La interacción proteína-ligando ocurre en un sitio específico de la proteína. La constante de asociación y el número de sitios de unión determinan la fuerza de unión. Las curvas de saturación pueden ser hiperbólicas o sigmoidales dependiendo de si la unión es cooperativa o no. Los gráficos de Scatchard y Hill analizan los parámetros de unión y el tipo de cooperación. La hemoglobina exhibe unión cooperativa positiva con oxígeno.

1. INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO Prof. Italo Chiffelle G. Bioquímico, Dr.

2. En la mayoría de las proteínas globulares (P), el evento inicial de su acción es fijarse a otra sustancia, denominada ligando (L). La interacción de P y L ocurre en un lugar específico de la proteína, llamado sitio de fijación (n) K es la constante de fijación o constante de asociación en equilibrio donde n= 1, 2, 3, ….. Asociación: P + nL PL n k directa k inversa K fijación = [PL n ]/([P] [L] n ) = k directa k inversa

3. Parámetros de interés Biológico: 1.- El número de sitios de fijación (valor de n) 2.- La fuerza de fijación (valos de K) 3.- Especificidad de P por los L 4.- Si n ≥ 2, tipo interacción entre sitios (valor de c) CUANTIFICACIÓN DE LA UNIÓN L Y P. Función de saturación (v): v = [L] fijado / [P] total Los límites de v son v=0 (no hay L fijado) y v=n (L máximo fijado, proteína 100% saturada)

4. v = n K [L] i c / (1+K [L] i c ) Relación entre v y concentración de L inicial: Patrones de fijación cooperativa y no cooperativa CURVA SIGMOIDAL v [L] i La gráfica directa de v contra [L] i da 2 tipos de curva con diferente tipo de fijación: Concentración Ligando inicial ([L] i ) Función de saturación (v) CURVA HIPEBÓLICA

5. Una Curva Hiperbólica, significados posibles: 1.- Una proteína con n=1 2.- Una P con n ≥ 2 y no-cooperativo, los eventos de fijación son independientes entre sí 3.- Una P con n ≥ 2 y negativamente cooperativo, la fijación de L interfiere en otro evento de fijación en un sitio distinto Una Curva Sigmoidal significa solamente que entre P y L existe una fijación positivamente cooperativa

6. Análisis matemático para determinar las distintas constantes (n, K, c) y tipo de cooperación. De la ecuación: v = n K [L] i c / (1+K [L] i c ) * En PRIMER lugar se omite c y se ordena para obtener una ecuación lineal: v/ [L] i = n K - K v GRÁFICO DE SCATCHARD Pendiente= - K n nK Función de saturación, v v/ [L] i

7. Función de saturación, v v/ [L] i 1 2 3 n Tipo de fijación, según gráfico de Scatchard: No-cooperativo: Lineal y n ≥ 1 Cooperación Negativa: No-lineal y n ≥ 2 (la curva pasa por un mínimo, convexa) Cooperación Positiva: No-lineal y n ≥ 2 (la curva pasa por un máximo, cóncava)

8. * En SEGUNDO lugar sin omitir c y se reordena para obtener una ecuación lineal: log [v/ (n – v) ] = c log [L] i + log K Ecuación de Hill Log [L] inicial Log [v(n-v)] Pendiente= c log K Tipo de fijación, según gráfico de Hill: No-cooperativo: c= 1 Cooperación Negativa : c<1 Cooperación Positiva : c>1

9. Fijación de O 2 (g) a la Hemoglobina: Presión parcial de O 2 (gas) (Torr) Saturación con O 2 (g) (%) 10 30 100 Sangre pulmonar Músculo activo Músculo en reposo Mioglobina (M, no-cooperativa, n=1, c=1) Hemoglobina (  2 β 2 , cooperativa positiva, n=4, c=+2,8)  2 β 2  2 β 2 -O 2  2 β 2 -2O 2  2 β 2 -3O 2  2 β 2 -4O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 facilitada x400 facilitada

10. En un experimento la concentración de enzima es constante, 11 μ M, y la concentración de inhibidor [I] vario (uM). Los siguientes resultados fueron obtenidos Determinar la constante de asociación de la Enzima-Inhibidor y el número de sitios de unión en la enzima (n) 45,8 27,4 18,9 11,3 7,95 4,8 2,3 [I] libre 62,4 41,6 31,2 20,8 15,6 10,4 5,2 [I] total 0,0218 0,0365 0,0529 0,0885 0,1258 0,2083 0,435 1/ [I] libre 0,0329 0,0471 0,0592 0,0764 0,0875 0,1061 0,115 v/ [I] libre 0,6627 0,7746 0,8943 1,1579 1,4379 1,9643 3,793 1/v 1,5091 1,2909 1,1182 0,8636 0,6955 0,5091 0,264 v= [I] unido/ [P] 16,6 14,2 12,3 9,5 7,65 5,6 2,9 [I] unido 45,8 27,4 18,9 11,3 7,95 4,8 2,3 [I] libre 62,4 41,6 31,2 20,8 15,6 10,4 5,2 [I] total