Este documento describe un estudio de laboratorio sobre el aislamiento y observación de microorganismos simbióticos de suelo rizosférico de plantas de fríjol y café. Se aislaron bacterias del género Rhizobium de nódulos de raíces de fríjol y se observaron esporas de hongos micorrízicos arbusculares en suelo rizosférico de café. Adicionalmente, se discuten los beneficios de las asociaciones simbióticas entre plantas, bacterias fijadoras de nitró

1. UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL DEL TÁCHIRA
VICERRECTORADO ACADÉMICO - DECANATO DE POSTGRADO
MAESTRÍA EN AGRONOMÍA PRODUCCIÓN VEGETAL
Técnicas Avanzadas de Laboratorio 2016-B
AISLAMIENTO Y OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS SIMBIÓTICOS
DE SUELO RIZOSFÉRICO DE PLANTAS DE FRÍJOL (Phaseolus vulgari L.) y
CAFÉ (Coffea arabica L.)
Vázquez Chacón Jose Yvanosky. Laboratorio de Biofertilizantes. UNET.
RESUMEN
Las relaciones simbióticas que ocurren en la rizósfera, como las bacterias del género
Rhizobium, y hongos del genero Glomeromycota, que constituyen Micorrizas Arbusculares,
permite asociaciones mutualistas en beneficio de los cultivos agrícolas. En esta actividad de
laboratorio se aislaron bacterias y hongos de plantas de fríjol (Phaseolus vulgaris L.) y
muestras de suelo rizosférico previamente inoculado de plantas de Café (Coffea arabica L.).
Para el aislamiento de nódulos se siguió la metodología de Ferrara et al. (1993), para el
aislamiento y cuantificación de esporas micorrízicas en la rizósfera se utilizó la metodología
indicada por Sánchez (2007) y para la separación de las esporas se utilizó la metodología de
centrifugación en sacarosa descrito por Sierverding (1991). Se determinó la presencia de
baterías del tipo Gram - relacionadas con el género Rhizobium, así mismo, se logró
visualizar esporas de micorrizas arbusculares presentes en muestras de suelo rizosférico.
Palabras clave: simbiosis, micorrizas arbusculares, nódulos, Rhizobium.
INTRODUCCIÓN
La microbiota del suelo juega un papel
fundamental en la regulación de los
agroecosistemas terrestres, influyendo en
la productividad, diversidad y estructura
de las comunidades vegetales (Van Der
Heijden et al., 2008). Algunos de ellos
pueden ser utilizados como inoculantes
para beneficiar a las plantas, ya que
desarrollan actividades que involucran la
promoción de su crecimiento y su
protección. Las asociaciones de
Rhizobium-micorrizas arbusculares (MA)
actúan sinérgicamente en los niveles de
infección, nutrición mineral y crecimiento
de las plantas (Spagnoletti et al., 2013).
Entre los procesos simbióticos que ocurren
en el suelo destaca la simbiosis rhizobium-
leguminosas, como resultado de una
interacción muy específica entre la
bacteria y la planta. Este proceso,

2. desarrollado en la rizosfera de la planta, se
genera con la formación del nódulo en las
raíces, inducido por un “intercambio de
señales” entre el microsimbionte (bacteria)
y el macrosimbionte (planta) (Baca et al.,
2000). En el interior de estas estructuras se
localizan las bacterias fijadoras de
nitrógeno, el Rhizobium, que es capaz de
reducir el N en NH que la planta utiliza, a
cambio la planta le proporciona fuente de
carbono para su crecimiento. Esta
simbiosis representa un modelo biológico
muy interesante desde el punto de vista
económico, que ha abierto un campo de
aplicación sumamente prometedor en la
agricultura (Baca et al., 2000).
Se estima que, actualmente, la FBN es de
200 millones de toneladas por año, es
decir, dos veces la producción de
fertilizantes nitrogenados producidos por
síntesis industrial. Una de las simbiosis
más efectivas es la que se establece entre
Bradyrhizobium japonicum-soya, donde
un 70% de FN por la bacteria es asimilada
por la planta. En Brasil se ha empleado con
éxito la fertilización biológica de soya con
B. japonicum y 0% de aporte de N como
fertilizante químico, ello ha conducido a
que este país sea el segundo productor de
soya a nivel mundial (Baldoni et al.,
1997).
Con respecto a las micorrizas arbusculares
(MA), son asociaciones ecológicamente
mutualistas que se establecen entre un
selecto grupo de hongos (Glomeromycota)
y la gran mayoría de las plantas.
Aproximadamente un 80% de las familias
de plantas existentes tienen la
potencialidad de formar este tipo de
asociación (Cuenca et al., 2006).
Actualmente son bien conocidos los
efectos beneficiosos de las MA, los cuales
comprenden la mayor absorción de
elementos poco móviles en el suelo como
el fósforo, cobre y zinc por parte de las
plantas micorrizadas en comparación con
las no micorrizadas (Smith y Read, 1997).
Por otra parte, debido al uso eficiente que
realizan las plantas micorrizadas de los
nutrientes del suelo, se consigue ahorrar
fertilizantes sintéticos y reducir por
consiguiente los problemas de
contaminación que su uso conlleva.
Asimismo, son capaces de mejorar la
asimilación de los fertilizantes orgánicos,
ya sea por la producción de fosfatasas por
parte del hongo (Dodd et al., 1987; Joner
y Johansen, 2000), o por medio de la
asociación presente entre las hifas de las
MA y los microorganismos que participan
en la mineralización de la materia orgánica
(Azcón-Aguilar & Barea, 1992). Su papel
en la consolidación de la estructura del
suelo es bien conocido, gracias a la
constitución de agregados estables por
medio del micelio externo de las MA
(Miller y Jastrow, 2000).
Las nuevas tendencias del manejo
agroecológico están encaminadas al uso de
tecnologías amigables con el medio
ambiente. El uso de microorganismos
simbióticos que ayuden a los cultivos

3. agrícolas, ya sea en la fijación del
nitrógeno atmosférico, como los
Rhizobium, o el uso de Micorrizas
Arbusculares, que promuevan la absorción
de nutrientes, resistencia a condiciones
adversas, mejorar los procesos
fotosintético y absorción de agua entre
otros, son estrategias que promueven la
agricultura sustentable, integrando
prácticas agrícolas, haciendo uso eficiente
de los recursos, mejorando la economía del
productor y aumentado su calidad de vida
(Jeffries y Barea, 2001).
En efecto, el objetivo de la presente
actividad de laboratorio es el aislamiento y
observación de microorganismos
simbióticos de suelo rizosférico en plantas
de fríjol (Phaseolus vulgari L.) y muestras
de suelo rizosférico previamente
inoculado de plantas de Café (Coffea
arabica L.).
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección de muestras
Plantas de fríjol (Phaseolus vulgaris L.)
noduladas fueron recolectadas por
personal del Laboratorio de
Biofertilizantes UNET, provenientes de un
cultivo manejado en condiciones
agroecológicas. Las muestras sembradas
en bolsas de polietileno, fueron
mantenidas húmedas y a temperatura
ambiente, hasta el aislamiento del
Rhizobium. Para el aislamiento y
observación de esporas micorrízicas en la
rizósfera, se utilizó muestra de suelo
rizosférico de una planta de Café (Coffea
arabica L.) inoculada al momento de la
siembra con Penicilluin rugulosum (cepa
IR, disolvente de fosfato) y Trichoderma
sp. (cepa VP).
Aislamiento y Purificación de los
Rhizobium
La metodología utilizada para el
aislamiento de las cepas a partir de los
nódulos se ajustó a la descrita por Ferrara
et al. (1993). Se procedió a lavar las raíces
de la planta con abundante agua corriente.
Varios nódulos bien desarrollados fueron
obtenidos de la planta seleccionada (Fig.
Nº 1). Los nódulos previamente
identificados fueron desinfectados dos
veces consecutivas con alcohol por 10
segundos y ADE por 10 segundos.
Posteriormente son tratados con
Cloramina T (2 gr/100 ml) durante 1
minuto, y lavados en agua destilada seis
veces. Usando instrumentos flameados y
operando cerca de la llama, en Cámara de
Flujo Laminar, los nódulos fueron
seccionadas por el centro y traspasados a
una suspensión de ADE. En condiciones
de esterilidad, el aislamiento se efectuó
mediante siembra por agotamiento en un
medio de cultivo ELMARC (Extracto de
levadura manitol agar rojo Congo) según
(Ferrara 1993). Las cápsulas sembradas
fueron incubadas a 28 ºC (24-48 h). Con el
fin de facilitar las observaciones
microscópicas se realizó la Coloración de

4. Gram (Cristal Violeta, Lugol, Alcohol
Cetona y Safranina), según (Bergeys
1959).
Fig. Nº 1. Nódulos seleccionados de raíces de
fríjol (Phaseolus vulgaris L.)
Aislamiento y observación de esporas
micorrízicas en la rizósfera
Para el aislamiento y cuantificación de
esporas micorrízicas en la rizósfera se
utilizó el método descrito por Sánchez
(2007) y para la separación de las esporas
se utilizó el método de centrifugación en
sacarosa descrito por Sierverding (1991).
Al respecto, se procedió a colocar 50 gr de
suelo rizosférico en un recipiente
contentivo de 1000 ml de agua destilada,
agitando por 5 minutos y reposo de 3
minutos. En el aislamiento de las esporas
se utilizó el método de tamizado húmedo
doble, usando una serie de tamices de 500-
44 µm, decantando en un tubo de
centrifuga (50 ml) la cantidad de 20 ml de
la solución tamizada. Para el proceso de
separación de las esporas se realizó una
centrifugación en un gradiente sacarosa al
50% (w/v). Inicialmente la muestra de 20
ml de la solución tamizada es centrifugada
a 1800 rpm por 2 minutos, luego se
procede a eliminar el sobrenadante y se
adicionó una solución de sacarosa (50%
w/v). Se procedió a centrifugar de nuevo a
1800 rpm por 2 minutos. Finalmente, de la
muestra centrifugada y detectado el anillo
central del gradiente de la disolución en el
tubo de centrifuga, se extrae
cuidadosamente una muestra de 4-6 ml
para ser observada el microscopio.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Aislamiento y Purificación de los
Rhizobium
La presencia de comunidades bacterianas
con capacidad de nodulación de plantas
hospedera, es un indicio de las adecuadas
condiciones agroecológicas del cultivo
(humedad, concentración de nutrientes,
materia orgánica, humedad, aireación,
entre otros) (Moreira, 2011). De la muestra
aislada, purificada y coloreada, se
procedió a realizar la observación por
medio del Microscopio Óptico (10x y
40x), identificando un grupo de bacterias
(Fig. Nº 2) perfectamente coloreadas con
la Tinción de Gram (Gram -), bacilos
cortos, no esporulados y formando
colonias, morfología correspondiente con
la presentada por todos los rhizobia.
Dentro del grupo de los rizobios se
agrupan bacterias que difieren en cuanto a
sus características morfológicas, culturales
y fisiológico-bioquímicas; de ahí que
existan nueve géneros. Los más conocidos

5. son: Azorhizobium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Rhizobium y
Sinorhizobium (Lloret y Martínez-
Romero, 2005).
En la descripción del fenotipo de las
bacterias formadoras de nódulos en plantas
leguminosas se reportan características
morfológicas y de colonias, bioquímicas,
fisiológicas, patrones de utilización de
fuentes de carbono y nitrógeno y
resistencia a antibióticos, entre otras. Estos
datos se evalúan normalmente por un
análisis de agrupamiento, la taxonomía
numérica, lo cual puede ofrecer una visión
detallada de la variación de las bacterias
dentro de una especie o entre diferentes
especies y reconocer rasgos característicos
de cada especie (Bécquer, 2002). No
obstante, el objetivo de la presenta práctica
se cumplió al lograr aislar, purificar e
identificar bacterias formadoras de
nódulos del material estudiado fríjol
(Phaseolus vulgaris L.).
Fig. 2. Bacterias Gram -, de tipo baciliforme,
no esporulado, en colonias, aisladas de los
nódulos de Frijol (Phaseolus vulgaris L.)
Aislamiento y observación de esporas
micorrízicas en la rizósfera
Los conteos totales de esporas
correspondientes a 1 g de suelo rizosférico,
para cada una de las muestras tomadas,
indican que el número se encuentra entre 1
a 3 esporas.g-1
de suelo (Fig. Nº 3). La
presencia de esporas micorrízicas está
asociada al proceso de inoculación del
suelo con Penicilluin rugulosum (cepa IR,
disolvente de fosfato) y Trichoderma sp.
(cepa VP).
La concentración elevada de fosfato en el
suelo disminuye la dependencia
micorrícica de las plantas y a la vez
determina el tamaño de la menor
población de estos simbiontes, en
consecuencia, los valores del contenido de
fosforo pueden considerarse como un
indicativo de la mayor o menor presencia
de MA (Bolaños et al. 2000) Sin embargo,
a pesar de que el análisis físico-químico de
la muestra de suelo empleada para la
siembra del café señala niveles bajos de P,
la baja densidad de esporas de MA puede
estar influenciada por las condiciones
ambientales del umbráculo, relacionadas
con humedad, pH del suelo, fertilización
en vivero o condiciones de manejo
agronómico. Así mismo, la baja presencia
de esporas puede ser consecuencia de que
la formación de esporas en algunas
especies ocurre tres o cuatro semanas
después de iniciada la colonización; en
otras tardan seis meses a un año (Rivillas,
1995).

6. Fig. 3. Espora de Micorriza Arbuscular (MA)
aisladas de suelos con inoculación microbiana
en cultivo de Café (Coffea arabica L.)
CONCLUSIONES
La caracterización de los aislamientos
bacterianos permitió realizar una primera
identificación de baterías del tipo Gram
negativo de forma bacilar, que
provenientes de un nódulo de leguminosa,
admite considerarlo del genero Rhizobium,
fijador de nitrógeno atmosférico.
Las micorrizas arbusculares se encuentran
en todo tipo de suelos y pueden colonizar
cualquier planta que establezca simbiosis
con ellos, sin embargo, las condiciones
físico-químicas del suelo podrían estar
generando cierto tipo de especificidad con
respecto a las plantas hospederas, según
las respuestas que muestran las plantas a
determinadas especies de micorrizas, de
allí la baja densidad de MA localizadas en
el presente estudio.
Los inoculantes microbianos representan
una nueva vía de trabajo en beneficio de
una agricultura más sostenible y eficiente,
conveniente para la sociedad y los
productores agrícolas. Constituye una
tecnología amigable con el medio
ambiente, orientada a los principios de la
agricultura sustentable, y que va contra la
utilización creciente de pesticidas y
fertilizantes sintéticos.
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