Este documento describe la citometría de flujo, una técnica de análisis celular multiparamétrico que permite detectar múltiples características de las células mediante el paso de una suspensión celular individual a través de un rayo láser. Incluye descripciones de los componentes ópticos, electrónicos y de fluidos del citómetro, así como de las señales que puede detectar como tamaño celular, complejidad interna y fluorescencia de marcadores. También resume aplicaciones como la inmunofenotipificación y

1. CITOMETRÍA DE FLUJO

2. CITOMETRÍA DE FLUJO
Técnica de análisis celular multiparametrico
Se basa en hacer pasar
una suspensión
celular de forma
alineada y de a una
celular por vez delante
de un rayo laser
focalizado

3. 1) SISTEMA OPTICO
3) ELECTRONICA
E
INTEGRACION
DE LA SEñAL
 FUENTE DE ILUMINACION: Lasers
 CONJUNTO DE LENTES, ESPEJOS Y FILTROS
 DETECTORES
2) FLUIDICA
 GARANTIZA FLUJO
LAMINAR
E
HIDROENFOCADO DE LA
MTRA
4) SOFTWARE Y
ANALISIS DE
DATOS
COMPONENTES DE UN CITOMETRO DE FLUJO

6. * FSC (Forward Scatter)
luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)
proporcional al tamaño celular
* SSC (Side Scatter)
luz dispersada a ángulo recto
proporcional a la complejidad de la
estructura interna
* Permite detectar señales de
fluorescencia, utilizando Ac
marcados con fluorocromos.
Señales
FluorescenciaDispersión
SEÑALES DETECTADAS

7. SEÑALES DETECTADAS
* SSC (Side Scatter)
luz dispersada a ángulo recto 90
proporcional a la complejidad de la
estructura interna
* FSC (Forward Scatter)
luz dispersada a bajo ángulo (0-10º)
proporcional al tamaño celular

8. SISTEMA OPTICO

9. SISTEMA OPTICO

10. CUANTIFICACIÓN DE UN PULSO DE
VOLTAJE

11. VIDEO

12. FLUORESCENCIA

13. FLUORESCENCIA

14. DETECCIÓN DE FLUORESCENCIA
PerCP Cy5
APC
FL-1 FL-2 FL-3 FL-4Detectores
Fluorocromos

15. MARCADORES Y SUBPOBLACIONES
• CD3: linfocitos T
• CD4: linf. T helper, monocitos (tenue)
• CD8: linf. T supr./citotox., NK
• CD3/CD4: linfocitos T helper (Clase II)
• CD3/CD8: linfocitos T supr./citotox. (Clase I)
• CD56: NK (CD3-)
• CD19: linfocitos B
• CD14: monocitos, granulocitos (tenue)
• CD45: leucocitos

17. PRESENTACIÓN DE DATOS:
HISTOGRAMAS

18. HISTOGRAMA:
Se representa:
X: intensidad de fluorescencia
Y: número de células que emiten a cada intensidad

19. HISTOGRAMAS
Intensidad de fluorescencia y sitios de unión
Intensidad de fluorescencia FITC
Número
de
eventos
FITC
FITC
FITC
FITC FITC
FITC
FITC
FITC FITC

20. Marcación con un solo Ac

21. Cada punto representa una
célula
Posiciones de los puntos:
intensidades relativas de los
dos parámetros (tamaño y
granularidad) medidos para tal
evento.
DOT PLOT

23. DOT PLOT
+
+--
++-
-
FL-1
FL-2
Doble marcación:
Se utilizan 2 fluorocromos
con diferentes λ de emisión
Ej: FITC (verde)
PE (naranja)
NK en sangre periferica:
CD56lo-CD16hi
NK predominante en
ganglios: CD56hi-CD16lo

24. Marcación con dos Ac

25. INMUNOFENOTIPIFICACIÓN
Persona Normal Paciente leucémico

27. * Células suspendidas en un medio líquido
– Sangre
– Cultivos celulares
– Tejidos
– Tumores sólidos
– Alimentos (para estudio de contaminación
bacteriana)
* Las muestras sólidas se disgregan por digestión mecánica o
enzimática
MUESTRAS
Debe encontrarse en forma de suspensión monodipersa

28. Citometría de flujo: protocolo de marcación
+ Ac control/es de isotipo*
+ Ac contra Ag a analizar
Incubar, lavar, resuspender
Incubar, lavar, resuspender
* ¿Qué es un “control de isotipo”? Es una inmunoglobulina de la misma
especie y del mismo isotipo que el Ac que se está empleando para el análisis
pero que carece de reactividad contra las células que se están empleando.
De esta manera, la “marcación” con este Ac control de isotipo permite
establecer cuál es el nivel basal “background” de fluorescencia que produce
cualquier Ig en las células a estudiar y descontar esa fluorescencia basal de
la fluorescencia producida por el Ac que se está empleando para el análisis.
Muestra
Muestra

29. •Autoflorescencia
•Control de Isotipo
•Control positivo
•Bloqueo de receptores Fc
CITOMETRIA DE FLUJO
CONTROLES:

30. Determinación de citoquinas por
citometría

31. Determinación de citoquinas por
citometría

32. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTER)
Separación de poblaciones
se rompe la corriente que contiene las células en pequeñas gotas que se cargan
eléctricamente. Con la aplicación de un campo eléctrico se desvía su
trayectoria y se recogen las células en diversos recipientes.

33. APLICACIONES
Análisis y separación de subpoblaciones celulares
Marcadores de superficie
Proteínas intracelulares
Cuantificación
Inmunotipificación
Experimental
1. Análisis de apoptosis
2. Evaluación de la capacidad endocítica
3. Evaluación de funcionalidad de bombas de eflujo
ATP-dependientes (Pgp)
4. Determinación de citoquinas (CBA)

34. Ventajas
Marcaciones simultaneas
Analiza un alto número de células por segundo (5000
células/segundo)
Cuantifica intensidad antigénica
Mayor sensibilidad y objetividad que IF
Posibilidad de analizar poblaciones minoritarias
Permite almacenar la información
Desventajas
No se obtiene información sobre arquitectura de tejido