y modo de
conservación de las cepas debe ser tal de prevenir :
)El deterioro de las cepas.
)La contaminación cruzada.
) Mutaciones, deterioro o alteración de las características
típicas de las cepas.
Su crecimiento característico debe ser documentado sobre
cada medio sobre el que se utiliza como cepa control.

8. Definición:
Material de referencia
Material o sustancia que posee valores de una o más
propiedades suficientemente homogéneas y bien
conocidas para permitir su uso en la calibración de
aparatos, la evaluación de un método de medición o la
atribución de valores a estos materiales.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

9. CEPAS DE REFERENCIA:
CEPAS DE REFERENCIA:
PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN
OBTENERSE DIRECTAMENTE DE:
UNA COLECCIÓN NACIONAL O INTERNACIONAL DE
CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.
Son microorganismos definidos:
) Por lo menos a nivel de género y especie.
) catalogados.
) muy caracterizados.
) de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000]
Se comercializan liofilizadas.

10. CEPAS DE REFERENCIA:
CEPAS DE REFERENCIA:
Los organismos de acreditación deben
considerar válida
la fuente de dónde provino la cepa.

11. IMPORTANTE:
En la práctica para cumplir con el requisito
prevenir mutaciones, deterioro o alteración de
las características típicas de las cepas de
el número de repiques
a partir de la cepa de referencia
debe ser limitado
( en general es aceptado hasta 5 repiques a
partir de la cepa de referencia )

12. Si una cepa se adquiere por cualquier vía
que no sea la propia colección,
NO se puede mencionar utilizando el número
que tienen en esa colección,
sino solamente como derivada
de la cepa de colección.

13. Adquisición de
Cepas de referencia:
 1 era opción: Obtención directa a partir de una
colección nacional e internacional reconocida.
 2 da opción: Proveedores comerciales certificados
por ISO que 9001.
Comercializan repiques de cepas de referencia
adquiridas en una colección reconocida. Generalmente
el 3er o 4 repique.
Deben mantener sus recipientes originales.
Requerimiento en la recepción (compra de insumo) :
certificado de origen donde conste el número de repique y
el origen entre otros.

14. Proveedores
de cepas de referencia:
Primera opción:
Algunos ejemplos
‰ATCC (American Type Culture Collection).
‰SVM (Foundation for the Advancement of Public and
Environmental Protection)
‰CECT (Colección española de cultivos tipos).
‰CNCM. (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR
Segundo opción:
Algunos ejemplos
Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan
repiques a partir cepas adquiridas en la colección
reconocida.
Oxoid Companie

16. Cepas de
colección
de
referencia
http://wwwatc.org

17. Definición:
Material de referencia certificado.
Material o sustancia acompañado de un
certificado, que posee valores de una o más
propiedades, certificados por un procedimiento
que establece su trazabibilidad a una realización
exacta de la unidad en la cual se expresan los
valores de dichas propiedades, para el cual cada
valor certificado está acompañado por su
incertidumbre, con un nivel de confianza
establecido.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)

18. Cepas de referencia certificadas:
Definición: Cepas de referencia certificadas es un Material
de referencia certificado biológico.
La colección certifica que ha suministrado una determinada
cepa, que es un cultivo puro, y que se ha caracterizado por
pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares
adecuadas.
Por ser un material biológico surgen dificultades de
certificación

19. Reconstitución
de las cepas de referencia:
) Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de
microbiología se registran en planilla según
procedimiento.
) Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 º C
hasta su uso.
) Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran
utilizando el medio de cultivo, las condiciones de
incubación y el procedimiento indicado en las
instrucciones para cada tipo de microorganismo del
organismo proveedor de las cepas.
) En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un
control de calidad de pureza y viabilidad y se registra.

20. 9Identificación de la
cepa.
9Género y especie del
microorganismo
9TIPO y Nº de colección.
9Nº de lote.
9Fecha de recepción.
9Control de calidad de la
cepa de referencia
Conforme (SI/NO).
9Fecha de caducidad de
la cepa.
9Personal responsable.
REGISTRO DE
CEPAS DE REFERENCIA:

21. Control de calidad de
pureza y viabilidad:
 Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ
QUE HAGO UN REPIQUE.
 Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su
viabilidad y sus caracteres bioquímicos.
Frecuencia de realización de este control: para las
cepas de reserva almacenadas el laboratorio la
establecerá en cada caso.
 En caso de no presentar las características establecidas
se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el
procedimiento.

22. Registro de Control de calidad
de pureza y viabilidad de las cepas:
)Fecha del control.
)Identificación de la cepa. Género y especie del
microorganismo. TIPO y Nº de colección.
)Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).
)Pruebas a realizar (depende del microorganismo):
o Coloración de Gram
o Características de las colonias en medios selectivos
o Pruebas bioquímicas y serológicas.

23. CEPAS DE
CEPAS DE
RESERVA
RESERVA

24. Cepas de reserva:
Cepas de reserva:
Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un
Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un
único
único subcultivo
subcultivo de una cepa de referencia.
de una cepa de referencia.
[ISO 11133-1:2000].
Las cepas de reserva son una serie de alícuotas de
cultivos idénticos obtenidas en el laboratorio por
subcultivo de la cepa de referencia.
CREF
Cres Cres Cres
Cres
Cres
Cres
REPIQUE UNICO
Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

25. Cepas de reserva:
Cepas de reserva:
Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio)
Debe haber un lugar destinado a
almacenar las cepas de reserva.
Debe estar claramente señalado
que se trata de cepas potencialmente peligrosas
y su manipulación restringida
a personal autorizado.

26. A)LIOFILIZACIÓN.
B) CONGELACIÓN
A BAJAS
TEMPERATURAS.
MÉTODOS
PARA
LA PRESERVACIÓN
Y MANTENIMIENTO
DE
CEPAS DE RESERVA
obtenidas a partir
de cepas de referencia :
Uso
de agentes
Crioprotectores

27. A) LIOFILIZACIÓN.
) Definición: es un proceso de desecación desde el
estado congelado.
)Agentes Crioprotectores:
ƒLeche descremada de calidad microbiológica
( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
ƒPueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
PRODUCTO: se puede conservar en refrigeración o a
temperatura ambiente por años.
MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

28. B) CONGELACIÓN A BAJAS
TEMPERATURAS:
)Agentes Crioprotectores:
ƒLeche descremada de calidad microbiológica
( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
ƒPueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
ƒGlicerol al 10%
ƒCaldo BHI con glicerol 20%.
)Proceso de congelación:
Equipamiento o insumos para lograr la congelación:
Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.
MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

29. B) CONGELACIÓN A BAJAS
TEMPERATURAS:
)Proceso de congelación:
Temperaturas de congelación:
Deseable a -70 o -80 º C o menores temperaturas.
A temperaturas más altas como -20 º C no es lo ideal pero tal
vez sea la única forma posible. Es preferible a -40º C.
)Envases: Uso criovial o tubo estéril.
)PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura
congelación por años.
)Inconveniente: problemas y pérdida de las cepas la falta de
suministro de energía, falta de insumos o avería del
equipamiento.
MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

30. LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO
DE
CEPAS DE RESERVA
!! Es muy importante un buen método de conservación de
modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la
cepa microbiana auténtica!!
)Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos
básicos de Microbiología.
)Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de
microorganismo.
)Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.
Evito el crecimiento.

31. FACTORES QUE AFECTAN
LA VIABILIDAD DE LA CEPA
La viabilidad de las cepas, sometidas a un
proceso de congelación
(para su almacenamiento),
está determinada por los siguientes factores:
a) Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram
positivas resisten mejor que las Gram negativas.
b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones
posibles antes de ser expuesto a bajas
temperaturas.

32. FACTORES QUE AFECTAN
LA VIABILIDAD DE LA CEPA
b) Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas
temperaturas:
1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del
microorganismo de sobrevivir.
Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos
resistentes al shock térmico.
Ideal es fin etapa logarítmica principio fase estacionaria tiene
mayor probabilidad de recuperación.
( en bacterias en general es 24 horas de incubación a 37º C)
2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un
papel importante .
Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen
mayor resistencia a la temperatura que aquellas que
desarrollan en un medio sólido.

33. MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y
MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA
Las instrucciones del fabricante de los
sistemas de preservación de cepas
disponibles comercialmente deben ser
rigurosamente respetados y observados.

34. Ejemplo:
Supervivencia de los microorganismos
almacenados a –20º C en Mast Cryobank
Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR
Microorganismo Supervivencia en
meses
Enterobacter aerogenes 48
Pseudomona aeruginosa 18
Salmonella typhimurium 48
Staphylococcus aureus 48
Listeria monocytogenes 48
Listeria ivanovii 48
Rhodococcus equi 48
Bacillus cereus 24
Clostridium perfringes 48

35. Procedimiento:
Cepas de reserva:
Cepas de reserva:
Paso 1:
Los tubos o crioviales
donde se almacenan las
cepas reserva , se rotulan
(previamente
a la inoculación)
Paso 2: El desarrollo
microbiano obtenido, se
inocula asépticamente en el
medio líquido sobrenadante
que contienen los crioviales.
Paso 1: Información en cada
criovial:
•Identificación de la cepa
• Tipo y Nº de colección
• Nº de repique.
•Fecha de realización del C res.
•Fecha de vencimiento del
criovial.
• Nº de tubo o criovial.

36. REGISTRO DE
CEPAS DE
RESERVA
Identificación de la cepa.
Género y especie del
microorganismo.
9TIPO y Nº de colección.
9Nº de Lote Cepa referencia.
9 Nº de criovial o vial.
9Fecha de reconstitución de
la Cepa referencia.
9Nº de repique.
9Frasco en uso.
9Fecha de baja criovial.
9Ubicación de
almacenamiento.
9Observaciones

37. Procedimiento:
Cepas de reserva:
Cepas de reserva:
Paso 3:
Congelar o liofilizar la Cres
Paso 4:
Manipulación de la Cres para obtener cepas de trabajo Ct
IMPORTANTE!! Para cepas congeladas de crioviales este
paso se debe realizar de manera de prevenir el
descongelamiento y la contaminación del criovial
(Cres), mediante el traslado en caja termostatizada del
mismo y repique en campana de flujo laminar.

38. Procedimiento:
Cepas de reserva:
Cepas de reserva:
9 En el caso de descongelamiento de las cepas de
reserva no deben volver a congelarse.
9 El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.
9 Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes
crioprotectores, se usan, se descongelan y no se
pueden volver a congelar ni a usar.
9 Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se
pueden volver a usar.

39. Cepas de trabajo:
Cepas de trabajo:
Subcultivos
Subcultivos de microorganismos obtenidos a
de microorganismos obtenidos a
partir de las cepas de reserva para ser
partir de las cepas de reserva para ser
utilizados en los ensayos que lo precisen.
utilizados en los ensayos que lo precisen.
Obtención de cepas de trabajo:
)Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas
de reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo
adecuado utilizando un ansa estéril e incubando en
condiciones adecuadas.
) Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.

40. Esquema
de cultivos
de
referencia:
*Controles
de pureza y
pruebas
bioquímicas
de la cepa.
CEPA DE REFERENCIA
CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS
(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)
Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento
OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA
CEPAS DE TRABAJO
(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE
LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y
CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
*
Reconstitución
(Sólo se acepta un único repique)
*
Descongelación / reconstitución
*
Se
subcultiva
una sola
vez.
CEPA DE REFERENCIA
CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS
(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)
Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento
OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA
CEPAS DE TRABAJO
(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)
UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE
LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y
CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
*
Reconstitución
(Sólo se acepta un único repique)
*
Descongelación / reconstitución
*
Se
subcultiva
una sola
vez.
Se
subcultiva
una sola
vez

41. PASOS a seguir para
el manejo de los cultivos de referencia:
) Adquisición de cepa de referencia (C Ref):
- Requisitos de compra y Registro de la
cepa adquirida.
) Subcultivo de C Ref:
- Control de pureza y viabilidad
(REGISTRO).
) Preparación de la cepa de reserva (Cres)
- Control de pureza y viabilidad periódicos
(REGISTRO).
- Registro de cada frasco de la nueva
cepa de reserva Incorporada al cepario.
PROVEEDOR DE CEPA
LABORATORIO
LABORATORIO

42. PASOS a seguir para
el manejo de los cultivos de referencia:
)Subcultivo la cepa de reserva (C t):
-Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
USO PARA CONTROLES DE CALIDAD
CONDICIONES CONTROLADAS DE
ALMACENAMIENTO
DE LA CEPA DE RESERVA
LABORATORIO
LABORATORIO

43. Síntesis final
El laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de
referencia.
Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para:
Evaluar la calidad de los medios de cultivo, aseguramiento
de la calidad de los resultados de ensayo y validación de
métodos microbiológicos.
Es necesario contar e implementar un procedimiento para
el manejo de cultivos de referencia, asegurar la
trazabilidad y el origen de la cepa, así como conocer las
características de las cepas usadas en los ensayos de
modo que mantengan su viabilidad y sus caracteres
bioquímicos.

44. NECESITAMOS UN DESCANSO!!!
NECESITAMOS UN DESCANSO!!!