Este documento describe un proyecto de investigación sobre la caracterización de proteínas de alto valor en las semillas del olivo y su potencial uso en la alimentación de organismos marinos. El proyecto analiza la composición proteica de las semillas a través de técnicas como SDS-PAGE, cromatografía y espectrometría de masas, y caracteriza proteínas de almacenamiento como las 11S, con el objetivo de desarrollar harinas y aceites de semilla de olivo para la acuicultura.

1. Componentes proteicos de
alto valor añadido en la semilla del olivo:
proyecto PROTEOLIMAR de
alimentación de organismos marinos
Dr. Juan de Dios Alché Ramírez
Departamento de Bioquímica,
Biología Celular y Molecular de Plantas.
Estación Experimental del Zaidín. CSIC
GRANADA
GRUPO PAIDI BIO-283

2. Estos científicos no
me estudian
lo suficiente
Os voy a hacer
estornudar!!
Mis frutos son
“oro verde”

4. JUNTA DE ANDALUCÍA. PLAN ANDALUZ DE INVESTIGACIÓN (PAI)
PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN DE EXCELENCIA. CONVOCATORIA 2010
LÍNEA ESPECÍFICA DEL OLIVAR Y EL ACEITE DE OLIVA
Referencia AGR-6274
2011-2015
Ministerio de Economía y Competitividad y Agencia IDEA
Proyecto INTERCONNECTA
Referencia ITC-20131031
2013-2014

5. EL FRUTO DEL
OLIVO COMO
DRUPA
Nevadillo de Alhama
Endocarpo
Epicarpo
Mesocarpo
Endocarpo
Semilla
Mesocarpo

6. EL FRUTO DEL
OLIVO COMO
DRUPA
LA SEMILLA DEL OLIVO: Un material
inexplorado e inexplotado: Endospermo +
Embrión.
Endocarpos
Semillas
ENDOSPERM a ENDOSPERM b
EMBRYO

9. PROGRAMA ESTATAL DE INVESTIGACIÓN, DESARROLLO E INNOVACIÓN ORIENTADA A
LOS RETOS DE LA SOCIEDAD.
Programa Retos-Colaboración 2015. Referencia RTC-2015-4181-2
2015-2017

10. http://www.grupoelayo.es
http://www.eez.csic.es
Acuicultura de Granada

13. Pulpa de
aceituna
Hueso de
aceituna
Aceitunas
Pulpa de
aceituna
deshidratada
Semilla de olivo
Harina
de semilla
de olivo
Aceite
de semilla
de olivo
Harina de
aceitunas
deshidratadas
Aceite de
aceitunas
deshidratadas

14. Deshuesadora de aceituna desarrollada
por ELAYOTECNIA S.L.
Planta de secado, partido y clasificado de
hueso y semilla de ELAYOTECNIA S.L.

15. Proceso de secado y
molturación de la semilla
extraída del hueso de la
aceituna
1,3 y 4 son semillas o trozos de
semillas, y 2,5,6 y 7 son huesos.

16. Prensa
manual
hidráulica
en
discontinuo
.
Prensa manual
en continuo

17. Equipo de
extracción con
fluidos
supercríticos
Prensa semi-industrial de
rodillo para extraer el aceite
de la semilla de
ELAYOTECNIA S.L.

19. CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA
ACEITUNA.
• Análisis histológico de mesocarpo + piel
CARACTERIZACIÓN DE
VARIEDADES DE OLIVAR
AUTÓCTONO DE LA D.O.P.
PONIENTE DE GRANADA
Análisis histológico de secciones
completas de mesocarpo + piel
con especial atención a la
presencia y distribución de:
- Número de capas celulares
- Tamaño celular
- Grosor de la cutícula (Cu)
- Grosor de la epidermis (Ep)
- Presencia de lípidos (L)
- Presencia de esclereidas (Es)
- Cloroplastos (P) y peroxisomas
-Núcleos (N) e inclusiones
intranucleares cristalinas (IN,
flechas).
L
IN

20. CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA
ACEITUNA.
• Análisis histológico de endospermo + testa
CARACTERIZACIÓN DE
VARIEDADES DE OLIVAR
AUTÓCTONO DE LA D.O.P.
PONIENTE DE GRANADA
Análisis histológico de secciones
completas de endospermo + testa con
especial atención a la presencia y
distribución de:
- Número de capas celulares
- Tamaño celular
- Grosor de la cutícula interna (Cin)
- Presencia de haces vasculares (HV)
- Presencia de cuerpos lípidos (CL,
flechas)
- Presencia de cuerpos proteicos (CP,
cabezas de flechas)
- Cloroplastos (P) y peroxisomas

21. CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA
ACEITUNA.
• Análisis histológico de embrión
CARACTERIZACIÓN DE
VARIEDADES DE OLIVAR
AUTÓCTONO DE LA D.O.P.
PONIENTE DE GRANADA
Análisis histológico de secciones
completas de embrión con especial
atención a la presencia y distribución
de:
- Número de capas celulares
- Tamaño celular
- Grosor de las epidermis (Ep)
- Presencia de haces vasculares (HV)
- Presencia de cuerpos lípidos (CL,
flechas)
- Presencia de cuerpos proteicos (CP,
cabezas de flechas)
variedad GORDAL DE ALHAMA

23. 1-D PROTEIN PROFILE OF THE
OLIVE SEED.
THE 11S SSPS IN
THE OLIVE SEED

24. 2-D PROTEIN PROFILE OF THE
OLIVE SEED.
THE 11S SSPS IN
THE OLIVE SEED
Figure 2. Proposed model showing the composition of the
subunits of the different 11S proteins found in olive
mature seeds.
Table 2. Storage proteins of olive
seeds identificated by MALDI-TOF.
Table 1. Molecular
masses estimated for
the selected spots of
Fig 1A and 1B
ENDOSPERM
COTYLEDON
Estimated
molecular
mass kDa
basic
acidic Estimated
molecular
mass kDa
basic
acidic
ENDOSPERM

25. CELL LOCALIZATION OF 11S SSPs IN THE
OLIVE SEED.
THE 11S SSPS IN
THE OLIVE SEED
A) Light microscopy thin sections stained with methylene blue.
B) Fluorescence immunolocalization of 11S SSPs in protein
bodies using a polyclonal antibody.
C) Fluorescence localization of lipid bodies using Nile Red.
D) Ultrathin sections of olive endosperm. Transmission
Electron Microscopy. Bars=50 µm.

27. De novo construction and
functional annotation of an
olive seed transcriptome

28. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
1) Semantic and name searches were carried out in the generated annotations using key words.
2) BLASTP searches of known, conserved sequences for 11S.
3) Annotations were manually screened for specific sequences selected from well-established bibliography resources.
SELECTION OF 11S TRANSCRIPTS

29. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
ALIGNMENT OF AMINO ACID
SEQUENCES
1. ALIGNMENTS by Clustal Omega software (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
2. ALIGNMENTS VISUALIZATION by Bioedit V7.0.5.3 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html).
3. Paired sequence (overlapping) reads were matched and joined to complete full-length sequences. Various mismatches in
the overlapping sequence reads were allow in order to obtain these full sequences.
4. Protein sequences derived from these final alignments were further analyzed for the PRESENCE OF PUTATIVE
FUNCTIONAL (BIOLOGICALLY MEANINGFUL) MOTIFS by the ScanProsite program
(http://www.expasy.org/tools/scanprosite), and to confirm the identity of the final (mature) sequences.
5. Protparam tool (http:// http://web.expasy.org/protparam/) was used to identify theoretical pI and molecular weight).

30. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
PHYLOGENETIC TREE
1. PHYLOGENETIC TREE was constructed with the aid of the software Seaview [Gou et al. Molecular biology and
evolution. 27, 221–4 (2010)] using the maximum likelihood (PhyML) method implemented with the LG model of the most
probable amino acid substitution calculated by the ProtTest 2.4 server [Abascal et al. Bioinformatics (Oxford, England).
21, 2104–5 (2005).]. The branch support was estimated by bootstrap resampling with 100 replications.
2. SELECTION OF SEQUENCES in the seed transcriptome based on the results of the phylogenetic tree. As the criteria for
selection, we designated their presence within the output results from the BLASTP (E-value=0.0 to e-14) alongside the
whole NCBI database, and their clustering with previously characterized 11S sequences in the phylogenetic analysis
Fig. 2. Phylogenetic analysis of olive 11S seed storage
protein sequences. Olive sequences obtained by NGS and
most relevant orthologous identified in the NCBI database were
used. Tree is divided in two big clusters, named Group 1 and
Group 2. Group 2 contains sequences less-related to olive from
a variety of plant species.

31. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
PHYLOGENETIC TREE
Sequences from group 1 included all retrieved olive sequences (dark grey box). Sequences from Lamiales/Solanales are
framed with doted and dashed lines. Asterisks (*) highlight the sequences from tobacco, sesame and common yellow
monkey flower used for the alignment in Fig 1. Arrows point out two sequences from group 1 and 2 corresponding to 11S
isoform 2 and 4 from the same species (sesame). Measurements of support for the nodes are represented as
percentages.

32. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
STRUCTURE PREDICTION
of BOTH α and β SUBUNITS
INTRA- AND INTER-MOLECULAR
DISULPHIDE BONDS
HEXAMER FORM
1. HOMOLOGY MODELING (http://swissmodel.expasy.org/workspace/) by using 3ehk, 2e9q, 1od5, 3c3v, 3kgl and 2d5f
protein templates (alpha subunit) and 1fxz, 2e9q, 1od5, 3c3v, 3qac and 3kgl protein templates (beta subunit) available in
PDB (http://www.pdb.org).
2. VISUALIZATION OF MODELS was made by PyMol software (https://www.pymol.org/).

33. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
STRUCTURE PREDICTION VERSUS
ELECTROSTATIC POTENTIAL
1. Poisson–Boltzmann ELECTROSTATIC POTENTIALS were obtained using APBS (DeLano Scientific LLC) molecular
modeling software implemented in PyMol 0.99 (www.pymol.org ) with AMBER99 to assign the charges and radii to all of
the atoms (including hydrogens), which were added and optimized with the Python software package PDB2PQR. Fine
grid spaces of 0.35 A ° were used to solve the linearized PB equation in sequential focusing multigrid calculations in a
mesh of 130 points per dimension at 310.00 K. The dielectric constants were 2.0 for the protein and 80.00 for water. The
output mesh was processed in the scalar OpenDX format to render isocontours and maps onto the surfaces with PyMOL
0.99. Potential values are given in units of kT per unit charge (k Boltzmann’s constant; T temperature).
Three-dimensional structure of
olive 11S protein
corresponding to the α (A) and
ß (B) subunits. Structures
were depicted as a cartoon
diagram. α-helices, β-sheets
and coils are depicted in red,
yellow and green,
respectively. Two views
rotated 180 degrees round the
x-axis are provided for both
subunits of surface (green and
blue) and electrostatic
potential representation. The
electrostatic potential surface
colors are clamped at red (-
10) or blue (+10).

34. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
α/β –INTERACTING COMPLEXES
Representation of
the 11S α/β –
interacting
complexes. Three
views rotated 30
and 45 degrees
around the x-axis
are provided (α in
purple and ß as a
cartoon diagram).
1. For DOCKING ANALYSIS of 11S protein, we considered backbone flexibility by using rigid-body ensemble docking with
multiple structures derived from NMR. The Fast Fourier Transform (FFT) correlation approach to protein–protein docking
evaluated the energies of billions of docked conformations on a grid. To obtain decoys by rigid-body docking, we used the
option ZDOCK for sampling at 6-degree rotational steps in CLUSpro server. Using Fast Fourier Transform, ZDOCK
searches for all possible binding orientations of a ligand along the surface of a receptor protein, optimizing desolvation,
shape complementarily and electrostatics. The top 2,000 structures, along with their ZDOCK scores, were used as
candidates of near-native structures. The docking score was calculated by considering several interaction properties, e.g.,
shape complementarity, desolvation, and electrostatics potential. For each docked conformation, we computed the
residues of the ligand within 10 A ° of its receptor. This RMSD computing analysis was done for all the 2,000 ligands in
this study. After clustering, the ranked complexes are subjected to a straightforward (300 steps and fixed backbone) van
der Waals minimization using CHARMM to remove potential side chain clashes. Best scoring was chosen as higher
possible model for proteins interaction.

35. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
IDENTIFICATION OF T-cell EPITOPES
1. Stabilization matrix alignment methods allowing direct prediction of PEPTIDE MHC BINDING SEQUENCES AND
AFFINITIES were used for both alpha and beta peptides: TEPITOPE (www.bioinformation.net/ted), Propred
(www.imtech.res.in/raghava/propred) (using quantitative matrices), NetMHCII (www.cbs.dtu.dk), Multipred (antigen.i2r.a-
star.edu.sg/multipred), CTLpred (www.imtech.res.in/raghava/ctlpred) (artificial neural network approach), and RANKPEP
(Position-specific scoring matrix, bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) which employ binding status scoring qualitative
prediction methods and were used for predicting T-cell epitopes. HLA class II binding peptides of Ole e 12 were also
predicted by inhibitory concentration (IC50) value based in quantitative prediction methods MHCpred (www.ddg-
pharmfac.net/mhcpred/MHCPred), SVRMHC (SVRMHC.umn.edu/SVRMHCdb), ARB matrix methods
(www.epitope.liai.org:8080/matrix), SMM-Align in MetaMHC (www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/MetaMHCII/server.html).
Promiscuous peptides binding to multiple HLA class II molecules were selected.
Position of the epitope in each subunit is numbered at the
beginning and end of the sequence.

36. 11S SSPS IN THE OLIVE
SEED TRANSCRIPTOME
FUTURE STRAGIES AND
BIOTECHNOLOGICAL APPROACHES
based on structural analyses
- Codon optimisation and in vitro expression to generate material (recombinant allergens) for diagnosis and
therapy (desensitization).
- Generation of specific antibodies.
- Development of quantification methods for standardisation of vaccines
- Design of hypoallergens and new variants
- Design of chimera allergens
- Design of multi-allergens
- Analysis of digestibility
- Internalisation experiments

37. SDS-PAGE Coomassie ANTI-CONGLUTINAS

38. A B
D E
C
F
G H
A
B
C
D
E
F
G
H
Catalasa
Glutatión reductasa
Cu,Zn superóxido dismutasa
Gamma glutamil-cisteín-sintetasa
Glutatión sintetasa
NADPH oxidasa
Glutatión peroxidasa
Glutatión S-transferasa

40. Recogida de erizos de mar en la franja
infralitoral. Posteriormente se tomarán
muestras biológicas y biometría de los
animales recogidos.
Medición de los erizos

41. Proceso de extracción de
gónadas. La coloración de la
gónada se mide por comparación
con la escala comercial Pantone
y, rápidamente las muestras son
congeladas y guardadas para su
posterior análisis.
Gónadas de erizos

42. Nursery de Acuicultura de Granada

44. ANÁLISIS DE DIGESTIBILIDAD DE
EXTRACTOS DE SEMILLA
FRACCIONAMIENTO DE
COMPONENTES DE LA
ACEITUNA Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES BIOACTIVOS

45. ANÁLISIS DE DIGESTIBILIDAD DE EXTRACTOS
DE SEMILLA
FRACCIONAMIENTO DE
COMPONENTES DE LA
ACEITUNA Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES BIOACTIVOS

46. ANÁLISIS DE ESTABILIDAD TÉRMICA DE
EXTRACTOS DE SEMILLA
FRACCIONAMIENTO DE
COMPONENTES DE LA
ACEITUNA Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES BIOACTIVOS

47. ESTUDIO DE CONTENIDO EN GLUTEN.FRACCIONAMIENTO DE
COMPONENTES DE LA
ACEITUNA Y AISLAMIENTO DE
COMPONENTES BIOACTIVOS

49. ANTIINFLAMATORY effects of flours purified from
olive seeds in diabetic patients.
2015
Elena Lima1, Victor Alché2, Adoración Zafra1, José Miguel
Benavente3, Sandra Carmona4, Yaiza Palma5, Mengyao Pan6,
Cristina Pedrosa4, Juan Pedro Sánchez-Rivas7, Jose Carlos
Jimenez-Lopez1, Francisco Manuel Marco8, Juan de Dios Alché1*
1Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants,
Estación Experimental del Zaidín (CSIC), Profesor Albareda 1, 18008
Granada, Spain
2Andalusian Health Service. Granada, Spain.
3IES Juan XXIII, Camino Santa Juliana s/n, 18007 Granada, Spain.
4IES Zaidín-Vergeles, Primavera 24, 26, 18080 Granada, Spain.
5IES Aricel, Aricel s/n, 18220 Albolote, Granada, Spain.
6IES Generalife, Huerta del Rasillo s/n, 18004 Granada, Spain.
7ELAYOTECNIA S.L. Almendro, 31, Polígono Industrial El Cerezo, 23670
Castillo de Locubín. Jaén, Spain.
8Department of Biotechnology, University of Alicante, Alicante, Spain
*autor para correspondencia: juandedios.alche@eez.csic.es

50. INTRODUCTION
Olive oil plays a well-established, beneficial role in promoting good
health. Oil retains the compounds that the fruit develops in
response to environmental stress, especially phenolic compounds.
Moreover, virgin olive oil is an integral ingredient of a
Mediterranean diet. Its nutritional and medical benefits are
widely known and approved. Indeed, virgin olive oil has been used
as a folk remedy for combating diseases due to its hypotensive,
cardioprotective, antimicrobial, anti-hyperglycemic, anticancer,
and anti-inflammatory pharmacological properties.

51. A subclinical inflammatory reaction has been shown to precede the
onset of type 2 (non-insulin-dependent) diabetes.
An olive-oil-rich diet is not only a good alternative in the treatment
of diabetes. It may also help to prevent or delay the inflammatory reaction of
the disease.

52. 1) To investigate the anti-inflammatory effects of optimized olive
seed flour in whole blood cultures from healthy and diabetic
patients.
OBJECTIVE

53. MATERIALS AND METHODS
• Specialised flours were obtained from olive seeds isolated from olive fruits by the company Elayo
(Castillo de Locubín, Jaén). The flours were de-fatted by supercritical fluid technology (SCF) by the
company Fluysur (Castillo de Locubín, Jaén)

54. MATERIALS AND METHODS
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A: 1μg/ml Phorbol 12 myristate 13 acetate +
ionomicine (PMA+IO)
B: 1μg/mL phytohaemagglutinin (PHA)
C: 1μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS).
• The study comprised two healthy subjects and two diabetic patients. The subjects were unrelated,
recruited and diagnosed at the coverage area of basic area “Pedro Martínez” (A.G.S. NorthEast
Granada, Spain). Venous blood was collected from the cubital vein in 4-ml lithium-heparin tubes.
• 1ml samples of whole blood were incubated in 24-well plates at 37°C with and without flour extract
(25 μg/mL), and 1μg/ml Phorbol 12 myristate 13 acetate + ionomicine (PMA+IO), 1μg/mL
phytohaemaglutinin (PHA) and 1μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) as positive controls.
• The production of interleukin 1(beta) (IL-1β) and inducible nitric oxide (iNOS) was measured by
Western blotting and further quantification

55. IL-1β 17 kDa
iNOS 130 kDa
A
B
RESULTS I
INDUCED
INDUCED

56. 0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
300
350
iNOS%IL-1β%
iNOS 130kD
IL-1β 17kD
* #
* #
* # * #
* #
* #
* # * #
* #
* #
* # * #
* # * # * #
* # * #
Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and the induced samples with and without flours*
# Statistically significant comparisons (p<0,05) between induced samples with and without flours
PRODUCTION OF iNOS AND IL-1β IN HEALTHY
PATIENTS
RESULTS II
Figure 2
A
B

57. iNOS%
0
50
100
150
200
250
* #
* # * #
*#&
*#&
*#&
*#&
*#&
Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and the induced samples with and without flours*
# Statistically significant comparisons (p<0,05) between induced samples with and without flours
$ Statistically significant comparisons (p<0,05) between the control and non-induced samples with flours
RESULTS III
PRODUCTION OF iNOS AND IL-1β IN
DIABETIC PATIENTS
0
50
100
150
200
250
300
350
*#&
*#&
*#&
*#&
*#&
* # * # * #
IL-1β%
Figure 3
A
B
iNOS 130kD
IL-1β 17kD

58. RESULTS IV
NO + O2
.-
ONOO
-
3-Nitrotyrosine
Healthy Patient Diabetic Patient
A B

59. CONCLUSIONS
- Plasma samples from diabetic patients in whole blood cultures are hyper-responsive to
inflammation induction by PHA, LPS and PMA+IO, as demonstrated by the increased levels
of IL-1β and iNOS markers in plasma, and 3-nitrotyrosine production.
- The addition of extracts from olive seed flour produced unequivocal signs of reduced
inflammatory response, mainly in diabetic patients. This is likely mediated through
modifications of the complex subclinical inflammatory reaction, and is witnessed here as
reduced levels and/or biological activity of IL-1β, iNOS and presence of 3-nitrotyrosine.
- The specific components of the olive seed flour ultimately responsible for this
antiinflammatory effects are yet to be characterised. Such characterization will help to
design new therapeutical approaches for these patients.
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was funded through the “Excelencia projects” P2010-AGR6274 y P2011-CVI7487 (CEICE, Junta de
Andalucía), BFU2011-22779 (MINECO) and a INTERCONNECTA ITC-20131031 project (CDTI, Fondo Tecnológico,
MINECO and Agencia IDEA), all of them participated by ERDF funding, and PIOF-GA-2011-301550 (EC). AZ thanks
the “Campus de Excelencia Agroalimentario ceiA3” for Ph. D. funding.

60. INVESTIGADORES EN PLANTILLA
- JUAN DE DIOS ALCHÉ RAMÍREZ
- ANTONIO JESÚS CASTRO LÓPEZ
ESTUDIANTES DE DOCTORADO
- ADORACIÓN ZAFRA ÁLVAREZ
- MARIA JOSÉ JIMÉNEZ QUESADA
- ESTEFANÍA GARCÍA QUIRÓS
-VICTOR ALCHÉ RAMÍREZ
POSTDOCTORALES
- JOSÉ CARLOS JIMÉNEZ LÓPEZ
- ELENA LIMA CABELLO
- ADORACIÓN ZAFRA ÁLVAREZ
- JOSÉ ANGELTRAVERSO GUTIERREZ
PERSONALTÉCNICO
- DIANA FUENSANTA NICOLÁS LLORACH
- ELISABET BUJALANCE ESPEJO
- JOSE Mª BERRAL HENS
ESTUDIANTES DE MÁSTER
- ISABEL MARTINEZ BEAS
- IRENE GALLEGO MARTÍNEZ
- Mª MAR PATÓN ÁLVAREZ
- PAULA MARTÍNEZ MAZÓN
MUCHAS
GRACIAS !!!!!!

61. Colaboraciones
Proyectos/acciones concertadas
Colaboraciones regulares
Sociedades/Redes

62. Financiación (Proyectos Activos)
 Campus de Excelencia Internacional en Agroalimentación
ceiA3. Programa de Doctores en Empresas 2013.
Programa deTesis en co-tutela Internacional 2013.
El Personal
La investigación (parcialmente FEDER)
 Proyectos del Ministerio de Ciencia e Innovación
BFU2011-22779
 Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía
P2010-AGR-6274, P2010-CVI5767 y P2011-CVI-7487.
 Acción Marie Curie programa PEOPLE. CE.
PIOF-GA-2011-301550.
 Programa JAE-CSIC
 Programa FPI
Convenios empresas
 Inmunal
 Allergenome (spin-off)
 Grupo Elayo

63. El olivo como modelo reproductivo de
plantas.

64. Línea 1) Identificación, caracterización y análisis de la función de productos
génicos implicados en el desarrollo del polen y pistilo y en la germinación y
crecimiento del tubo polínico. Estudio de las bases celulares y moleculares
de la (auto)polinización y la polinización cruzada. Mecanismos de
señalización implicados en la orientación y direccionabilidad del crecimiento
del tubo polínico.
Caracterización de
caleosinas y cuerpos
lipídicos.
EARLY
MICROSPORE
MATURE
POLLEN
VACUOLATED
MICROSPORE
BICELLULAR
POLLEN
TETRADMEIOCYTES
GERMINATED
POLLEN
EMBRYO-LIKE
STRUCTURE
(DI)HAPLOID
PLANT
MULTINUCLEATEMULTINUCLEATE
STRESS TREATMENT
GAMETOPHYTIC PATHWAYGAMETOPHYTIC PATHWAY
SPOROPHYTIC PATHWAYSPOROPHYTIC PATHWAY
PMC
UPREGULATION OF THE
UBIQUITIN-MEDIATED
DEGRADATIVE SYSTEM
UPREGULATION OF THE
UBIQUITIN-MEDIATED
DEGRADATIVE SYSTEM
IRREVERSIBLE DEGRA-
DATION OF PROTEINS
CONTROLLING CELL CYCLE
IRREVERSIBLE DEGRA-
DATION OF PROTEINS
CONTROLLING CELL CYCLE
Implicación de la degradación
proteica mediada por ubiquitina
en la inducción de
androgénesis.
Perfiles proteicos del exudado
estigmático en varias especies.
Clasificación funcional de proteínas
del secretoma del estigma del olivo.
Pectinas y arabino-
galactano-proteinas.
Actividad R+D+i
IX Foro INIA DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA “Olivar y aceite de oliva”.
CÓRDOBA 20 Junio 2013
NOTICIAS: ¡¡¡ transcriptoma reproductivo del olivo (POLEN Y ESTIGMA)
ensamblado y anotado !!!!

65. Línea 2) Alergia al polen del olivo y seguridad alimentaria en relación
al contenido y composición alergénica de panalergenos (profilinas,
proteínas de transferencia de lípidos, glucanasas, proteínas de
almacenamiento de semillas…). Caracterización de su variabilidad
genética y funcional y de sus implicaciones fisiológicas y clínicas.
Desarrollo de técnicas moleculares avanzadas de diagnosis y terapia.
Digestibilidad de proteínas
11S y su implicación en
alergenicidad potencial.
Presencia masiva de
profilinas en el grano
de polen durante la
germinación in vitro
Clasificación filogenética
de las secuencias del alérgeno
Ole e 1 en distintas variedades de
olivo.
Modelos 3-D de distintas isoformas
de profilinas presentes en el olivo.
IX Foro INIA DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA “Olivar y aceite de oliva”.
CÓRDOBA 20 Junio 2013
Actividad R+D+i

66. Línea 3) Caracterización de proteínas de almacenamiento en la
semilla del olivo, en subproductos de la extracción del aceite y
en co-productos novedosos resultantes del procesado
diferencial de la aceituna. Posible uso alimentario de proteínas
de almacenamiento de olivo. Caracterización de proteínas en
aceites. Identificación y caracterización de otros componentes
proteicos de interés industrial, alimentario o farmacéutico.
RADICLE
Localización de proteínas 11S en secciones
semifinas de endospermo de olivo y
tratamiento con tripsina.
IX Foro INIA DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA “Olivar y aceite de oliva”.
CÓRDOBA 20 Junio 2013
Actividad R+D+i

67. Línea 4) Discriminación varietal del polen y muestras líquidas
(extractos clínicos y aceites de oliva) mediante características
morfológicas/moleculares (SSRs). Utilización en gestión de
germoplasma, Aerobiología, predicción de cosechas y detección de
fraudes potenciales en aceite de oliva.
Parámetros de la exina analizados
mediante MEB y valores obtenidos en 14
variedades
IX Foro INIA DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA “Olivar y aceite de oliva”.
CÓRDOBA 20 Junio 2013
Detección de fraudes potenciales
en aceites de oliva
Actividad R+D+i

68. Geles 2-D de
endospermo y
cotiledón de
semilla de olivo
(215DAA: “days
after anthesis”)
de la variedad
Picual y detalle
de péptidos
mayoritarios.

70. Figura 2. Descripción de las distintas
fracciones histológicas de la aceituna (% en
peso seco)

71. Máquina de extracción con fluidos supercríticos (equipo subcontratado a
Fluysur por BRP-EEZ-CSIC)

72. Transcriptome-based identification of a seed
olive legumin (11S globulin).
Characterization of subunits, 3D modelling
and molecular assessment of allergenicity.
Adoración Zafra1, José Carlos Jimenez-Lopez1, Rosario Carmona1,
Gonzalo Claros2, Juan de Dios Alché1
1Plant Reproductive Biology Laboratory. Department of Biochemistry, Cell and
Molecular Biology of Plants Estación Experimental del Zaidín. CSIC. Granada. Spain
2Department of Molecular Biology and Biochemistry. University of Málaga. Spain
juandedios.alche@eez.csic.es

73. HISTOLOGICAL CHARACTERIZATION OF
THE OLIVE FRUIT.THE OLIVE FRUIT
AS A DRUPE
Nevadillo de Alhama
Mesocarp
Endocarp
Epicarp
Mesocarp
Endocarp
Seed

74. THE OLIVE FRUIT
AS A DRUPE
THE OLIVE SEED: An unexplored and
unexploited material: Endosperm +
Embryo
Endocarps
Seeds
ENDOSPERM a ENDOSPERM b
EMBRYO

75. ACKNOWLEDGEMENTS
This study was supported by the following European Regional Development Fund co-financed grants:
RTC-2015-4181-2 (MINECO), 201540E065 (CSIC) and P2010-AGR-6274 and P2011-CVI-7487 (Junta de
Andalucía). A. Zafra thanks the Agrifood Campus of International Excellence ceiA3/Elayotecnia S.L. for grant
funding. This research was also partially supported by the European Research Program MARIE CURIE (FP7-
PEOPLE-2011-IOF), under the grant reference number PIOF-GA-2011-301550 to JCJ-L and JDA. JCJ-L thanks
the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness for the grant ref. number RYC-2014-16536 (Ramón y
Cajal Research Program)
The authors also gratefully acknowledge Rocío Bautista
(PAB) for helpful discussions and bioinformatic
counselling, and Josefa Gómez Maldonado for highly
valuable pyrosequencing at the sequencing facilities of
the University of Málaga.

78. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS
TECNOLOGÍAS PARA
AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN
DE LA ACEITUNA"
HACIA LA EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓ
N HISTOLÓGICA
DE LA ACEITUNA
Y DE LAS
FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE
SEMILLA DE OLIVO EN
LA ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Tarea 1.A.: Estudio de un nuevo proceso en
planta piloto de deconstrucción de la aceituna
Tarea 1.B.: Desarrollo de un proceso para la
obtención de harina desengrasada de semilla de
hueso de aceituna
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
Tarea 2.A: Análisis histológico
de secciones de frutos de
variedades relevantes.
Tarea 2.B.: Análisis histológico
de secciones de las fracciones
obtenidas.
Tarea 3.B.: Aproximaciones
proteómicas a la caracterización de los
componentes proteicos no enzimáticos
Tarea 4.A.: Análisis de perfiles
proteicos native-PAGE y
actividades in-gel de las
fracciones y harinas obtenidas
Tarea 3.A.: Análisis de perfiles
proteicos SDS-PAGE de las
fracciones y harinas obtenidas
Tarea 5.A. Diseño experimental: formulación
de los piensos y ajuste de la dieta
Tarea 4.B.: Aproximaciones
proteómicas a la caracterización
de los componentes proteicos
enzimáticos
Tarea 1.C.: Desarrollo de un proceso de
fraccionamiento de la harina de semilla de olivo
en: proteína del resto de componentes
Tarea 5.B. Puesta a punto de la estabulación
experimental y la selección de erizos de mar.
Tarea 5.C. Seguimiento de parámetros
biométricos en los erizos de mar.
Tarea 5.D. Análisis, interpretación de
resultados y elaboración del informe final
OBJETIVO 6: INCORPORACIÓN
DEL PRODUCTO ELABORADO A
LA RED COMERCIAL
Tarea 6.A.: Adaptación de las
formulaciones desarrolladas en Planta
Piloto a Línea de producción

79. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS TECNOLOGÍAS
PARA AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN DE
LA ACEITUNA" HACIA
LA EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓ
N HISTOLÓGICA
DE LA ACEITUNA
Y DE LAS
FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE
SEMILLA DE OLIVO EN
LA ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Tarea 1.A.: Estudio de un nuevo proceso en
planta piloto de deconstrucción de la aceituna
Tarea 1.B.: Desarrollo de un proceso para la
obtención de harina desengrasada de semilla de
hueso de aceituna
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
Tarea 1.C.: Desarrollo de un proceso de
fraccionamiento de la harina de semilla de olivo
en: proteína del resto de componentes

80. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS TECNOLOGÍAS
PARA AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN DE
LA ACEITUNA" HACIA LA
EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓN
HISTOLÓGICA DE
LA ACEITUNA Y DE
LAS FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE SEMILLA
DE OLIVO EN LA
ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
Tarea 2.A: Análisis histológico
de secciones de frutos de
variedades relevantes.
Tarea 2.B.: Análisis histológico
de secciones de las fracciones
obtenidas.

81. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS TECNOLOGÍAS
PARA AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN DE
LA ACEITUNA" HACIA
LA EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓ
N HISTOLÓGICA
DE LA ACEITUNA
Y DE LAS
FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE LA
SEMILLA DEL OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE
SEMILLA DE OLIVO EN
LA ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
Tarea 3.B.: Aproximaciones
proteómicas a la caracterización de los
componentes proteicos no enzimáticos
Tarea 3.A.: Análisis de perfiles
proteicos SDS-PAGE de las
fracciones y harinas obtenidas
Tarea 4.A.: Análisis de perfiles
proteicos native-PAGE y
actividades in-gel de las
fracciones y harinas obtenidas
Tarea 4.B.: Aproximaciones
proteómicas a la caracterización
de los componentes proteicos
enzimáticos

82. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS
TECNOLOGÍAS PARA
AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN
DE LA ACEITUNA"
HACIA LA EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓ
N HISTOLÓGICA
DE LA ACEITUNA
Y DE LAS
FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE
SEMILLA DE OLIVO EN
LA ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
Tarea 5.A. Diseño experimental: formulación
de los piensos y ajuste de la dieta
Tarea 5.B. Puesta a punto de la estabulación
experimental y la selección de erizos de mar.
Tarea 5.C. Seguimiento de parámetros
biométricos en los erizos de mar.
Tarea 5.D. Análisis, interpretación de
resultados y elaboración del informe final

83. OBJETIVO 1:
DESARROLLO DE
NUEVAS
TECNOLOGÍAS PARA
AVANZAR EN LA
"DECONSTRUCCIÓN
DE LA ACEITUNA"
HACIA LA EXTRACCIÓN
OPTIMIZADA DE
PROTEÍNAS.
OBJETIVO 2:
CARACTERIZACIÓ
N HISTOLÓGICA
DE LA ACEITUNA
Y DE LAS
FRACCIONES
OBTENIDAS
OBJETIVO 3:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
PROTEICOS NO
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO
OBJETIVO 4:
DETERMINACIÓN Y
CARACTERIZACIÓN
DE COMPONENTES
ENZIMÁTICOS DE
LA SEMILLA DEL
OLIVO.
OBJETIVO 5:
APLICACIONES DE LAS
PROTEÍNAS DE
SEMILLA DE OLIVO EN
LA ELABORACIÓN DE
PIENSOS PARA LA
ALIMENTACIÓN DE
ERIZO DE MAR
PRODUCIDO EN
PISCIFACTORÍAS
Proteínas y Enzimas
de harinas
optimizadas de
semilla de OLIvo para
uso en alimentación
de organismos
MARinos
(PROTEOLIMAR)
OBJETIVO 6: INCORPORACIÓN
DEL PRODUCTO ELABORADO A
LA RED COMERCIAL
Tarea 6.A.: Adaptación de las
formulaciones desarrolladas en Planta
Piloto a Línea de producción

84. Semillas de algunas variedades de aceituna

85. CARACTERIZACIÓN HISTOLÓGICA DE LA
ACEITUNA.
En el caso de secciones de mesocarpo, se intentó realizar secciones de fragmentos completos comprendidos
entre el endocarpo y el epicarpo, conteniendo éste último. Como carácterísticas esenciales se observó la
presencia de una epidermis de grosor variable, una serie de capas subepidérmicas y un amplio panel de
células parenquimáticas conteniendo un número variable de inclusiones lipídicas, provenientes de la
cohalescencia de cuerpos lipídicos. No se observaron cuerpos lipídicos individualizados en el estadio
analizado. Se observó frecuentemente la presencia de inclusiones intranucleares, ya descritas por el grupo
de investigación en distintos tejidos del olivo con diversa incidencia en las distintas variedades analizadas.
También se observó en muchos casos la notable presencia de estructuras, recientemente caracterizadas
como peroxisomas. En este caso se observó un gradiente descendente en la presencia de dichas
estructuras entre las zonas del mesocarpo más cercanas al epicarpo y las más cercanas a endocarpo.
También se observó un gradiente en el sentido opuesto, relativo a la presencia de traqueidas y otras
estructuras como tejido conductores, ampliamente lignificadas en la cercanía del endocarpo. Se
observaron claras diferencias en la frecuencia de estos componentes entre las distintas variedades
analizadas, así como en parámetros como el número de capas subepidérmicas, el grosor de la cutícula, y
aparentemente en el número y tamaño de las inclusiones lipídicas presentes en las células del mesocarpo.
En cuanto a los tejidos de la semilla, fueron analizados independientemente fragmentos de endospermo + testa,
y de embriones de cada una de las variedades.
En ambos casos es notoria la presencia de células parenquimáticas con amplio contenido en cuerpos proteicos
y cuerpos lipídicos individualizados, en diversos estratos o capas de células. Es notoria la diferencia entre
la fina epidermis presente en los embriones, y las gruesas capas epidérmicas presentes en el endospermo,
en muchos casos con engrosamientos multicapa causantes de la amplia y diferencial ornamentación de la
testa en las distintas variedades analizadas.
CARACTERIZACIÓN DE
VARIEDADES DE OLIVAR
AUTÓCTONO DE LA D.O.P.
PONIENTE DE GRANADA

86. - Seed storage proteins (SSPs) are fundamental molecules for seed germination as an important
source of carbon and nitrogen. Among the main four protein families that integrate SSPs,
legumins (11S globulins) are widely distributed in dicots, and represent the major contribution
to the pool of seed proteins in olive.
- In the present study, we have used an olive seed transcriptome generated de novo by
454/Roche Titanium+ sequencing to identify a broad panel of 11S protein sequences. Among
these identified legumin sequences, five were selected using their presence within the output
results from the BLASTP alongside the whole NCBI database, and their clustering with
previously-characterized 11S sequences in the phylogenetic analysis as the criteria. The
selected sequences were identified as corresponding to the isoform 2 of the 11S protein
precursor.
- One of the sequences was used for further analysis. Individual acidic and basic subunits
within this sequence were recognised, 3D-modeled and assessed as regard to their potential
molecular interaction by docking methods. Furthermore, T-cell epitopes were forecast by using
predictive software in order to evaluate the putative implications of the olive 11S proteins in
food allergy.
CONCLUSIONS

87. EFECTOS INMUNOLÓGICOS SOBRE
PACIENTES SANOS DEL CONSUMO DE TRES
ACEITES DE OLIVA VIRGEN CON CONTENIDO
DIFERENCIAL EN COMPUESTOS BIOACTIVOS
ESTUDIO DE LOS BENEFICIOS
DEL CONSUMO DE LOS
ACEITES OBTENIDOS PARA LA
SALUD HUMANA

88. EFECTOS INMUNOLÓGICOS SOBRE
PACIENTES SANOS DEL CONSUMO DE TRES
ACEITES DE OLIVA VIRGEN CON CONTENIDO
DIFERENCIAL EN COMPUESTOS BIOACTIVOS
ESTUDIO DE LOS BENEFICIOS
DEL CONSUMO DE LOS
ACEITES OBTENIDOS PARA LA
SALUD HUMANA

89. EFECTOS INMUNOLÓGICOS SOBRE
PACIENTES SANOS DEL CONSUMO DE TRES
ACEITES DE OLIVA VIRGEN CON CONTENIDO
DIFERENCIAL EN COMPUESTOS BIOACTIVOS
ESTUDIO DE LOS BENEFICIOS
DEL CONSUMO DE LOS
ACEITES OBTENIDOS PARA LA
SALUD HUMANA