1) El documento describe las etapas de la glucólisis y la fermentación láctica, incluyendo los intermediarios y enzimas involucrados. 2) Explica que el fosfato mantiene fosforilados los intermediarios de la glucólisis para retenerlos en la célula y conservar la energía. 3) También compara las diferencias entre el músculo rojo y blanco en términos de su metabolismo y fuentes de ATP.

1. REGULACIÓN METABÓLICA Prof. Italo Chiffelle G. Bioquímico, Dr.

2. Fase Preparatoria Dihidroxiacetona-P + Gliceraldehido-3P 1a) D- Glucosa Glucosa-6P Fructosa-6P Fructosa-1,6 biP HEXOQUINASA ISOMERASA FPK-1 ALDOLASA ISOMERASA ATP ATP Fase de Beneficios (x 2) 1,3-BiP Glicerato 3-P Glicerato 2-P Glicerato Fosfoenolpiruvato Piruvato DESHIDROGENASA FOSFO GLICERATO QUINASA FOSFO GLICERATO MUTASA ENOLASA PIRUVATO QUINASA ATP ATP

3. 1b) EL ROL DEL FOSFATO EN LA GLICÓLISIS ES EL DE MANTENER FOSFORILADOS CADA UNO DE LOS NUEVE INTERMEDIARIOS DE LA RUTA, PORQUE DE ESTA MANERA: Se encuentran cargados negativamente y no podrán salir de la célula, a pesar de las diferencias de concentración con el extracelular (permitiendo, por ejemplo, capturar más glucosa). De esta manera no se gasta energía en retener los compuestos dentro de la célula Se conserva la energía de enlace anhidro-fosfórico de moléculas de ATP en la energía de enlaces ésteres-fosfato de moléculas, tales como, Glucosa 6-P Muchas enzimas usan complejos en sus sitios activos, formados por algunos grupos fosfato, lo que aumenta la energía de unión a la enzima y por ende, permite aumentar la velocidad de reacción y disminuir la energía de activación de la reacción en cuestión.

4. 2) GLUCÓGENO FOSFORILASA FOSFOGLUCOMUTASA D- Glucosa Glucosa-6P Fructosa-6P Fructosa-1,6 diP Dihidroxiacetona-P + Gliceraldehído-3P HEXOQUINASA ALDOLASA FRUCTO QUINASA HEPATICA HIGADO Glucógeno Glucosa 1-P D- Fructosa Lactosa Sacarosa Fructosa 1-P Gliceraldehído * Galactosa Galactosa 1-P * Galactosa UDP- galactosa + Glucosa 1-P UDP- glucosa Glucosa 1-P UDP- glu

5. 3) Efecto Pasteur Pasteur descubrió que la tasa y la cantidad total de glucosa consumida en condiciones anaeróbicas es 18 veces más grande que en condiciones aeróbicas. En condiciones anaeróbicas, la ausencia de oxígeno obliga a la célula a producir ATP sin utilizar la fosforilación oxidativa, puesto que el último aceptor de electrones es esta molécula. De esta manera, para producir ATP, el organismo estimula la glicólisis, acumulándose Piruvato, el que formará lactato por fermentación láctica. Cuando un tejido en el que está ocurriendo glicólisis es expuesto a oxígeno, esta vía metabólica es inhibida. ¿Cuál es la causa de esta inhibición?

6. 4) La regulación de la glicólisis se efectua nivel de 4 enzimas: D- Glucosa Glucosa-6P Fructosa-6P Fructosa- 1,6 diP Glucógeno Glucosa 1-P FPK-1 FPK-2 FBPasa 1 FBPasa 2 Fructosa- 2,6 diP a) Fosfofructoquinasa 1 (Mayoría Células) AMP, ADP AMP, ADP, Fru- 2,6 diP ATP, Citrato ATP, Citrato Glucagón

7. D- Glucosa Glucosa-6P Fructosa-6P Fructosa- 1,6 biP Glucógeno Glucosa 1-P b) Piruvato Quinasa (Mayoría Células) ATP, Acetil CoA PEP Piruvato Piruvato Quinasa

8. Glucosa-6P Fructosa-6P Glucógeno Glucosa 1-P c) Glucógeno Fosforilasa Fructosa- 1,6 biP PEP Piruvato GF a (activa) GF a (activa) Músculo Hígado Adrenalina AMPc GF b (inactiva) Fosforilasa b quinasa (activa) Fosforilasa b quinasa (inactiva) GF b inactiva Glucagón AMPc Fosforilasa b quinasa (inactiva) Fosforilasa b quinasa (activa) AMP Glucosa Glucosa a la sangre Fosfatasa Continúa oxidándose

9. Glucosa-6P Fructosa-6P d) Hexoquinasa Fructosa- 1,6 biP PEP Piruvato Músculo Hígado D- Glucosa Glucógeno Glucosa 1-P D- Glucosa Hexoquinasa (glucoquinasa) Hexoquinasa Glucosa sanguínea Glucosa

10. Comparación de Hexoquinasa y Glucoquinasa en mamíferos CARACTERISTICA ENZIMA HEXOQUINASA GLUCOQUINASA Localización La mayoria de los tejido (baja en Hígado) Hígado Sustrato Muchas hexosas Glucosa K M para glucosa 0,1 mM 10 mM Producto de la reacción con Glucosa Glucosa-6P Glucosa-6P Inhibida por Glucosa-6P Sí No La concentración de glucosa en la sangre es 5 mM, valor que es regulado por el hígado.

11. 11) Relación entre Fermentación lactica y Gluconeogénesis Músculo : ATP producido por la glicolisis por la rápida contracción Hígado : ATP usado en síntesis de glucosa durante la recuperación Lactato Glucosa Lactato Glucosa ATP Lactato Glicogeno ATP Sangre

12. Fosfatos de Alta Energía La necesidad de ATP en el músculo puede cambiar rápidamente. El músculo en actividad máxima usa 1.000 mmol / min kg y la concentración de ATP es 3-5 mmol / kg de músculo, es la cantidad para 10 contracciones y se agotaría en 1 seg de actividad intensa Los músculos esqueléticos y cardíacos tienen altas cantidades de fosfato de creatina (25 mmol / kg). Esta sirve para regenerar ATP, en la única reacción catalizada por la creatina quinasa Creatina-P + ADP Creatina + ATP  Gº´= -12 kJ/mol En el músculo: [Creatina-P]/[ATP] = 5

13. Además el AMP es un activador de la fosfofructoquinasa y por lo tanto promueve la glicólisis Otra forma de regenerar ATP es a través de la reacción catalizada por la adenilato quinasa Creatina ATP ADP + P Creatina-P AMP ADP ATP ADP ATP ADP Creatina quinasa Adenilato quinasa CONTRACCIÓN Miosina ATPasa 2 ADP ATP + AMP  Gº´= 0 (Reac. Isoergónica)

14. COMPARACIÓN DEL MÚSCULO ESTRIADO ROJO Y BLANCO ROJO BLANCO CARACTERÍSTICAS Tamaño Relativo de la Fibra Modo de contracción Pequeño Lenta Grande Rápida (5 veces más) Principal combustible almacenado Células Grasas Glucógeno del músculo Principal fuente de ATP Oxidación de Ácidos Grasos Glucólisis Vascularización Mioglobina Intensa Mucha Más ligera Poca Mitocondrias Mucha Poca  La coloración del Músculo Rojo se debe a las altas concentraciones de mioglobina y citocromo mitocondrial. Importante Maratón (Aeróbico)  Músculo Blanco importante carreras de velocidad (Anaeróbico)

15. CINÉTICA ENZIMATICA Prof. Italo Chiffelle G. Bioquímico, Dr.

16. Las reacciones químicas catalizadas en las células suceden con una rápidez de 10 4 a 10 8 veces lo que es posible reproducirlas en el tubo de ensayo Reacción: Sustrato Producto k directa k inversa Tubo de ensayo: S P K equilibrio = [P]/[S] = k directa k inversa k directa k inversa El valor de K equilibrio es igual sin o con enzima

17. Ecuación de Arrhenius: k: constante de velocidad R: constante de los gases ideales A: probabilidad que los choques den producto  E: energía de activación Factores que afectan las enzimas  E  E E n e r g í a Coordenada de reacción S P [Complejo Activado] # k = A e -  E/ RT

18. TIPOS DE ENZIMAS: 1- Enzimas Cooperativas o Alostéricas . Dan curvas de velocidad contra sustrato que son Sigmoidales más que hiperbólicas, se denominan enzimas de control o reguladoras y por lo general están situadas en el inicio o en los puntos de ramificación de una ruta metabólica. La gráfica representa una curva sigmoidal. [S] Velocidad (  P/  t) Lc 19:26. “Yo les digo que a todo el que produce se le dará más, pero al que no tiene, se le quitará aun lo que tiene”

19. K M V máx/ 2 V máx La curva representa una hipérbola rectangular. Es un comportamiento típico de una reacción de saturación [S] Velocidad (  P/  t) Michaelis-Menten establecieron los siguientes equilibrios: K asociación K disociación S + E [ES] # P + E K disociación= [E] [S]/ [ES] = Ks ES es un complejo activado con uniones no covalente y d[ES]/dt=0 (Estado estacionario). Bases mecanísticas de la ecuación de Michaelis-Menten 2- Enzimas Michaelis-Menten . Dan curvas de velocidad contra sustrato que son hiperbólicas . K catalítica

20. Velocidad = K catalítica [ES] [E total ] = [E libre ] + [ES]  [E libre ] = [E total ] - [ES]  Ks=[E total - ES] [S  / [ES   Ks [ES  =[E total - ES] [S  Ks [ES  =[E total ] [S  - [ES] [S  [ES   Ks + [S  = [E total ] [S  [ES  = [E total ] [S  / Ks + [S   Velocidad = K catalítica {[E total ] [S  / Ks + [S  } Por analogía: K catal [E total ] = V máxima  Velocidad = V máx [S  / {K M + [S  }

21. Metodología de Lineweaver-Burk: Se determina el recíproco de la ecuación anterior y se tiene una ecuación lineal 1/ V = K M / V máx [S  + 1 / V máx Pendiente= K M / V máx 1/V máx - 1/K M 1/ [S] 1/ V Velocidad = V máx [S  / {K M + [S  } Ecuación de Michaelis-Menten

22. Metodología de Hanes-Woolf: Se multiplica la ecuación anterior por la concentración del sustrato,  S  . Se tiene una ecuación lineal y el error experimental se hace menor. [S  / V = K M / V máx + [S  / V máx Pendiente= 1/ V máx K M / V máx - K M [S] [S] / V Con cualquiera de las dos últimas metodologías (Ec. Lineales) se tienen valores más confiables de K M y V máx, que en la forma directa (Ec. de una hipérbola).

23. Inhibición Enzimática-Ecuaciones Tipos de inhibidores reversibles:  Competitivo (I + E)  Acompetitivo (I + ES)  No-competitivo (I + E + ES)  Mixto Inhibidor Competitivo: S + E [ES] # P + E + I E I K E I K E I = [E] [ I ]/ [E I ] y [Etotal] = [E]+[ES]+[E I ] [ES]= [Et] [S]/ K M ’+[S] donde K M ’= K M (1+[ I ]/ K E I )  V = V máx [S]/ K M ’+ [S]

24. 1/V máx - 1/K M 1/ [S] 1/ V [ I ]= 0 [ I ]= K M [ I ]= 4 K M Inhibición Competitiva: Rectas Convergentes en ORDENADA K M  si [I]  Inhibidor Competitivo: S + E [ES] # P + E + I E I K E I K E I = [E] [ I ]/ [E I ] y [Etotal] = [E]+[ES]+[E I ] [ES]= [Et] [S]/ K M ’+[S] donde K M ’= K M (1+[ I ]/ K E I )  V = V máx [S]/ K M ’+ [S]

25. - 1/K M 1/ [S] 1/ V [ I ]= 0 [ I ]= K M [ I ]= 4 K M Inhibición Acompetitiva: Rectas Paralelas K M  y V máx  si [I]  Inhibidor Acompetitivo: S + E [ES] # P + E + I ES I K ES I K ES I = [ES] [ I ]/ [ES I ] y [E total] = [E]+[ES]+[ES I ]  V = V’ máx [S]/ K M ’’+ [S] Donde V máx’= V máx/ (1+[ I ]/ K ES I ) y K M ’’= K M (1+[ I ]/ K ES I ) [ES]= 1/V máx [E t] [S]/(1+[ I ]/ K ES I ) K M /(1+[I]/K ES I )+[S]

26. - 1/K M 1/ [S] 1/ V [ I ]= 0 [ I ]= K M [ I ]= 4 K M Inhibición No-competitiva: Rectas Convergentes en ABSCISA Inhibidor No-competitivo: S + E [ES] # P + E + I ES I K ES I Si K I =K ES I = K E I y [E total] = [E]+[ES]+[E I ]+ [ES I ]  V = V’ máx [S]/ K M + [S] + I E I K E I [E t] [S]/(1+[ I ]/ K I ) K M +[S] [ES]=

27. Características de los Diferentes Tipos de Inhibidores Tipo de inhibición Inhibidor se combina con: Efecto aparente sobre V máx. Efecto aparente sobre K M Efecto sobre las gráficas 1/V v/s 1/ [S] E Ninguno  CONVERGENTE EN el eje de la ORDENADA ES   Rectas PARALELAS Competitiva Acompetitiva No-competitiva: a) Simple (K ESI =K EI ) b) Mixta 1 (K ESI  K EI ) c) Mixta 2 (K ESI  K EI ) E y ES      Ninguno CONVERGENTE EN el eje de la ABSCISA CONVERGENTE por ENCIMA de la ABSCISA CONVERGENTE por DEBAJO de la ABSCISA

28. Se investigó el efecto de un inhibidor I sobre la velocidad de una reacción catalizada enzimaticamente sobre un solo sustrato, obteniéndose los siguientes resultados: Concentración de sustrato [S] (mM) Concentración del Inhibidor [I] (mM) 0 0,5 1,0 0,33 0,20 0,14 0,50 0,33 0,25 0,67 0,50 0,40 0,80 0,67 0,57 0,83 0,71 0,63 0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 Velocidad de reacción (  M/ min) a) Determine K M y V máxima de la enzima b) Qué tipo de inhibidor está presente

29. Solución) a) Primero se determina las constantes a través del método de los recíprocos. 20 10 5 2,5 1,25 1/ [S] 3 2 1,5 1,3 1,2 1/ v [I]= 0 0,5 1,0 5 3 1 1,5 1,4 7 4 2,5 1,8 1,6

30. Del gráfico se ve que V máxima no varia pero si K M con la presencia del inhibidor, luego el tipo de inhibición es competitiva 10 0 -5 -10 10 5 20 Intersección: -1/K M = -10  K M =0,1 Intersección: 1/Vmáx= 0,93  V máx=1,08 1/ v 1/ [S] [I]= 0 [I]= 0,5 [I]= 1

31. Características de los Diferentes Tipos de Inhibidores Tipo de inhibición Inhibidor se combina con: Efecto aparente sobre V máx. Efecto aparente sobre K M Efecto sobre las gráficas 1/V v/s 1/ [S] E Ninguno  CONVERGENTE EN el eje de la ORDENADA ES   Rectas PARALELAS Competitiva Acompetitiva No-competitiva: a) Simple (K ESI =K EI ) b) Mixta 1 (K ESI  K EI ) c) Mixta 2 (K ESI  K EI ) E y ES      Ninguno CONVERGENTE EN el eje de la ABSCISA CONVERGENTE por ENCIMA de la ABSCISA CONVERGENTE por DEBAJO de la ABSCISA