La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico que permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros de células individuales en suspensión, como su tamaño, complejidad interna y marcajes fluorescentes. Funciona haciendo pasar las células una por una a través de un haz láser, detectando luego la luz dispersada y emitida para caracterizar las células. Proporciona información cuantitativa sobre poblaciones celulares complejas de forma objetiva y sensible.

1. CITOMETRIA DE FLUJO(CMF). técnica de análisis celular multiparametrico (cuantifica componentes o estructuras celulares) cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. Pero la principal característica de la CMF es que puede ofrecer información simultánea de varios parámetros de cada una de las células analizadas y la relación entre los parámetros de una célula y los de otra célula también analizada José Antonio Martìn Fajardo. 2004

2. PARTES DE UN CITOMETRO Sistema hidráulico , permite la disposición en línea (flujo laminar) de cada una de las partículas a investigar. Sistema óptico para la lectura individual de las particulas o celulas que se le van a presentar, puede ser lampara de tunsgteno (luz blanca normal), esto le permite ver la absorbancia o transmisión en la celula (color) o laser normalmente de Argon, que le permite ver la DISPERSION de la luz, esto le informa del tamaño celular. Sistema electro informático , convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis . José Antonio Martìn Fajardo. 2004

3. La muestra La muestra es sangre total mezclada con el reactivo adecuado para el marcaje de la estructura a investigar, por ejemplo: La hemoglobina interna al GR lo marca directamente sin reactivo adicional. Los GB se marcan por la accion de su peroxidasa sobre un reactivo reducido, lo que produce un color negro en su citoplasma. Cualquier ab monoclonal marcado con fluorocromo dirigido contra una estructura celular, la marca. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

4. Sistema hidráulico. Este sistema consta de dos fluídos , uno que contiene en suspension a la muestra y otro que lo envuelve a fin de darle estabilidad (sheath fluid). Las células deben pasar una a una por delante del haz del láser. Ambos fluídos (Solución fisiológica, PBS, aire ) no se mezclan porque circulan a diferente presión . José Antonio Martìn Fajardo. 2004

5. Flujo laminar de la muestra Se busca un flujo laminar parabólico donde el envolvente forma la envuelta externa y la muestra con su diluyente la interna. ENVOLVENTE MUESTRA José Antonio Martìn Fajardo. 2004

6. Camara de flujo. El elemento principal es una camara cerrada de flujo tipo Crosland-Taylor, que permite lograr el flujo laminar con bajas velocidades de flujo y escaso ruido, aunque con el problema de remocion de coagulos y suciedad. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

7. SISTEMA OPTICO. Este sistema se compone de dos tipos de ópticas: La óptica de excitación, compuesta de el láser y las lentes para enfocar y dirigir el haz de luz; y La óptica de lectura , compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

8. Optica de excitación. Láser de Argón de emisión fija, refrigerado por aire . Tiene una intensidad baja (10-15 mW). Actualmente es uno de los mas utilizados porque pueden servir en la mayor parte de aplicaciones citométricas. Lámparas de arco de Mercurio o Xenón , pero su emisión decrece con el tiempo y son menos estables. Las ventajas más importantes de los citómetros con láser frente a los de lámpara son: mejor rendimiento para FITC, posibilidad de iluminación con dos o más láseres, y posibilidad de sorter celular José Antonio Martìn Fajardo. 2004

9. Óptica de lectura. La luz que emerge de la camara de flujo puede ser: luz transmitida que atravieza la celula, nos indica la intensidad del color de la misma. Luz difractada en diferentes angulos según donde pongamos los detectores. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

10. Optica de lectura. Luz blanca incidente A mas luz mas color en la célula. A menor tamaño de la célula, mayor ángulo de desviación en la luz, es decir mas difracción los detectores de ángulo mayor. Detector en 15º Detector en 30º Detector en 45º

11. Óptica de lectura Sistema optico José Antonio Martìn Fajardo. 2004

12. SENALES DE DISPERSION Forward Scatter (FS ) :luz dispersada frontalmente en ángulo cónico pequeño (0-10 grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamaño de la partícula que produce la dispersión. La luz es desviada a bajos ángulos entre 1 y 10 grados Generalmente proporcional al tamaño celular Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en dirección delantera Side Scatter (SSC ) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad de la estructura celular. Luz es desviada a altos ángulos Proporcional a la granularidad de la célula y su complejidad Detectado a 90 grados del eje de luz incidente José Antonio Martìn Fajardo. 2004

13. Aplicaciones de CMF Hematología : tipificación y conteo de células , reticulocitos y análisis de medula ósea . Farmacología :estudios de cinética celular Inmunología :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular Oncología :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos Microbiología :diagnostico bacteriano y vírico ,estudios de sensibilidad a los antibióticos Genética : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal José Antonio Martìn Fajardo. 2004

14. Otras aplicaciones Inmunotipificacion de celulas . CD4, CD8, etc. Ensayo de captura de secreciones de citoquinas por linf T. Determinar contenido celular DNA . La cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de objeto marcado. Apoptosis , determinacion de enzimas implicadas. Investigar el proceso de fagocitosis . José Antonio Martìn Fajardo. 2004

15. Deteccion marcaje fluorescente Cómo se obtiene la luz fluorescente. La fluoresceina se usa para marcar anticuerpos monoclonales dirigidos contra cualquier estructura que queramos investigar en la celula, el numero de celulas con ese marcador apareceran fluorescente en la CMF. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

16. SISTEMA INFORMARTICO Este es el que clasifica las señales suministradas por la CMF en diferentes cluster como CD4, CD8, etc. José Antonio Martìn Fajardo. 2004

17. Ventajas CMF Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 100.000 células). Múltiples marcajes de una sola célula. Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio). Medidas cuantitativas : discriminación de las células según la cantidad de marcador. Múltiples parámetros : define subpoblaciones complejas. Miles de células por segundo (1). José Antonio Martìn Fajardo. 2004

18. Desventajas CMF Poca información morfológica de la célula No proporciona información de la localización celular en un tejido Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora) Necesita suspensión de células individuales (1). Costos de la tecnología Método destructivo. Incapacidad de visualizar las células que se analizan José Antonio Martìn Fajardo. 2004

19. Ventajas e incovenientes. Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la microscopia de fluorescencia. - Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de tiempo (5000 partículas/segundo). - Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia. - Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales como los basófilos. - Posibilidad de analizar poblacionescelulares y epitopos celulares. - Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad. - Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular José Antonio Martìn Fajardo. 2004

20. Prestaciones del CMF 1.- Sensibilidad : cantidad mínima de moléculas de un fluorocromo determinado que pueden ser medidas con cierta precisión (resolución), para la luz dispersada, es el tamaño menor o índice de refracción que puede ser medido con cierta precisión. Depende de muchos factores. aumenta si se disminuye la velocidad de flujo (paso) manteniendo constante el diámetro del flujo interno (muestra). 2.- Resolución (expresado como coeficiente de variación): es la reproductibilidad de la señal producida por idénticas células o partículas. 3.- Velocidad de medida : es la velocidad media máxima a la que las células pueden ser medidas sin exceder una frecuencia determinada de coincidencias (dos células detectadas como una sola). En los citómetros láser oscila alrededor de 5.000 células/segundo José Antonio Martìn Fajardo. 2004