El documento describe los estudios requeridos para validar plantas medicinales, incluyendo estudios etnobotánicos, farmacológicos, toxicológicos y clínicos en varias fases. También explica los procesos oxidativos celulares que generan especies reactivas de oxígeno y el estrés oxidativo asociado a enfermedades. Finalmente, destaca la importancia de los antioxidantes endógenos y dietéticos para contrarrestar los radicales libres y prevenir daños.

1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE PLANTAS MEDICINALES Dra. Lucy A. Ibáñez,Mg,Dr Lima-Perú 2008 USAL

2. La Investigación etnobotánica y etnofarmacológica de las especies vegetales para su posible utilizaciòn fitoterapèutica, exige un delicado protocolo de trabajo que incluye toda la escala de pruebas y ensayos que van desde la selección de una determinada planta de acuerdo a ciertos criterios hasta una exhaustiva gama de ensayos farmacològicos, químicos fitoquímicos, toxicológicos y clínicos. Manual de Técnicas Experimentales . Proyecto X.10 . CYTED INVESTIGACION EN PLANTAS MEDICINALES

4. ESTUDIOS PRE-CLÍNICOS ESTUDIOS CLINICOS ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS A U T O R I D A D R E G U L A D O R A ESTUDIOS FARMACÓLOGICOS ESTUDIOS QUIMICO-FARMACÉUTICOS ESTUDIOS ETNOBÓTANICOS, AGRONÓMICOS ESTUDIOS FASE I ESTUDIOS FASE II ESTUDIOS FASE III ESTUDIOS FASE IV AUTORIDAD REGULADORA ¿Ensayos Clínicos en Plantas Medicinales?

6. QUÍMICA ORGÁNICA (QUIMICOS; INGENIEROS QUÎMICOS, FARMACÉUTICOS, ETC) QUÍMICA COMBINATORIAL FARMACOLOGÍA MOLECULAR ETNOFARMACOLOGIA (FARMACÓLOGOS; ANTROPÓLOGOS;FARMACÉUTICOS; BIOLOGOS;MEDICOS, ETC). BOTÁNICA (BOTANICOS, TAXONOMOS FARMACEUTICOS; BIOLOGOS, ETC) SÍNTESIS PROCESO DE VALIDACIÓN INVESTIGACION EN PLANTAS MEDICINALES (EQUIPO MULTIDISCIPLINARIO) CULTIVO ( ING. FORESTAL, ING. AGRONOMO, ETC) PATENTES FARMACOLOGIA TOXICOLOGIA ENSAYOS CLÍNICOS ( FARMACOLOGOS;,QUIMICOS FARMACEUTICOS; MEDICOS; ETC) FITOMEDICAMENTOS PLANTA COMERCIALIZACION, EXPORTACION (EMPRESARIOS, EXPORTADORES, COMUNIDADES ANDINAS, AMAZONICAS, ETC) CONTROL DE CALIDAD

7. VALIDACIÓN DE PLANTAS MEDICINALES PLANTA Perfil farmacológico Análisis toxicológico EFICACIA SEGURIDAD PLANTA MEDICINAL NUEVOS MEDICAMENTOS Extracto total de la planta Fracciones purificadas Principios activos aislados e identificados Síntesis química de derivados activos Test in vitro, preclínicos Y clínicos

8. Numerosos estudios en nutrición humana demuestran una estrecha correlación entre el consumo de frutas y verduras y la menor incidencia de enfermedades crónico degenerativas debido a su bajo contenido en calorías, colesterol y a la presencia de vitaminas, fibras, antioxidantes naturales y minerales. Así mismo el estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas, como arterioesclerosis, artritis, demencia, cáncer, etc; es por ello que el uso de antioxidantes en farmacología es estudiado de forma intensiva, particularmente en el tratamiento de accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas. INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS

9. El oxígeno es esencial para la mayoría de los organismos que viven bajo condiciones aerobicas. Este es utilizado por la célula , la cual posee diversos sistemas que producen radicales libres de oxígeno(RLO). Frente al poder agresivo de estos RLO, la célula posee un arsenal defensivo de mecanismos neutralizantes formado por enzimas y compuestos que evitan la formación incontrolada y excesiva de RLO y producen la neutralización, eliminación y bloqueo de su actividad en cadena INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS

10. La enzima superóxido dismutasa remueve el anión superóxido (O2º) convirtiéndolo en H2O2, el cual es transformado por la enzimas catalasa y Glutatión peroxidasa en agua (H2O) . Así mismo también posee moléculas que remueven los radicales libres por reacción directa (no catalítica) tales como: el glutation reducido, los tocoferoles (vitamina E) y el ácido ascórbico (Vitamina C). INCIDENCIA DE ENFERMEDADES DE CRONICO DEGENERATIVAS

14. Por causas ambientales (radiación), así como por la ingesta de algún contaminante o incluso como consecuencia de nuestro propio metabolismo, surgen algunas moléculas que nos pueden provocar daño. A estas se les conoce como especies oxigeno reactivas (ROS), que se asocian a enfermedades como cáncer, problemas cardiacos o al natural envejecimiento humano. Entre los problemas que originan figuran: destrucción de paredes celulares, inactivación de enzimas, debilitamiento de la capacidad defensiva, alteración del sistema inmunológico e incluso daño del material genético . ESPECIES OXIGENO REACTIVAS (ROS)

15. Además la radiación cósmica y la radiación electromagnética de baja longitud de onda (por ejemplo los rayos gama) pueden dividir el agua en el cuerpo para generar el radical hidroxilo, OH▪. Este radical débilmente reactivo una vez producido ataca a cualquier cosa que este cerca, siendo su vida media extremadamente pequeña y reaccionando en su punto de formación dejando tras de si una secuela de reacciones en cadena de radicales libres en propagación. RADICALES LIBRES

16. Es así que un estudio realizado en China demostró la eficacia de una “suplementación nutricional" con β-caroteno, vitamina E y Selenio sobre la mortalidad total y por cáncer (especialmente carcinoma de esófago en una población deficitaria). Sin embargo un estudio Finlandés realizado sobre una población de alto riesgo (fumadores importantes) mostró que la suplementación con dosis elevadas de β -caroteno aumentaba el riesgo de padecer un carcinoma de pulmón. Es muy importante que una dieta diaria debe proveer cantidades adecuadas de nutrientes esenciales “naturales” para el mantenimiento de una salud óptima. Estos antioxidantes naturales se encuentran presentes en prácticamente todas las plantas, microorganismos, hongos e incluso en los tejidos animales. SUPLEMENTACION NUTRICIONAL

17. Las tendencias mundiales de la alimentación en los últimos años indican un interés acentuado de los consumidores hacia ciertos alimentos que además de contener nutrientes contengan sustancias fisiológicamente activas que cumplan, al igual que los nutrientes esenciales, una función de beneficio en la reducción de ciertas enfermedades. TENDENCIAS MUNDIALES DE LA ALIMENTACION

18. A estos alimentos se les ha denominado “alimentos funcionales” y se vienen realizando la identificación de ciertos principios activos, a fin de evaluar su seguridad y las dosis respectivas a utilizar, estableciéndose en la mayoría de casos marcadores analíticos, marcadores farmacológicos, realizándose además ensayos clínicos controlados a doble ciego y la demostración de sus efectos bioquímicos, fisiológicos, farmacológicos y toxicológicos. TENDENCIAS MUNDIALES DE LA ALIMENTACION

19. El término Alimento Funcional fue propuesto por primera vez en Japón en la década de los 80’s con la publicación de la reglamentación para los "Alimentos para uso específico de salud" ("Foods for specified health use" o FOSHU). Aunque el término alimentos funcionales no es una categoría de alimento legalmente reconocida por la Administración de alimentos y Drogas (FDA) de los Estados Unidos, sin embargo se han dado recientemente algunos cambios legislativos acerca de la información que deben contener las etiquetas de los productos relacionados con beneficios funcionales de los alimentos. ALIMENTOS FUNCIONALES

20. Las regulaciones de la NLEA (Ley de Etiquetado y Regulación Nutricional) y de la DSHEA (Ley de Suplementos Dietéticos Salud y Educación) se encaminan a preparar el camino legal en que se debe fundamentar el uso de estos productos. La posición oficial de la U.S. Food & Drugs Administration (FDA) es: "Las sustancias específicas de los alimentos pueden favorecer la salud como parte de una dieta variada". REGULACIONES

22. EL ENVEJECIMIENTO ENFERMEDADES CRONICODEGENERATIVAS

23. . Envejecimiento celular Peroxidación de los ácidos grasos de la membrana celular y daño del ADN. Ateroesclerosis Peroxidación de lípidos en las partículas de LDL con daño de otros de sus componentes. Cáncer Daño del ADN. Cataratas Modificaciones irreversibles en las proteínas. Cuadros Inflamatorios Crónicos Activación de genes relacionados con la respuesta inflamatoria.

24. La oxidación de las moléculas biológicas, membranas y tejidos es inducida por el oxigeno activo y mediada por radicales libres, lo cual esta relacionado con un aumento en la incidencia de enfermedades digestivas en los seres humanos. El metabolismo oxidativo, proceso biológico normal, es capaz de generar radicales libres oxigenados, altamente reactivos. Estas especies con oxígenos activos incluyen el radical superóxido (O2º), el peróxido de hidrógeno (H2O2), el radical óxido nítrico (NO▪) y el oxígeno singulete ( 1 O2). OXIDACION DE MOLECULAS BIOLOGICAS

27. Sustancias propias del organismo, enzimas antioxidantes Además de las enzimas glutatión peroxidasa, catalasa y superóxido dismutasa, hay otras sustancias antioxidantes como la coenzima Q-10, que ayuda a las enzimas a realizar su función, y participa en numerosos procesos corporales. Se ha comprobado una gran similitud entre las propiedades antioxidantes de la vitamina E y las de la coenzima Q-10, que juega un muy importante papel en la generación de energía celular, y a su vez es un estimulante inmune, mejora la circulación y ayuda a proteger el sistema cardiovascular.

28. Sustancias propias del organismo, enzimas antioxidantes Entre los principales antioxidantes dietarios esta la vitamina E que se ha demostrado posee actividad antioxidante in vivo. La vitamina C in vitro regenera a la vitamina E, lo que probablemente ocurra tambien in vivo. Los carotenoides estàn presentes en zanahorias , berros, espinacas, tomates , mangos y damascos. Los polifenoles son un grupo de compuestos presentes en la naturaleza, en su mayoría potentes antioxidantes necesarios para el funcionamiento de las células vegetales, que se encuentran en frutas y verduras, principalmente manzanas y cebollas y en bebidas como el té y el vino.

30. Moléculas con actividad antioxidante Flavonoides

31. Investigación de plantas con actividad antioxidante

32. OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL(MV) El MV que serà utilizado para la investigación se debe recolectar de acuerdo con cada especie, la época de recolección, la parte que es utilizada, la naturaleza, cantidad y tipo de principio activo, los mismos que varían considerablemente de acuerdo a la familia, género y especie de cada planta medicinal y se debe proceder de forma rigurosa a su correcta identificación, posterior preservación, conservación y preparación.

33. Plantas peruanas nativas e introducidas evaluadas

36. Para conseguir el aislamiento y purificaciòn de los principios activos , se recomienda utilizar algunas técnicas fisicoquímicas e instrumentales que puedan informar sobre la naturaleza y composición de los extractos y fracciones que se estén analizando y puedan permitir detectar la presencia de algunos tipos de metabolitos, alcaloides, flavonoide, esteroides, saponinas. Como herramienta fitoquímica se utiliza un conjunto de técnicas muy bien establecidas, que están basadas en reacciones coloreadas, selectivas o específicas y que mediante reactivos de diverso tipo, aplicados generalmente de forma directa sobre el extracto o sus fracciones o sobre placas cromatográficas desarrolladas, proporcionan información sobre la presencia de distintos grupos de metabolitos. Manual de Técnicas Experimentales . CARACTERIZACION PRELIMINAR DE LOS EXTRACTOS

37. Otro grupo de herramientas muy útiles se basan en la aplicación de técnicas espectróscopicas generalmente disponible. Es conveniente obtener espectros IR (neto) y RMN1H (Preferentemente en CDCl3 o DMSO-d6) del extracto o la fracción, para tratar de detectar y estimar particularmente la presencia y la proporción de componentes lineales y otros tipos de metabolitos secundarios definidos . OXIDACION DE MOLECULAS BIOLOGICAS

38. La estimación de la presencia de componentes lineales se consigue directamente mediante observación simple de la intensidad y proporción de las absorciones hacia 720 cm-1(IR) y 1,25 ppm (RMN 1H). La estimación de componentes funcionalizados se puede llevar a cabo tambien mediante la observación del espectro de IR, a través de las absorvaciones que aparezcan en las regiones de 3,500-3000 cm-1(funciones NH y OH, olefinas y sistemas aromáticos), 1800-1500 cm-1 (carbonilos, carboxilos e insaturaciones ) y 1100-800 cm-1 (éteres e insaturaciones); complementandola con la observación del espectro de RMN1H , en las zonas 13-8 ppm (H puente, aldehidos, amidas), 8-6 ppm (aromáticos y olefínicos conjugados)), 6-3 ppm (olefínicos, alcoholes, ésteres, grupos metoxilo, azúcares) y 3-0,5 (metilos) ppm. Manual de Técnicas Experimentales . Proyecto X.10 . CYTED (pag 37) CARACTERIZACION PRELIMINAR DE LOS EXTRACTOS

40. Plantas con acción antioxidante

46. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ANTI-ESTRES DE MACA

48. 199 3.0 El Fundamento del método desarrollado por Brand-Willams et al , DPPH, consiste en que este radical tiene un electrón desapareado y es de color azul-violeta, decolorándose hacia amarillo pálido por la reacción de la presencia de una sustancia antioxidante siendo medida la absorbancia espectrofotométricamente a 517 nm. La diferencia de absorbancias permite obtener el porcentaje de captación de los radicales libres . DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL METODO DEL DPPH

50. Actividad Antioxidante DPPH (Forma reducida) DPPH (Forma radicalaria) Compuesto Compuesto oxidado Violeta Amarillo N N H NO 2 O 2 N O 2 N un

52. Preparación de soluciones antioxidantes

53. Medición de absorbancias de las soluciones en el Espectrofotómetro

54. Tabla 1. Capacidad Antioxidante por el método del DPPH a 1 ug/mL, b 50 ug/mL c 100 ug/ mL d 200 ug/ mL MUESTRA Extracto % CAPTACION DE RADICAL LIBRE (R.L.) VITAMINA C (Control ) (Acido Ascórbico) ----- 92,82 Canela, corteza (Cinnamomum zeylanicum) 10% Etanol 97.59 a Lagarto, hoja (Calophyllum brasiliense) 20% Metanol 99.76 b Camu- camu, fruto (Myrciaria dubia) 10% Metanol 98.09 b Muña, hoja (Minthostachys mollis) 10% Acuoso 92.41 b Hiporuro, hoja (Alchornea castaneifolia) 10% Metanol 75.96 b Lagarto, hoja (Calophyllum brasiliense) 10% Acuoso 110.56 c Yacón, hoja (Smallanthus sonchifolius ) 10% Etanol 103.19 d MACA KOKEN, hipocótilo (Lepidium peruvianum) 10% Acuoso 95.55 d MACA AMAZON, hipocótilo (Lepidium meyenii) 10% Metanol 88.21 d

55. Porcentaje de Captación de Radical Libre x DPPH

56. AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE PRINCIPIOS ACTIVOS DE PLANTAS CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

57. LAGARTO CASPI , CALOPHYLLUM BRASILIENSE UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (ESPAÑA)

58. LAGARTO CASPI , CALOPHYLLUM BRASILIENSE UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (ESPAÑA)

59. LAGARTO CASPI , CALOPHYLLUM BRASILIENSE UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (ESPAÑA)

60. Lepidium peruvianum Ch. “MACA” UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (ESPAÑA)

61. Lepidium peruvianum Ch. “MACA” UNIVERSIDAD DE SALAMANCA (ESPAÑA)