1. Universidad de Chile
REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA
Protocolo de realización

2. PCR
- Preparación del Primer
- Cálculo de la T° de alineamiento
- PCR
* Determinación del número de ciclos apropiados (específico
para cada primer).
* Determinación de la cantidad de control interno 18S según el
número de ciclos elegidos.

3. Preparación del Primer
Concentración final deseada = 500 uM (500 umoles/Lt  500.000 nmoles/Lt)
500.000 nmoles  1.000.000 uL (1 Lt)
N° nmoles  x uL
*N° de nmoles depende de cada primer
EJEMPLO:
Primer Haptoglobina (Hp Sense = 17,1 nmoles ; Hp antisense = 16,4 nmoles)
Sense 500.000 nmoles  1.000.000 uL (1 Lt)
17,1 nmoles  x uL x = 34,2 uL
Antisense 500.000 nmoles  1.000.000 uL (1 Lt)
16,4 nmoles  x uL x = 32,8 uL

4.  Para realizar el PCR, es necesario utilizar ambos primer a una concentración de
10uM, por lo tanto se debe preparar la siguiente dilución:
C1 * V1 = C2 * V2
500uM * x = 10uM * 100uL
x = 2 uL de primer a 500 uM
Este cálculo se debe hacer tanto para el primer sense como para el antisense,
y en ambos se obtiene una cantidad de 2 uL
Dilución del Primer (10uM)= 2uL de primer sense + 2 uL de primer antisense + 96 uL de NF-water

5. Cálculo de la T° de alineamiento
 Para realizar este cálculo es necesario aplicar la siguiente fórmula:
2 (A+T) + 4 (C+G)= T°
* Este cálculo se realiza tanto para el primer sense como para el antisense
 Una vez obtenidas ambas temperaturas, se debe calcular el promedio de
ambas
 Posteriormente se debe restar 5°C al promedio, siendo este ultimo resultado
el valor de la T° de alineamiento.

6. EJEMPLO
Sense: CTACAGACCGAAGGAGATGG
2 (A+T) + 4 (C+G)= T°
2 (7+2) + 4 (4+7)
18 + 44
62° C
Antisense: GGCAGATAGGCATGACTTTC
2 (A+T) + 4 (C+G)= T°
2 (5+5) + 4 (4+6)
20 + 40
60° C
Promedio: 61°C
61°C – 5°C = 56°C
T° de alineamiento = 56°C

7. Protocolo PCR
Previo a realizar la técnica debemos asegurarnos de:
 Limpiar bien el sector (mesón y materiales) donde se
va a realizar la técnica con detergente y alcohol
 Todos los materiales a utilizar en el PCR deben estar
esterilizados (puntas, tubos. etc.)

8. Protocolo PCR
- Agregar los siguientes componentes a un tubo eppendorf
esterilizado, de acuerdo al número de reacciones a realizar.
Componentes 1 Reacción
10X PCR Buffer, Minus Mg 2,5 uL
10mM dNTP mixture 0,5 uL
50mM MgCl2 0,75 uL
Primer Mix (10uM de cada uno) 2 uL
cDNA 2 uL *
Taq DNA Polimerasa 0,125 uL **
Control interno (18S) diluído 1:10 ***
H2O destilada esterilizada Llevar a 25uL
Volumen final 25 uL
- Distribuir el Mix en los tubos eppendorf de 0.2 ml
- Agregar el cDNA al tubo que corresponda

9. Protocolo PCR
- Programar el Termociclador para las siguientes temperaturas y
tiempos:
Paso T° Tiempo
1 94°C 4 min
2 94°C 30 seg
3 (Depende del primer) 30 seg
4 72°C 1 min
5 72°C 10 min
6 4°C 000 (pause)
- Mientras se realiza el PCR, preparar en un matraz esterilizado el gel
de agarosa al 1,2% (Se recomienda: 0,36 gr. de agarosa en 30 ml de TAE 1X
)

10. Protocolo PCR
 Una vez obtenidos los productos PCR, agregar a cada tubo 3 uL de
XC
 Mezclar bien y cargar 10 uL de cada muestra (Producto PCR + XC)
en los pocillos del gel.
 En el primer pocillo se debe cargar el marcador de peso molecular,
que se prepara de la siguiente manera:
1 uL de marcador de peso molecular
1 uL de XC
4 uL de H2O DEPC esterilizada
 Correr el gel a 70 V por 40 min aprox.
 Observar en el Transiluminador UV

11. Determinación del número de ciclos
apropiados
 Realizar un PCR variando el número de ciclos (Ej: 24 – 28
– 32 – 34 – 36 – 40) y manteniendo las otras condiciones
constantes.
 Preparar Mix para el número de reacciones a realizar + 1
(Sin considerar el control interno)
 Programar el Termociclador para el número máximo de
ciclos
• Al comienzo se deben colocar todos los tubos en el termociclador,
cuando se vayan cumpliendo los ciclos elegidos, se deben sacar los
tubos.
* Una vez terminados los ciclos, se deben volver a colocar todos los
tubos en el termociclador para el siguiente paso del PCR (72° por
10 min.)

12. Determinación del número de ciclos
apropiados

13. Determinación de la cantidad de
control interno 18S
 Realizar una dilución de 1:10 del Primer 18S con el agua incluida en
el kit (Para preparar 100ul = 10 uL del primer 18S y 90 uL de agua)
 Realizar un PCR variando la cantidad del control interno diluido (Ej: 1
– 2 – 3 – 4 – 5uL) y manteniendo las otras condiciones constantes
 Preparar Mix para el número de reacciones a realizar + 1 (Sin
considerar control interno y H2O)
 Agregar Control interno y Agua DEPC esterilizada en la cantidad que
corresponda a cada tubo
 Programar el Termociclador para el número de ciclos elegidos

14. Determinación de la cantidad de
control interno 18S