Este documento presenta los resultados de dos experimentos que estudian la actividad enzimática de la β-fructofuranosidasa. El primer experimento determina cómo varía la velocidad de la reacción catalizada por la enzima con diferentes concentraciones de sustrato sacarosa, calculando los parámetros de Michaelis-Menten Km y Vmax. El segundo experimento mide el efecto del inhibidor no competitivo yodo acetato en la velocidad de la reacción a distintas concentraciones de sacarosa, observando una disminución proporcional de K

1. Universidad de La Serena
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Laboratorio Bioquímica General
Ingeniería en Alimentos
Alumna: Natalia Vargas Guzmán
Profesora: Carla Maturana Valdivia
I Semestre 2013

2. La concentración de sustrato determina la actividad enzimática
medida como la velocidad de la catálisis enzimática. Si la
concentración de la enzima se mantiene saturada, la
producción de producto será a una velocidad máxima.

3. Gráfica Michaelis-Menten: Ecuación Michaelis-Menten:

4. Gráfica Lineweaver-Burk:
Ecuación Lineweaver-Burk:

5. Gráfica Eadie-Hofstee:
Ecuación Eadie-Hofstee:

6. Gráfica Hanes-Woolf:
Ecuación Hanes-Woolf:

7. Velocidad de
reacción
enzimática
Inhibidores
Irreversible Reversible
Competitiva
No competitiva
Acompetitiva
Activadores
La forma de
representar la
inhibición
gráficamente es con
la doble reciproca

8. En la inhibición competitiva, el inhibidor
compite con el sustrato por el sitio activo.
Km Aument
a
Vmax Constant
e

9. En la inhibición no competitiva el inhibidor
se une a la enzima en otro lado, no es su
sitio activo
Km
Vmax
Constant
e
Disminuy
e

10. En la inhibición acompetitiva el inhibidor se
une al complejo enzima-sustrato ya
conformado.
Cambio
proporcional en Km
y Vmax

12. Objetivos:
- Estudiar la influencia de la concentración de sustrato en
la velocidad de una reacción enzimática.
- Calcular la constante de Michaelis-Menten.
Fundamento: Determinar de la actividad enzimática de
una preparación de β-fructofuranosidasa en presencia
de diferentes concentraciones de sacarosa como
sustrato.

13. Materiales:
• 8 tubos de ensayo
• Pipeta
• Baño termorregulador a 27°C
• Espectrofotómetro
• 8 Cubetas de espectrofotómetro
Reactivos:
• Solución Glucosa-Fructosa 0,01M
• Soluciones de sacarosa (distintas concentraciones)
• Reactivo DNS (inhibe o detiene la act. Enzimática)
• Buffer acetato
• Solución extracto de β-fructofuranosidasa con una
dilución que asegure un producto 5 moles/min.

14. Procedimientos:
1. Disponer serie de 6 tubos de ensayo con concentración creciente de
sacarosa.
2. Luego agregar :
- 1,5 mL Buffer acetato
- 0,5 mL solución enzima 1/2000.
3. Equilibrar a 27°C por 3 minutos (Agregar sacarosa 1 mL).
4. Dejar en baño a 27°C por 40 minutos.
5. Agregar 2 mL de DNS, enfriar.
6. Agregar 15 mL de Agua destilada
7. Medir absorbancia (540nm).

15. Resultados y Conclusiones
Para calcular la concentración de glucosa usaremos la ecuación de la
recta obtenida por la curva de calibración:
y = 0,183x - 0,0085
r² = 0,9992
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00
Absorbanciaa540nm
Concentración Glucosa (mM)
Curva de calibración Glucosa-Fructosa por el Método
DNS
Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085
[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183

16. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085
[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183
Reemplazamos la absorbancia de cada tubo
para calcular la concentración de glucosa.
Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada
tubo:
C1 x V1 = C2 x V2
Concentración del tubo 1:
0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL
C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción
Para calcular la velocidad de la reacción:
V= [glucosa] tiempo de reacción: 40
minutos
tiempo reacción

17. Tabla: Valores obtenidos
Tubo
[sacarosa]
M
Absorbanci
a
[Sacarosa
en reacción]
M
[Glucosa] Velocidad de
reacción
(M/min)
1 0,45 2,95
0,15 16,1 0,40
2 0,3 3,07 0,1 16,8 0,42
3 0,2 3,01
0,066 16,49 0,41
4 0,1 2,04 0,033 11,2 0,28
5 0,05 1,42
0,0166 7,8 0,19
6 0,03 1,14 0,01 6,27 0,15
P 0,45 0,57
0,15 3,17 0,079

18. [sacarosa] M
Velocidad de reacción
(M/min)
0,45 0,40
0,3 0,42
0,2 0,41
0,1 0,28
0,05 0,19
0,03 0,15
Tabla datos gráfico Michaelis-Menten
Vmax
Km= Vmax
2
Vmax = 0,21
(M/min)
2
Km = 0,02 M

19. 0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
Velocidad(M/min)
Concentración sacarosa (M)
Grafico Michaelis-Menten: Influencia de la concentración de
sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la
-fructofuranosidasa
Km
Vmax
Vmax
2

20. y = 0,0484x + 2,0082
R² = 0,9818
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120
1/v(M/min)
1/[S] (M)
Grafico Lineweaver-Burk: Influencia de la concentración de
sacarosa sobre la velocidad de reacción catalizada por la
-fructofuranosidasa

21. 1/s 1/v
6,67 2,5
10 2,38
15,15 2,44
30,30 3,57
60,24 5,26
100 6,67
Tabla datos gráfico Lineweaver-Burk
y = 0,0484x + 2,0082
1 = 2,0082 (M/min)
Vmax
Km = 0,0484
Vmax
Vmax = 0,4979 (M/min)
1 = 41,49 (M)
Km
Km = 0,0241 (M)

23. v/s v
2,67 0,4
4,2 0,42
6,21 0,41
8,48 0,28
11,45 0,19
15 0,15
Tabla datos gráfico Eadie-Hofstee:
y = -0,0245x + 0,5043
Km = 0,0245 (M) Vmax = 0,5043 (M/min)

24. Grafico Vmax (M/min) Km (M)
Michaelis-Menten 0,42 0,02
Lineweaver-Burk 0,49 0,024
Eadie-Hofstee 0,50 0,024
Observamos que los resultados obtenidos son
muy similares, gracias a los diferentes gráficos
podemos calcular la actividad enzimática y su
valores de Km y Vmax.
A mi parecer el gráfico mas eficiente es el de
Lineweaver-Burk ya que la actividad enzimática
representada de forma lineal facilita los cálculos.

25. Objetivos:
- Estudiar la acción de inhibidores no competitivos sobre la
velocidad de una reacción enzimática.
Fundamento: Determinar la velocidad de la hidrólisis de
sacarosa a diferentes concentraciones por la β-
fructofuranosidasa en presencia de una concentración
constante de yodo acetato.

26. Materiales:
• 14 tubos de ensayo
• Pipeta
Reactivos:
• Yodo acetato 0,001M
• Solución de Glucosa - Fructosa 0,01M
• Solución de sacarosa a diferentes concentraciones
• Reactivo DNS (inhibe o detiene la actividad enzimática)
• Buffer acetato pH=4,7 0,05 M
• Solución extracto β-fructofuranosidasa

27. Procedimientos:
Luego agregar:
- 1 mL Buffer acetato
Equilibrar a 27°C por 3 minutos.
Agregar 0,5 mL solución enzima 1/250.
Dejar en baño a 27°C por 5 minutos.
Agregar 2 mL de DNS a 100°C por 5 minutos (enfriar).
Agregar 15 mL de Agua destilada
Medir absorbancia (540nm).
Con inhibidor
Sin inhibidor

28. Abs =0,183 [Glucosa]-0,0085
[Glucosa] = Abs+0,0085
0,183
Reemplazamos la absorbancia de cada tubo
para calcular la concentración de glucosa.
Calcular concentración de sacarosa en reacción para cada
tubo:
C1 x V1 = C2 x V2
Concentración del tubo 1:
0,45M x 1 mL = C2 x 3 mL
C2 = 0,15 M Sacarosa en reacción
Para calcular la velocidad de la reacción:
V= [glucosa] tiempo de reacción: 40
minutos
tiempo reacción
Resultados y Conclusiones
Haremos los mismos
procedimientos pero ahora
calcularemos velocidad con
y sin inhibidor

29. Tabla valores
obtenidos
SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR
Tubo
[sacarosa]M
[Sacaros
a en
reacción
] M
Abs
[Glucosa
]
M
Velocida
d
(M/min)
Abs
[Glucos
a]
M
Velocida
d
(M/min)
1
0,45 0,15 2,46 13,51 2,70 2,95 9,85 1,97
2
0,3 0,1 2,05 11,25 2,25 3,07 8,10 1,62
3 0,2 0,066 1,67 9,19 1,83 3,01 6,88 1,37
4 0,1 0,033 0,87 4,77 0,95 2,04 4,67 0,93
5 0,05 0,0166 0,56 3,10 0,62 1,42 3,12 0,62
6 0,03 0,01 0,45 2,48 0,49 1,14 2,30 0,46

30. [Sacarosa] M Velocidad C.I.
M/min
0,15 1,97
0,1 1,62
0,066 1,37
0,033 0,93
0,0166 0,62
0,01 0,46
[Sacarosa] M Velocidad S.I.
M/min
0,15 2,70
0,1 2,25
0,066 1,83
0,033 0,95
0,0166 0,62
0,01 0,49
Tablas para gráfico Michaelis-Menten

32. CON INHIBIDORSIN INHIBIDOR
Vmax = 2,7 (M/min)
Vmax = 1,35 (M/min)
2
Km = 0,04 (M)
Vmax = 1,97 (M/min)
Vmax = 0,985 (M/min)
2
Km = 0,028 (M)
Vmax = Km
2

33. 1/[S] M 1/v S.I.
(M/min)
6,67 0,507
10 0,617
16,67 0,729
33,33 1,075
62,5 1,613
100 2,174
1/[S] M 1/v C.I.
(M/min)
6,67 0,370
10 0,444
16,67 0,546
33,33 1,052
62,5 1,612
100 2,040
Tablas para gráfico Lineweaver-Burk

35. SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR
Km = 0,0186
Vmax
1 = 0,3016 (M/min)
Vmax
1 x 1 = 1
Vmax 0,0186 Km
1 = 16,21 (M)
Km
Km = 0,0178
Vmax
1 = 0,4385 (M/min)
Vmax
1 x 1 = 1
Vmax 0,0178 Km
1 = 24,63 (M)
Km

36. Gráfico Michaelis-Menten:
Vmax (M/min) Km (M)
Sin inhibidor 2,70 0,040
Con inhibidor 1,97 0,028
Observamos que en presencia del Inhibidor yodo
acetato , la Vmax y Km disminuye. Estamos en
presencia de un inhibidor acompetitivo ya que el
resultado es un cambio proporcional en la Vmax y Km
Gráfico Lineweaver-Burk:
Vmax (M/min) Km (M)
Sin inhibidor 3,32 0,061
Con inhibidor 2,28 0,040