Este documento describe las técnicas de citometría de flujo, hibridación in situ con fluorescencia (FISH) e inmunohistoquímica y sus aplicaciones en el diagnóstico de neoplasias hematológicas. La citometría de flujo permite medir múltiples características físicas y químicas de células individuales mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorocromos. La FISH identifica alteraciones cromosómicas mediante sondas fluorescentes. La inmunohistoquím

1. UNIVERSIDAD PRIVADA
ALAS PERUANAS
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela Académico Profesional de
Tecnología Medica

2. En el diagnostico de Neoplasias Hematológicas

3.  La citometria de flujo es un tecnología que
permite la MEDICION Simultanea de múltiples
características físicas y químicas de la Célula en
suspensión.
Citometria de Flujo

4. Citometria de
Flujo
(CMF)
Es una tecnica sencilla que se aplica en la rutina diaria de
muchos laboratorios clinicos y de investigacion .
Es capas de proporcionar resultados de forma rapida que
pueden ser aplicables al diagnostico.
Capas de distinguir entre varias poblaciones celulares
diferentes y detectar una poblacion celular en una
muestra en la que predominan otras poblaciones
celulares mayoritarias.
Informacion Simultanea de varios parametros de cada
una de las celulas analizadas
Caract. Intrínsecas de la celula :
Como tamaño
Complejidad de su nucleo y Citoplasma
Caract. antigenicas de cada célula

5. Citometria de Flujo
( CMF)

6. Fundamento:

7. Se basa en Hacer pasar una suspensión de partículas .
Se fundamenta en el
marcaje de miles de células
con un determinado
Anticuerpo ,
Este anticuerpo va dirigido a
distintas proteínas de la membrana
celular, citoplasmáticos y nucleares ,
Este anticuerpo lleva unido
una molécula fluorescente
que al ser estimulada por
un laser emite una
fluorescencia conocida

8. Las señales producidas por la interacción de las celulas con el haz de luz son de
dos tipos:
Señales de Dispersión Señalesde
Florescencia

9. Señales de
Dispersión
La dispersion resulta de la
interaccion de la luz con una
particula que produce un cambio
de direccion ( no de la longitud de
onda) en todas as direccion
Características Morfológicas que determinan la dispersión de la luz son
fundamentalmente el tamaño celular la menbrana el núcleo y el material
granular el interior de la celula llamada Complejidad
En los Citometros de flujo se
miden dos fraccion de
dispersión :
La luz Dispersada en Angulo
conico pequeño llamado FSC
La luz dispersada en un angulo
recto llamdo SSC

10. Señales de
Fluorescencia
Fluorocromo
Molécula química que absorbe luz
a una determinada longitud de
onda y emite a una longitud
superior
Los citometros de flujo permiten detectar
señales procedentes del complejo Ag/Ac
marcado con un fluorocromo y situados en una
molécula , siendo la cantidad de señal de
fluorescencia emitida igual a la proporción de la
cantidad de componentes fluorescentes de la
partícula

11. Anticuerpos
Monoclonales
Principal reactivo utilizado en CMF cuando estas pueden ser
conjugadas con fluorocromos.
Anticuerpos específicos para un solo antígeno.
En CMF se utiliza para identificar poblaciones celulares
especificas gracias a combinaciones de Ac - Mono. ´para Ag
presente en esta célula .
Ac- mono. en CMF permiten de una forma rápida sencilla y
objetiva diferenciar poblaciones , subpoblaciones celulares
con distinta actividad funcional , en distintas etapas de
maduracion o estados de activacion y adhesion.
El uso de Ac.Mono. Ha hecho posible clasificar mas
objetivamente a las celulas indiferenciadas mediante las
tecnicas de CMF.

12. Antígenos
Son Moléculas Presentes en la célula y que son capaces de unir
Ac específicamente contra ellos.
En CMF son estructuras intracitoplasmaticas o de la superficie
celular

13. Citometria de Flujo
(CMF)
Componentes
Sistema de Fluidos
Sistema Óptico:
Fuente de Luz
Separación Espectral
Sistema Electrónico:
Control mecánico de luz y receptores
Colección y Análisis de pulsos
Sistema Informático:
Análisis y presentación de Datos

14. Rayo Laser Gas inerte como Argón Neon y Helio
Sistema de Flujo Soluciones a Usar

15. FASL/FS/FSC-- Dispersión frontal de la luz
SS/ SSC – Dispersión lateral de la luz
Estos dan las características intrínsecas de las células
FASL --- La Luz colectada por un fotodiodo a lo largo del haz del
láser,
relacionada con el tamaño de las células
SS – La luz desviada atraves de las células o alrededor de ella en
un <
de 90º, esto refiere a la densidad celular.

16. Fluorocromos
Se utilizan para estudiar las
características
extrínsecas
Fluorocromos: color
Fluoresceína (FITC) Verde
Ficoeritrina (PE) Rojo
Proteína clorofila peridinina (PERCP) Amarillo rojo

18. Forma de Presentación de los Gráficos
Histogramas Gráficos de puntos
Grafico de
Contornos Grafico Isométrico
Grafico de Densidad

21. Posiblidad del empleo de multiples marcajes frente frente a un solo marcaje de
la citoquimica y la microscopia de fluorescencia.
Posibilidad de analizar un elevado numero de particulas en un corto periodo de
tiempo.
Posibilidad de cuantificar la intensidad antigénica por medio de fluorescencia .
Posibilidad de cuantificar moleculas antigenicas presentes en un grupo celular.
Ventajas

22. Aplicaciones
Hematologia
Inmunologia
Patologia
Transplantes
Farmacologia
Biologia
Toxicologia
Microbiologia
Parasitologia
Citogenetica
Virologia

23. Leucemias
Los distintos tipos de leucemia son un grupo
heterogéneo de patologías resultante de una
proliferación descontrolada de una o mas tipos celulares
hematopoyéticos tanto en medula ósea como en sangre
periférica

26. Es la Ciencia que estudia la herencia de los Seres vivos, es decir , como las
características de un ser vivo se transmiten a su descendientes.
Gregor Johann Mendel

27. Citogenética
El Analisis citogenetico de las celulas tumorales ha revelado la presencia de
alteraciones cromosomicas clonales en las de 30.000 neoplasias .
Hoy en dia sabemos que la presencia de determinadas alteraciones
cromosomicas aporta informacion importante con valor diagnostico y
pronostico en neoplasias hematologicas .
El conocimiento de la alteración cromosómica asociada a un determinado
diagnostico permite hacer el Seguimiento de la evolución de la enfermedad y
por lo tanto valorar la respuesta a tratamiento

28. Alteraciones cromosómicas :
Estructurales
Afectan : estructura forma y tamaño
Deleción
Duplicación
Inversión
Translocación
Numéricas
Variación en el numero de juegos .( aploidia -
poliploidia
Variación en el numero de cromosomas.(
aneuploidia)

38. Presente en LMC en un 95%, LLA en un 30% y en
LMA
Traslocacion entre el cromosoma 9 y 22 (ABL/BCR)

39. Diseñadas para detectar el propio gen
Detecta el reordenamiento de varios genes
Gen X Gen Y

44. Diseñadas para detectar zonas donde falta un gen
Detecta el reordenamiento de un gen
Gen X

45. Enfermedad Mutaciones Genes
Linfoma folicular t(14;18)(q32;q21) IgM/Bcl-2
Leucemia Mieloide
aguda
t(8;21)(q22;q22)
Inv(16)(p13;q22)
t(15;17)(q21;q11)
AML1/ETO
CBFb/MYH1
PML/RARa
Anormalidades en 11q23
t(4;11)(q21;q23)en niños
t(9;11)(p22;p23)
t(11;19)(q23;p13.1)
-5/del(5q)
-7/del(7q)
MLL
MLL/AF4
MLL/AF9
MLL/ELL
Leucemia Linfoide
Aguda (LLA)
t(9;22)(q34;q11.2)
t(4;11) (q21;q23)
BCR/ABL
MLL/AF4

46. Ventajas
 Muestras fijadas
 El periodo interfásico
 Identificación micro mutaciones
Desventajas
 Procedimiento minucioso
 Alto costo

48. Inmunohistoquimica
1941 Albert Hewett Coons
describe la inmunofluorescencia
1966 Albert Nakane, Pierce y Avrameus utilizan la
peroxidasa de rábano en presencia de un
cromógeno iniciando la inmunohistoquimica
enzimática

50.  Método que sirve para localizar un antígeno
específico localizados en un tejido mediante
una reacción Ag-Ac específico.
 Se requiere:
Buena fijación
Buena conservación Antigénica

51. Obtención de Ac
Ac
Ag
Sintetiza
AC POLICLONALES

52. AC MONOCLONALES

53. 125I: auto radiografía
 Enzimas: peroxidasa o fosfatasa alcalina y algún
sustrato
 Biotina: La afinidad avidina/streptavidina-biotina
es la más alta conocida  la unión es en la
práctica irreversible.
 Fluorocromos: Fluoroseina
Moléculas marcadoras

55. Método directo Método Indirecto

57. Método directo Método Indirecto

59. Utilidad
 Diagnostico
 Tratamiento
 Tipificación de neoplasias
linfohematopoyeticas y primarios
 Pronostico

60. Ventajas
 Sencilla
 Sensible y específica (Ac monoclonales)
 No requiere aparatos muy sofisticados
 Tiene buenos resultados con tejidos
incluidos en parafina.
Desventajas
 Muy susceptible a errores (rangos de pH)

61. Marcadores Dianas
CD45 Antígeno leucocitario común y monocitos, pero negativos
para linfoma de Hodgkin y células plasmáticas
CD1 Células de langerhans, timocitos corticales inmaduros
CD5 Carcinomas Tímicos, linfocitos T, LLC y linfoma del manto
CD10 LLA, linfoma folicular, linfoma de Burkitt
CD15 Granulocitos, macrófagos y células Reed-Sternberg (Ap.
Golgi y membrana)
CD20 Linfocitos B
CD23 LLC, células dendríticas
CD30 Células Reed-Sternberg (Ap. Golgi y membrana), Linfoma
anaplásico de células grandes(ALK)
CD38 Linfocitos activados y plasmática
CD43 Linfocitos T, Leucemia mieloide aguda, monocitos,
megacariocito, mastocitos y en menor medida Linfoma B

62. Marcadores Dianas
CD63 Células Plasmáticas (retículo endoplasmático)
CD68 Monocitos, osteoclastos, precursores mieloides y algunos
linfocitos B
CD79a Linfocitos B
CD99 Timocitos corticales, LLA
CD138 Plasmático
Bcl-2 Linfomas de bajo grado y linfocitos T
Bcl-6 Origen del centro germinal
Ciclina D1 Linfoma del manto
S100 Célula de Lagerhans, leucemia mieloide
TdT Leucemia linfoide agudas
Triptasa Leucemia linfoide agudas
Zap70 Peor pronóstico en LLC y probablemente en Linfoma del
manto

63. Células B Células T
CD10+ CD3+
CD19+ CD7+
CD22+ CD5+
TdT CD2+
CD99+
TdT
CD10+
CD3+

64. CD13+
CD14+
CD33+
CD43+ CD14+
CD33+

65. Clasificación de LMA Inmunofenotipos
LMA con mínima diferenciación
mieloide (M0)
CD13+ y CD33+
LMA sin maduración(M1) CD33+, CD13+, CD11B+, CD7+(10%)
Leucemia Promielocítica
Aguda(M3)
CD13+ y CD33+
Leucemia Mielocítica Aguda
(M4)
CD13+,CD11b, CD15,CD14 (monocítcicos)
Leucemia Monoblástica Aguda
(M5)
CD13+, CD33+, CD14+, CD68+, CD4+
Eritroleucemia (M6) CD71+, CD36+, Hemoglobina A, Glicoforina
A
Leucemia Megacarioblástica
Aguda (M7)
CD41+, CD42+,CD61+(glicoproteínas
plaquetarias)

66. Células B Células T
CD20+ CD2+
CD19+ CD3+
CD23+ CD5+
CD5+ CD6+
CD20+
CD3+
CD5+

68. Bibliografías
 Iván P. Jaime P. Julia P. Hibridación In Situ con
Fluorescencia, Hematología fisiología y diagnóstico,
editoreal Universidad de Talca, año 2005:p.311-313,
721-726.
 Manuel V. Hematopoyesis y afines, Manual de
calidad de inmunohistoquímica en Anatomía
patológica, año 2007:p27-8.
 Marta P. Leucémias Crónicas:
http://es.scribd.com/doc/8743483/Leucemias-
Cronicas.
 Abrahan M. Tesis: Determinación de perfiles
inmunofenotípicos por citometría de flujo de leucemia
linfoblástica aguda en niños y su valor en la detección
de enfermedad mínima residual, Universidad
Nacional de Colombia-Bogotá 2010:p 19-20,53.

69.  Unidad de Genética, Hibridación in Situ con
fluorescencia-FISH, Instituto Nacional de
Enfermedades Neoplásicas INEN:
http://www.inen.sld.pe/genetica/fish.htm
 Inmunohistoquímica, Wiquipedia
enciclopedia de contenido libre:
http://es.wikipedia.org/wiki/Inmunohistoqu%
C3%ADmica