Este documento proporciona instrucciones para realizar controles de calidad periódicos de espectrofotómetros, incluyendo la verificación de la exactitud de la longitud de onda, la exactitud fotométrica, la linealidad fotométrica, la detección de luz parásita y la precisión fotométrica. Los procedimientos implican medir absorbancias de soluciones estándar y comparar los valores obtenidos con rangos de referencia para garantizar un funcionamiento óptimo del instrumento.

1. 1
Equipos de Precisión Fotométrica:
Espectrofotometros, Fotometros,
Lectores de Elisa
Introduction
 El espectrofotómetro se usa
en el laboratorio con el fin de
determinar la concentración
de una sustancia en una
solución, permitiendo así la
realización de análisis
cuantitativos
Control de Calidad
El objetivo de esta guía consiste en que el
usuario cuente con los materiales necesarios
para la evaluación del funcionamiento del
espectrofotómetro, y de esta manera, pueda
verificar si los parámetros fotométricos se
encuentran dentro de los rangos de
aceptabilidad establecidos de acuerdo a las
normativas internacionales.
Se deberán llevar registros que certifiquen
dichos controles.
Los estándares de calidad del instrumental
deberán cumplirse y por el contrario si algún
parámetro estuviera fuera de rango, es
conveniente realizar la reparación del
instrumento a través de un servicio técnico
acreditado y luego volver a verificar el buen
funcionamiento.

2. 2
CONTROL DE LA EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA
NO APTO PARA FOTOCOLORÍMETROS NI AUTOANALIZADORES
• Frecuencia del control: semestral
El control se podrá realizar en espectrofotómetros con selector
continuo de longitudes de onda, no así en fotocolorímetros de filtro
ni en autoanalizadotes, ya que en estos no se pueden realizar
espectros de barrido.
• Definición: Grado de concordancia entre la longitud de onda que
indica el seleccionador y la longitud de onda de referencia
requerida. Se expresa en nm.
• Fundamento: Se utiliza el método del punto isosbéstico: el rojo
Congo tiene la particularidad que los espectros de las formas ácida
y básica del colorante en igual concentración presentan la misma
absorbancia a una longitud de onda denominada "punto
isosbéstico" (PI). Esta longitud de onda es independiente de la
concentración del colorante y de la temperatura de trabajo por lo
cual resulta un parámetro fijo de referencia. Si el punto isosbéstico
hallado experimentalmente difiere del teórico, indica que existe un
corrimiento en la longitud de onda.
Control de Calidad
• Procedimiento
El estudio consta de 3 pasos:
a) Preparación de las formas ácida y
alcalina del colorante
b) Realización del espectro de barrido
c) Interpretación de resultados: gráfico del
espectro para hallar el PI
• Reactivos requeridos
Solución de Rojo Congo 14 mg/L
HCl 2,5 N
NaOH 2,5 N
Control de Calidad
a) Preparación de las formas ácida A y alcalina B
del colorante.
Alicuotar con una misma pipeta 5 mL de
solución de Rojo Congo 14 mg/L en dos tubos
de ensayo rotulados A y B.
Solución A: al tubo A agregarle 20 uL de la
solución de HCl 2,5 N
Solución B: al tubo B agregarle 20 uL de la
solución de NaOH 2,5 N
Usar una única micropipeta para dispensar los 20
uL.
Las soluciones A y B una vez preparadas son
estables 1 hora a temperatura ambiente.
Control de Calidad
b) Realización del barrido
espectrofotométrico de las soluciones
A y B entre 520 y 570 nm.
Se deberá realizar el espectro de las
soluciones A y B contra agua
destilada. Se puede trabajar a
temperatura ambiente ya que el punto
isosbéstico es independiente de la
temperatura entre 4°C y 45 ºC.
Se recomienda proceder de la
siguiente manera:
b1) Método manual para espectrofotómetros con cubetas de caras paralelas
de 1 cm de espesor. (Método que utiliza una cubeta)
b2) Método manual para espectrofotómetros con cubetas de caras paralelas
de 1 cm de espesor. (Método que utiliza tres cubetas)
b3) Método para los espectrofotómetros con microcubetas y bomba de
succión.

3. 3
Control de Calidad
b1) Método manual para
espectrofotómetros con cubetas
de caras paralelas de 1 cm de
espesor. (Método que utiliza una
cubeta)
Llenar una cubeta con agua
destilada y ajustar el cero de
absorbancia a 520 nm. El regulador
de absorbancias no se tocará más
durante toda la experiencia.
Leer y registrar las absorbancias a
las longitudes de onda indicadas en
la tabla provista.
Vaciar y llenar la misma cubeta con
la solución A repitiendo el mismo
barrido.
Vaciar, enjuagar con agua destilada
y llenar la misma cubeta con la
solución B repitiendo el mismo
barrido.
Control de Calidad
b2) Método manual para
espectrofotómetros con cubetas de
caras paralelas de 1 cm de espesor.
(Método que utiliza tres cubetas)
Elegir 3 cubetas iguales, sin rayaduras y
perfectamente limpias. Llenar una con
agua destilada y las otras con las
soluciones A y B respectivamente.
Ajustar el cero de absorbancia a 520 nm
con la cubeta que tiene el agua
destilada. Retirar dicha cubeta y medir la
absorbancia de la solución A, y luego de
la solución B registrando los valores en
la tabla directamente como Abs. netas.
Control de Calidad
Seleccionar luego 525 nm y repetir los
pasos anteriores, es decir, ajustar
primero el cero con agua destilada y
luego leer las soluciones A y B. Repetir
estos pasos a cada una de las
longitudes de onda indicadas en la tabla
adjunta, llevando a cero con la cubeta de
agua destilada en cada longitud de onda.

4. 4
Control de Calidad
b3) Método para los
espectrofotómetros con microcubetas
y bomba de succión.
Aspirar agua destilada y ajustar a cero de
absorbancia a 520 nm. El regulador de
absorbancias no se tocará más en toda la
experiencia.
Mover el selector de longitudes de onda
hacia los 570 nm realizando el espectro
del agua tal como se indica en la tabla
adjunta, registrando todos los valores de
absorbancia.
Vaciar la cubeta y aspirar la solución A
realizando el mismo barrido.
Vaciar la cubeta, enjuagar pasando agua
destilada y aire y aspirar la solución B
realizando el mismo barrido.
Control de Calidad
Nota: para realizar el barrido del agua
destilada en los métodos b1 y b3 se
recomienda empezar llevando a cero
de absorbancia a 520 nm con el fin de
tener todas las absorbancias positivas.
Si el espectro del agua da valores
negativos comenzar a otra longitud de
onda de manera tal de no tener valores
negativos de absorbancias ya que
finalmente será restado el espectro del
agua punto a punto del de las
soluciones A y B.

5. 5
Gráfico del Punto Isosbéstico
del Rojo Congo.
CONTROL DE LA EXACTITUD
FOTOMÉTRICA
APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS, FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
• Definiciones: La exactitud fotométrica es el grado de concordancia
entre la absorbancia real y la absorbancia medida. El error cometido
al leer una absorbancia respecto de una de referencia se denomina
entonces "inexactitud fotométrica".
• Frecuencia del control: mensual
• Fundamento: El estudio de la exactitud fotométrica consiste en la
medición de absorbancias de soluciones certificadas y en la
comparación de los valores hallados con los de referencia. Las
soluciones comúnmente usadas como estándares de absorbancia
son: (9 -13):
CONTROL DE LA EXACTITUD
FOTOMÉTRICA
APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS, FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
 340 nm: soluciones de dicromato de potasio en HClO4 0,001N
con absorbancia certificada
 405 nm: soluciones de p-nitrofenol en NaOH 0,1N con
absorbancia certificada o soluciones de sales de Ni(H2O)6
+2 con
absorbancia certificada.
 505 nm: soluciones de sales de Co(H2O)6
+2 en SO4H2 0,47N
con absorbancia certificada
 540 nm: soluciones de cianmetahemoglobina con absorbancia
certificada

6. 6
CONTROL DE LA EXACTITUD
FOTOMÉTRICA
Procedimiento
Se deberá medir la absorbancia de las soluciones y
comparar dicho valor con los que figuran en los
certificados correspondientes.
Seleccionar la temperatura de trabajo.
Seleccionar la longitud de onda.
Realizar un blanco con agua destilada. Realizar todas las
medidas por duplicado.
Nota: En el anexo A figuran los diferentes procedimientos para las
lecturas de las absorbancias de acuerdo al tipo de instrumento:
espectrofotómetro o fotocolorímetro manual, con bomba de
aspiración o equipos automáticos. Utilizar dicho anexo como guía
para la realización de las medidas.
CONTROL DE LA EXACTITUD
FOTOMÉTRICA
• Resultados
Estudio de exactitud fotométrica:
Calcular la inexactitud fotométrica como la diferencia entre la absorbancia
promedio hallada y el valor de referencia que se detalla en los certificados
respectivos.
• Límites de aceptabilidad:
Exactitud fotométrica óptima: error entre +/- 2%
Exactitud fotométrica aceptable: error entre +/- 3%
CONTROL DE LA EXACTITUD
FOTOMÉTRICA
• Ejemplo:
- Longitud de onda: 505 nm
- Temperatura: 30 ºC
- Absorbancia contra agua destilada de ampolla B2:
Medida 1: 0,315
Medida 2: 0,313
- Absorbancia promedio hallada : 0,314
- Absorbancia de referencia, 30ºC, 505 nm (según certificado): 0,323
Por lo tanto, la inexactitud del instrumento a dicha longitud de onda está dentro
de los límites aceptables.

7. 7
CONTROL DE LA LINEALIDAD
FOTOMÉTRICA
APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS, FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
• Definiciones: Capacidad de respuesta lineal de un espectrofotómetro a
diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla la ley de Beer.
• Frecuencia del control: trimestral
• Fundamento: El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el
rango de absorbancias en el que el instrumento tiene respuestas
proporcionales a los cambios de concentración (14-16).
• Procedimiento
Se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones
crecientes y contrastar dichos valores con los de referencia que figuran en los
certificados correspondientes.
Seleccionar la temperatura de trabajo.
Seleccionar la longitud de onda: se realiza a las mismas longitudes de onda
utilizadas para el control de exactitud fotométrica.
Realizar un blanco con agua destilada. Realizar todas las medidas por
duplicado.
CONTROL DE LA LINEALIDAD
FOTOMÉTRICA
Resultados
Graficar las absorbancias promedio halladas (eje y) en función de
las absorbancias de referencia (eje x). Se obtendrá un gráfico del
siguiente tipo:
Ejemplo:
Longitud de onda: 340 nm
Temperatura: 25 ºC.
CONTROL DE LA LINEALIDAD
FOTOMÉTRICA

8. 8
CONTROL DE LA PRESENCIA DE
LUZ PARÁSITA
APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS, FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
• Definición: Se denomina luz parásita a toda radiación
electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el
monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda
registrada por el instrumento.
• Fundamento: este control se basa en la medida del porcentaje de
transmitancia de una solución de nitrito de sodio 50 g/L. Esta
sustancia tiene la propiedad de que sus soluciones absorben toda la
radiación incidente de longitudes de onda menores a los 390 nm, por
lo que se la denomina ópticamente opaca a la luz. Por lo tanto, la
transmitancia a 340 nm de esta solución debe ser igual a cero y toda
transmitancia detectada se corresponde con luz parásita (17-20).
• Materiales necesarios
Solución de NaNO2 50 g/L
CONTROL DE LA PRESENCIA DE
LUZ PARÁSITA
• Procedimiento
- Temperatura de trabajo: La transmitancia de la solución es
independiente de la temperatura entre 10 y 40 ºC
- Longitud de onda: 340 nm
Realizar un blanco con agua destilada. Realizar las medidas por
duplicado.
Si el instrumento permite medir transmitancias, realizar directamente
la medición de la transmitancia de la solución calibrando el 100 % T
con agua destilada.
• Resultados
El valor de transmitancia porcentual es definido como la luz parásita
existente en la zona espectral.
Luz parásita = TRANSMITANCIA % = 10 (2 - absorbancia)
CONTROL DE LA PRESENCIA DE
LUZ PARÁSITA• Ejemplo:
Absorbancia = 2.300 UA corresponde una T % = 0,5%
• Límites de aceptabilidad:
• Luz parásita óptima: T% menor del 0,5%.
(absorbancia mayor a 2.300 UA).
Luz parásita aceptable : menor del 1%.
(absorbancia mayor a 2.000 UA)
Nota: Puede suceder que la absorbancia leída supere el valor máximo de registro del instrumento. Por
ejemplo, hay muchos aparatos que no pueden leer absorbancias superiores a 2.000 UA y al superar
este valor el instrumento no indica lecturas o indica error. En estos casos sòlo podrá calcular el%T
reemplazando en la fórmula anterior la absorbancia por el valor máximo que lee el instrumento:
Ejemplo:
Absorbancia leída a 340 nm: supera el límite de 2.000 UA del
espectrofotómetro. Esto significa que la absorbancia es mayor que 2.000
UA. En este caso:
• %T = 10 (2-A) = 10 (2-2) = 10 0 = 1,0%
• Por lo tanto, el %T, o sea, la luz parásita presente es menor al 1,0%
cuando la absorbancia es mayor que 2.000 UA.

9. 9
CONTROL DE LA PRECISIÓN
FOTOMÉTRICA
APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS, FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
• Definición: Se denomina precisión fotométrica a la medida de la
dispersión de una serie de mediciones de transmitancia o
absorbancia alrededor de la media y se expresa como coeficiente de
variación porcentual.
• Materiales necesarios: se puede utilizar cualquier solución, ya que
no es necesario conocer el valor de la absorbancia. Sólo se necesita
que la absorbancia de la solución permanezca estable en el tiempo.
Por ejemplo: se puede utilizar una solución de sulfato cúprico en
medio ácido para 650 nm.
CONTROL DE LA PRECISIÓN
FOTOMÉTRICA
CONTROL DE LA PRECISIÓN
FOTOMÉTRICA
• Procedimiento
- Longitud de onda: 650 nm o la más cercana (preferentemente
superior) que el instrumento permita.
- Temperatura de trabajo: es preferible seleccionar la temperatura a
la que habitualmente trabaja a esta longitud de onda.
Realizar un blanco con agua destilada y proceder a medir 10 veces
la absorbancia de la solución de la siguiente manera:
1) Espectrofotómetros o fotocolorímetros manuales: cargar una
cubeta con la solución y leer la absorbancia. Retirarla del
portacubetas y volver a colocar la cubeta en la misma orientación,
registrando nuevamente el valor de la absorbancia. Repetir el
procedimiento hasta obtener 10 medidas.
2) Instrumentos con bomba de aspiración: realizar el blanco con
agua. Aspirar la solución y registrar la absorbancia. Aspirar
nuevamente y volver a registrar. Repetir hasta obtener 10 lecturas.
CONTROL DE LA PRECISIÓN
FOTOMÉTRICA
• Procedimiento
3) Autoanalizadores: cargar una copa de reacción con agua y leer
el blanco. Retirar el agua y cargar la solución y leer la absorbancia.
Volver a leer la absorbancia de la solución de la misma copa de
reacción 9 veces más para completar 10 lecturas.
Nota: el valor absoluto de la absorbancia de esta solución no es importante ya
que no es una solución de referencia para determinar exactitud de la
absorbancia, por lo que no se indica cuál es la absorbancia de referencia. Sólo
es importante el valor del coeficiente de variación porcentual obtenido como
índice de la imprecisión de las lecturas.

10. 10
CONTROL DE LA PRECISIÓN
FOTOMÉTRICA
• Resultados
Se tendrán 10 resultados de absorbancia.
Calcular la media aritmética X y la desviación estándar DE de dichas
absorbancias.
Finalmente obtener el coeficiente de variación porcentual:
Límites de aceptabilidad:
Precisión óptima: CV% menor de 0,5%
Precisión aceptable: CV% menor de 1%
• Ejemplo: Se obtuvieron las siguientes lecturas del sulfato cúprico a 650nm:
0,224, 0,224, 0,225, 0,223, 0,225, 0,226, 0,223, 0,224, 0,227, 0,222.
La media de las 10 medidas es: X = 0,224
La desviación estándar será: DE = 0,0015
Por lo tanto, el CV% será:
CV% = (0,0015/0,224) x 100 = 0,67%, que supera el límite óptimo pero
sigue siendo aceptable.
CONTROL DE LA ESTABILIDAD
FOTOMÉTRICA
• APTO PARA ESPECTROFOTÓMETROS,
FOTOCOLORÍMETROS Y
AUTOANALIZADORES
• Definición: Se denomina estabilidad
fotométrica a la capacidad del instrumento de
mantener constante la absorbancia en función
del tiempo.
Cuando se producen variaciones constantes y
contínuas hacia valores superiores o
inferiores de absorbancia se habla de deriva
fotométrica y cuando se producen variaciones
al azar se está en presencia de ruido
fotométrico.
• Materiales necesarios
Solución de dicromato de potasio 50 g/L en
medio perclórico (0,001 N)
CONTROL DE LA ESTABILIDAD
FOTOMÉTRICA
• Procedimiento
- Longitud de onda: 340 nm.
- Temperatura de trabajo: es preferible seleccionar la temperatura a la
que habitualmente se trabaja a esta longitud de onda.
Espectrofotómetros o fotocolorímetros
Realizar un blanco con agua destilada.
Medir la absorbancia de la solución de dicromato.
En este momento poner en marcha un cronómetro y registrar la
absorbancia cada 30 segundos durante 10 minutos sin variar ninguna
condición de la medida. Por lo tanto, al cabo de 10 minutos se tendrán
21 valores.
Autoanalizadores:
Cargar una copa de reacción con agua y leer el blanco. Retirar el agua
y cargar la solución de dicromato y leer la absorbancia. Volver a leer la
absorbancia de la solución de la misma copa de reacción cada 30
segundos durante 5 minutos. Se tendrán así 11 valores.
Nota: en equipos automáticos se estudia la estabilidad en un menor tiempo
de acuerdo a sus características de trabajo.

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CONTROL DE LA ESTABILIDAD
FOTOMÉTRICA
• Resultados
Se graficarán los 21 valores de absorbancia en función del tiempo
determinando si existe deriva o ruido fotométrico
Cálculo de la deriva: este parámetro se define como la pendiente de la
curva de absorbancia vs tiempo y se expresa como porcentaje del
valor inicial de absorbancia.
Ejemplo: Se obtuvieron las siguientes medidas: 0,400, 0,400, 0,401,
0,401, 0,400, 0,401, 0,401, 0,402, 0,402, 0,402, 0,402, 0,403, 0,403,
0,402 0,403, 0,404, 0,404, 0,403, 0,404, 0,405, 0,405.
Si se supone un ruido despreciable, el valor de la deriva será:
CONTROL DE LA ESTABILIDAD
FOTOMÉTRICA
• Cálculo del ruido: este parámetro se calcula como la dispersión de los
valores alrededor del valor medio de absorbancia multiplicando por
100 para expresar como porcentaje. En el caso que la deriva sea
despreciable se calcula como:
Límites de aceptabilidad:
Estabilidad óptima: ruido + deriva menor de 0,5%
Precisión aceptable: ruido + deriva menor de 1%