Este documento resume las técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Explica las etapas generales de estas técnicas, incluyendo la obtención de muestras, fijación, unión con anticuerpos y detección de la reacción. También describe los tipos de anticuerpos, métodos de detección e importancia del análisis de imágenes para extraer información cuantitativa de las muestras.

1. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.1Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

2. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.2Generalidades

3. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.3Características generales Técnica versátil

4. Se puede demostrar la presencia de antígenos de ubicación subcelular

5. Doble marcado permite la detección simultánea de dos antígenos y por tanto hay una comparación relativa

6. En algunos casos se pueden usar asociado a técnicas histológicas convencionalesDr. Julio Larenas H. MV. MSc.4Características generales Permite detectar el tipo de organismo infeccioso, células progenitoras de una neoplasia, o presencia de respuesta inflamatoria

7. Puede ser medida la concentración aproximada de un antígeno (Softwares analizadores de imágenes)

8. Pueden detectar como mínimo 1000 moléculas de antígenos por célulaDr. Julio Larenas H. MV. MSc.5Etapas Obtención de las células o tejido

9. Fijación

10. Unión con anticuerpos

11. Detección de la reacción antígeno-anticuerpoDr. Julio Larenas H. MV. MSc.6Tipos de muestras Cultivos celulares que crecen en un soporte de vidrio (tipo de cubreobjeto)

12. Centrifugado de células en suspensión colocadas en un portaobjetos

13. Frotis de tejido

14. Cortes de tejidoDr. Julio Larenas H. MV. MSc.7ConsideracionesHay tres factores principales que determinan la facilidad de detección de un antígeno:1.- Concentración local de un antígeno2.- El tipo de fijador y anticuerpo usado3.- El método de detección empleado

15. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.8FijaciónIdeal: Inmovilizar al antígeno sin modificarlo Mantener la estructura celular Permitir el acceso de los anticuerposRealidad: Muchos epítopes son enmascarados o alterados y los anticuerpos pueden no reconocerlos (Tratamientos con tripsina)

16. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.9Fijadores más utilizados

17. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.10Anticuerpos policlonales Un buen suero tiene múltiples anticuerpos contra diferentes epítopes

18. Producen una fuerte señal

19. El exceso de anticuerpos eventualmente puede producir una inhibición alostérica

20. Requiere controles

21. El suero puede contener anticuerpos irrelevantes de especificidad desconocida, lo cual incluye los propios del animal (Background)(Inhibe: Titulación, Adsorción con acetona, purificación por inmunoafinidad)Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.11Anticuerpos policlonales Debido a que los anticuerpos son contra una variada cantidad de anticuerpos, lo que incluye los epitopes denaturados, esta técnica se puede utilizar en: Muestras demasiado fijadas Cortes incluidos en parafina Tejidos fijados en paraformaldehído

22. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.12Anticuerpos monoclonales Produce un escaso background

23. Trabajan bien en células o tejidos bien fijados

24. La mayoría no funciona con paraformaldehído

25. Ocasionalmente existe reacción cruzada

26. Es mejor la obtención de anticuerpos de cultivo y no de líquido ascítico (Puede estar contaminado con anticuerpos=background)Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.13“Pool” de Anticuerpos monoclonales Incrementa la intensidad de la reacción (señal)

27. Cada anticuerpo individual debe ser probado inicialmenteDr. Julio Larenas H. MV. MSc.14Tipos de Técnica Directa: El marcador se acopla o conjuga directamenteIndirecta: El marcador se acopla a un anticuerpo secundarioDe amplificación: Se agrega otro anticuerpo intermediarioMétodo de la estreptoavidina/biotina

28. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.15Técnica DirectaAnticuerpo primarioAntígeno

29. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.16Técnica IndirectaAnticuerpo SecundarioAnticuerpo primarioAntígeno

30. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.17Pool de anticuerpos monoclonalesAnticuerpos policlonalesAnticuerpos MonoclonalesIntensidad de la señalExcelenteRegular a buenaExcelenteExcelenteEspecificidadBuenaExcelenteCualidadSeñal intensaEspecificidadEspecificidadDisponibilidadDesventajaSeñal bajaNo reutilizableBackgroundTitulación

31. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.18Agente patógenoAntígenos

32. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.19PortaobjetoFrotis o impronta

33. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.20

34. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.21CongelaciónFrotis o improntaFijación en formalinaCorte por congelaciónInclusión en parafinaFijación

35. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.22Resumen de pasos para la obtención de una muestra

36. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.23Técnica de inmunofluorescencia

37. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.24FLUORESCENCIAEs la capacidad que tienen algunas moléculas de emitir luz mientras están siendo estimuladas de modo adecuado. No confundir con la fosforescencia que es la emisión de luz con posterioridad a la estimulación,cuando ésta última ha cesado.

38. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.25Características Requiere un microscopio de epifluorescencia

39. La radiación de excitación se transmite a través de los objetivos hacia la superficie de la muestra

40. La radiación absorbida por el fluorocromo hace que sus electrones salten a un nivel superior de energía, al volver a su estado normal libera energía como luz

41. Pueden observarse dos fluorocromos en la misma muestra

42. Fluoresceina y rodaminaDr. Julio Larenas H. MV. MSc.26Camino recorrido por la luz de excitación (azul) y la luz emitida por el objeto fluorescente (verde oscuro). El espejo dicroico refleja la longitud de onda de excitación y deja pasar la de emisión. La luz emitida, tras pasar por el filtro, solo abarca un rango estrecho de longitud de onda (verde intenso).

43. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.27Los fluorocromos(colorantes fluorescentes) al ser estimulados con fotones de una determinada longitud deonda, denominada de absorción o excitación, emiten otro fotón de mayor longitud de onda, es decircon menor energía. El fluorocromo prototipo es la fluoresceína que al ser estimulada con luz azul (abs.máx. a495 nm) emite luz verde (emisión máxima a 520 nm).Tanto la excitación como la emisión no son exactas a esa longitud deonda: aunque la excitación de la fluoresceína sea máxima a495 nm, también es posible estimular (menos eficazmente) con 470 o con 510 nm, puesto que en realidad lalongitud de onda de excitación es una campana de Gauss (espectro de absorción). Siempre que se hable deexcitación y emisión de un fluorocromo se entiende que se está hablando de los valores máximos.

44. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.28

45. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.29FUENTE DE LUZ Los microscopios de fluorescencia convencionales y algunos citómetros de flujo antiguos tienen como fuente emisora de fotones a una lámpara de arco de mercurio. La longitud de onda de excitación se consigue con filtros ópticos que solo dejan salir el tipo de luz de excitación que deseemos. En la actualidad, prácticamente todos los modelos de citómetros y los microscopios confocales llevan una fuente emisora de luz coherente (láser).Cada tipo de láser emite los fotones en una o varias longitudes de onda determinadas conocidas como líneas del láser. La energía de emisión que define una determinada línea se produce al caer un electrón electrón de una órbita alta a otra baja y por tanto vendrá determinada por la estructura atómica del gas contenido en el cañón láser.

46. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.30FUENTE DE LUZLos emisores láser más empleados son los de helio-neón (atómicos), argón-kriptón (iónicos) y helio-cadmio (moleculares). Recientemente se han empezado a introducir los basados en semiconductores (láser diodo) y en tecnología multifotón que permite estimular con mayor energía que la propia de la longitud de onda al hacer incidir, simultáneamente sobre el objeto, varios fotones que suman sus energías.

47. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.31FLUOROCROMOS Existen cientos de fluorocromos cada uno de ellos con diferentes rangos de excitación y emisión. Los que más se usan son los que se excitan con la longitud de onda de emisión de los laseres que disponemos en los equipos de citometría de flujo y microscopía confocal. Los fluorocromos pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad que tienen algunos de unirse a determinadas moléculas u organelos tales como los colorantes de ácidos nucleicos: ioduro de propidio, bisbencimidas, etc.Pero lo más habitual es que estos colorantes se empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de modo específico a estructuras concretas de la célula.

48. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.32Propiedades de los fluorocromos más utilizadosExcitaciónEmisiónFluorocromoColorDAPI365Sobre 420AzulVerdeFluoresceina495525Rodamina552570RojoRojoTexas red620596

49. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.33Espectros de emisión (visibles) de los fluorocromos más usados

50. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.34Piscirickettsia salmonis

51. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.35P. salmonis mediante microscopía confocal

52. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.36Modificación de la técnica de inmunofluorescencia para la detección deP. salmonis mediante microondas (Larenas y col., 1996)

53. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.37Técnicas de inmunohistoquímica

54. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.38DABAECFast redHRPHRPFosf. Alc.Precipitado caféPrecipitado rojoPrecipitado rojo3Precipitado coloreadoSustancia cromógenaPeroxidasa (HRP)o Fosfatasa alcalinaEnzima2EstreptoavidinaBiotinaAnticuerpo secundario marcado con biotina1Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja)Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina

55. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.39Sistema de detección fosfatasa alcalinaPrecipitadorojoFast redFosfatasaalcalinaAnticuerpo marcado con fosfatasa alcalina21Anticuerpo primario (Conejo)Antígeno

56. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.40Sistema de detección APAAPPrecipitadorojoAlkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complexFast redFosfatasaalcalinaAnticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina32Anticuerpo secundario (Anti-inmumoglobulina de ratón)1Anticuerpo primario (Ratón)Antígeno

57. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.41Sistema de detección APAAPPrecipitadorojoAlkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase complexFast redAnticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalinaFosfatasaalcalina4Anticuerpo anti-ratón3Anticuerpo secundario (Anti-conejo)21Anticuerpo primario (Conejo)Antígeno

58. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.42Leiomioma: Fibra de actina específica de músculo liso. Inmunoperoxidasa (DAB)Melanoma: reconocimiento de antígeno de membrana intracelular específico del tumor. Inmunoperoxidasa (DAB)

59. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.43Mieloma: Detección de un antígeno específico de células B alteradas. Inmunoperoxidasa. DAB.Reconocimiento de macrófagos en un ganglio linfático. Inmunoperoxidasa. AEC.

60. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.44TVT: Proliferación celular de linfocitos. Fosfatasa alcalina.Epitelio alveolar: Virus PI3 en pulmón de ovino. Epìtelio infectado. Inmunoperoxidasa. DAB.

61. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.45

62. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.46

63. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.47 Corte de ovario de trucha arco iris negativo a P. salmonis.Inmunoperoxidasa AEC. 100X. Tejido renal proveniente de una hembra trucha arco iris inoculada con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC 400X.

64. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.48Análisis de imágenes

65. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.49ANALISIS DE IMAGEN en biología y medicina.Los sistemas de análisis de imagen están diseñados para extraer información y transformarla en valores numéricos lo que nos permite exprimir la información contenida en la imagen, esta información puede sernos entregada en forma de imágenes retocadas o en falsos colores

66. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.50ANALISIS DE IMAGEN en biología y medicina.Podemos obtener información, entre otras, sobre la forma, área y densidad óptica de los objetos. Existen magníficos sistemas de análisis de imágenes tanto comerciales como shareware. Los primeros tienen un costo excesivo y solo están al alcance de empresas y departamentos universitarios. Pero los sistemas shareware o de libre dominio son casi tan buenos como los comerciales y nos permiten aprender y adquirir experiencia sin necesidad de costosas inversiones entre ellos los mejores son:Image Tools (sólo para WIndows), NIH image (Para Mac y Windows) y TN-image (para MS-DOS y UNIX), este último aunque parezca anticuado, está muy bien programado tiene una gran potencia funcionando bajo MS-DOS.

67. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.51

68. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.52PROCESAMIENTO DE MUESTRAS UTILIZADAS PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:FIJACION CON PARAFORMALDEHIDO AL 2%, GLUTARALDEHIDO AL 0,2% , EN BUFFER PBS 0,1 M PARA INMUNOHISTOQUIMICA Y PARAFORMALDEHIDO AL 4% GLUTARALDEHIDO 2%, EN BUFFER CACODILATO DE Na 0,2 M PARA ULTRAESTRUCTURA.

69. PROCESADAS SEGÚN PROCEDIMIENTO ESTANDAR PARA INCLUSION DE CORTES HISTOLOGICOS EN RESINA LR WHITE Y EPON.Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

70. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.53PROTOCOLO DE INMUNOPEROXIDASA (POST EMBEDDING) PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:INCUBAR LA GRILLA EN PEROXIDO DE HIDROGENO 5 min.

71. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

72. BLOQUEAR CON TBS/BSA 1% POR 30 min.

73. ESCURRIR LA GRILLA EN PAPEL FILTRO.

74. INCUBAR ANTICUERPO POLICLONAL ANTI P.salmonis (DESARROLLADO EN CONEJO) 1:50 POR 2 hrs.

75. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .

76. INCUBAR ANTICUERPO ANTI CONEJO (CON BIOTINA) POR 1 hr.

77. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min .Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

78. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.54PROTOCOLO DE INMUNOPEROXIDASA PARA MICROSCOPIA ELECTRONICA:INCUBAR CON ESTREPTOAVIDINA-HRP 30 min.

79. 4 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

80. INCUBAR CON CROMOGENO AEC 10 min.

81. 2 LAVADOS CON TBS 0,5 M TRITON 0,02% POR 5 min.

82. 2 LAVADOS CON AGUA BIDESTILADA POR 5 min.

83. TEÑIR CON ACETATO DE URANILO AL 4% EN AGUA DESTILADA 5 min. Y CITRATO DE Pb DE REYNOLDS POR 5 min.Uso de inmunoperoxidasa en microscopía electrónica

84. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.55Microscopia electrónica de transmisiónTécnica de inmuno-oro (P. salmonis)Anticuerpo marcado con oroOroAnticuerpo primarioAntígeno

85. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.56DABAECFast redHRPHRPFosf. Alc.Precipitado caféPrecipitado rojoPrecipitado rojo3Precipitado coloreadoSustancia cromógenaPeroxidasa (HRP)o Fosfatasa alcalinaEnzima2EstreptoavidinaBiotinaAnticuerpo secundario marcado con biotina1Anticuerpo primario (Ratón, conejo, cabra, rata, cuy, oveja)Detección mediante reacción estreptoavidina-biotina

86. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.57Microscopia electrónica de transmisión1m1mTécnica de inmunoperoxidasa (P. salmonis)Control negativo. Células provenientes de cultivo de tejido CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 10200 X.Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X.

87. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.581m1mRESULTADOSControl positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC 10200X. Control positivo células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 7200X

88. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.59RESULTADOS1mSe observan varias P. salmonis unidas al corion de laova mediante prolongaciones denominadas CAP. 6700xControl positivo células CHSE-214, infectadas con P. Salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 16500X.Control positivo células CHSE-214, infectadas con P. salmonis. Inmunoperoxidasa AEC. 15000X.

89. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.60RESULTADOS1m1mMuestra de ovario día 20 p.i. Inmunoperoxidasa AEC. 27750X. Muestra de ovario día 10 p.i células CHSE-214. Inmunoperoxidasa AEC. 4350X.

90. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.61

91. Células CHSE-214Efecto citopáticoPiscirickettsia salmonisPiscirickettsia salmonis marcado con oro

92. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.63INMUNODOT

93. Materiales y Métodos“dot-blot” Activación de membrana de polivinildifluoruro (PVDF)

94. Instalación de membrana PVDF en Bio-Dot®

95. Conexión Bio-Dot® en bomba de vacío

96. Carga de muestras en pocillos del Bio-Dot®Materiales y Métodos“dot-blot”Bloqueo de membranaSolución de leche descremada al 6% Incubación con 1er anticuerpo

97. Incubación con 2º anticuerpo

98. IgG de Ratón anti-P. salmonis

99. Durante 2 horas

100. Anti IgG de ratón

101. Dilución 1:5.000

102. Durante 1 hora

103. Dilución 1:10.000

104. Ligada a peroxidasaMateriales y Métodos“dot-blot” Uso de sustrato

105. Generación de quimioluminiscencia

106. Exposición de membrana a película fotosensible, de 2 a 8 min.

107. ReveladoMateriales y MétodosAnálisis de resultadosDENSITOMETRÍA Digitalización de películas

108. Conteo de píxeles de cada punto mediante un software (Un-Scan-It®)Materiales y MétodosAnálisis de resultadosComparación de cinéticas de infección Análisis semi-cuantitativo, descriptivo en relación al tiempo y el porcentaje de adhesión e ingreso a la ova.

109. Cada muestra positiva genera Nº de Píxeles.

110. Estas se comparan porcentualmente entre ellas respecto a un 100% que sería número de píxeles generados por la muestra control positivo o suspensión bacteriana usada en el desafío de ovas.

111. En base estos datos se compararían las cinéticas de infección generadas en una misma especie de ova por las distintas cepas de P. salmonis.

112. También se compararían las cinéticas de infección generadas por una misma cepa bacteriana en las distintas especies de ovas de salmón.Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.69Fig. En la primera fila se aprecia la reacción inespecífica con las células CHSE-214 sin infectar. En la segunda fila se ve la reacción positiva a LF-89.Fig. En la primera columna se aprecia la reacción positiva con una suspensión de cultivo celular inoculada con P. salmonis, destacándose claramente de la muestra negativa en la segunda columna que corresponde a una muestra de ova sin infectar.

113. Dr. Julio Larenas H. MV. MSc.70Gráfico: Detección mediante Dot Blot quimioluniscente de muestras en concentraciones crecientes de P. salmonis y cultivo celular sin infectar.