cuantificacion de proteinasssssssssssssss

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CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
CQU310
Laboratorio 1 Parte A

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Laboratorio 1 : CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
RESULTADOS DE APRENDIZAJE
• Distinguir la naturaleza fisicoquímica de las biomoléculas
mediante la caracterización de su estructura, propiedades y
funciones en los organismos.
• Analizar resultados experimentales de laboratorio mediante la
aplicación de principios fisicoquímicos y fisiológicos, con el uso
de herramientas computacionales.

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CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La cuantificación de proteínas sirve para determinar la
concentración de proteínas en una muestra.
Se usa comúnmente cuando se realiza una purificación de proteínas
para conocer la concentración y composición específica de una
muestra.
En los métodos iniciales, lo que se buscaba era medir contenido de
nitrógeno y mediante repeticiones continuas se encontraron
fórmulas que permitían hacer una relación entre contenido de
nitrógeno y de proteína.

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Dentro de estos métodos encontramos el método Kjeldahl,
ampliamente utilizado en la industria alimenticia y agrícola
para determinar contenido de proteínas en alimentos frescos y
procesados además de aguas de distinta procedencia

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Brevemente el Método Kjeldahl consiste en….
3 Etapas:
Digestión
Destilación
Titulación
Todo el N es reducido
a N amoniacal
Se destila el amoniaco
y se retiene en una
solución ácida
Se titula el amoniaco
Esquema del método de Kjeldahl.

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Posteriormente y gracias al desarrollo de la espectrofotometría, se pudieron
desarrollar distintos métodos asociados a dichas propiedades tanto de los
aminoácidos como de las proteínas.
Estos métodos se pueden basar en la propiedad intrínseca de las proteínas para
absorber luz en el UV; en la formación de derivados químicos; en la capacidad que
tienen las proteínas de unir ciertos colorantes y finalmente la capacidad de generar
fluorescencia.
Los métodos se pueden clasificar en:
• Métodos UV
• Métodos de reacción química: Acá encontramos a los métodos como Biuret, Lowry
y del ácido bicinconínico (BCA).
• Métodos por colorantes: Un ejemplo es el método de Bradford.
• Métodos por fluorescencia: Ej: Nano orange, OPA y fluorescemina

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USAREMOS HOY
Sensibilidad

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Criterios a considerar para utilizar el método adecuado
1) La cantidad total de proteína presente en la muestra,
2) La concentración de la proteína,
3) La especificidad del método,
4) La presencia de otras sustancias que podrían interferir,
5) La facilidad y reproducibilidad del método.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Método de Lowry
Es un método de valoración cuantitativa de las proteínas. A las muestras se le
añade un reactivo que forma un compuesto coloreado con las proteínas, siendo
la intensidad del color proporcional a la concentración de proteínas, según la
ley de Lambert y Beer.
Algunos aminoácidos sufren reacciones características con ciertos reactivos
debido a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo
se caracterizan por la formación de productos coloreados.
La tirosina, por ejemplo, debido a su grupo hidroxifenilo, reacciona con una
solución de ácido fosfomolíbdico tungstico (Reactivo Folin-ciocalteau, color
amarillo) en un medio cúprico alcalino, produciendo una coloración azul, que
absorbe a 650 nm.

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El método de Lowry consta de dos etapas:
1.- Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+.

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El método de Lowry consta de dos etapas:
2.- Reacción de reducción del reactivo de Folin-ciocalteau

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En resumen el método de Lowry……

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Debido a las diferencias en el contenido de tirosina entre las proteínas, cantidades
iguales de proteínas distintas, producen coloración diferente con el reactivo de Lowry,
motivo por el cual no es posible obtener la concentración real de una muestra de
proteína por este método.
Cuando se requiere una estimación relativa de la concentración de proteínas, este
método es ampliamente satisfactorio, debido a su alta sensibilidad, la cual es de al
menos 10 mg de proteínas por ensayo.

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En el ensayo de hoy se trabajará con la proteína Albumina de Suero de Bobino ( BSA )
La Albúmina es la proteína más abundante del plasma, y constituye alrededor del 50%
del total de proteínas plasmáticas en el ser humano.
Entre sus funciones está el transporte de ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo.
Una molécula de albumina albergando seis ácidos palmíticos.

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PROTOCOLO:
Se determinará la concentración de Albúmina de Suero de Bovino (BSA)
Para determinar la concentración de proteínas de una muestra problema se construye una curva de
calibrado a partir de una solución patrón de BSA 0,4 mg/ml.
Pasos a seguir:
1. Prepare una batería de 7 tubos y rotúlelos desde tubo 0 (o blanco) al tubo 5, más el tubo que
corresponde a la muestra problema (MP).
El tubo que solo tiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste de equipo a cero
absorbancia (tubo 0).

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2. Para agregar las soluciones siga las siguientes instrucciones:
1ro Agregar a cada tubo el volumen de solución de proteína BSA que se indica en la tabla.
2do Agregar a cada tubo el volumen de agua que se indica en la tabla.
3ro Hacer el tubo de MP agregando 0,5 ml de proteína Muestra Problema (MP) y 0,5 ml de agua.
4to Agregar a cada tubo 1 ml de Reactivo de cobre alcalino (R.C.A.) y mezcle cuidadosamente.
5to Espere 10 minutos exactos.
Muestra
Problema (MP)
0,5 ml de MP 0,5 ml de H2O

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6to Agregue a cada tubo 4 ml de Reactivo de Folin y mezcle hasta que el color sea uniforme.
7mo Caliente 5 min. Exactos a 55ºC.
8vo Enfríe a temperatura ambiente y luego bajo agua.
3. Medir Absorbancia de cada tubo en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 650 nm.

19. 1 ml de Reactivo de cobre alcalino (R.C.A.)
Espere 10 minutos exactos
1 ml de Reactivo de cobre alcalino (R.C.A.)
Espere 10 minutos exactos
4 ml de Reactivo de Folin

21. Baño termorregulado a
55°C por 5 minutos

22. Medir absorbancia de cada
tubo en un espectrofotómetro

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VIDEO LABORATORIO

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Muestra Nº Absorbancia
1 0,154
2 0,283
3 0,429
4 0,558
5 0,701
MP 0,481
Valores de Absorbancia obtenidos

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Cálculos y Gráficos
1. Grafique en Excel la curva de la calibrado considerando los valores de absorbancia de los tubos 1 al 5
y sus respectivas concentraciones que las debe obtener por el principio de dilución (C1 • V1 = C2 • V2).
2. Obtenga el valor del coeficiente de extinción () a través de la pendiente de la curva de calibrado (m)
realizando regresión lineal.
3. Considerando el valor del coeficiente de extinción realice la determinación de la concentración de
proteínas utilizando la Ley de Lambert y Beer.
Ley de Lambert y Beer A =  • l • C
A = Es la absorbancia de la solución a una longitud de onda determinada
 = Es el coeficiente de extinción.
C = Es la concentración de la muestra en solución
l = Es el espesor de la solución en la cubeta o celda. Se expresa en centímetros (cm).
Nota: Debe determinar la concentración final de proteínas en su muestra problema.

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CÁLCULO DE CONCENTRACIÓN DE BSA, DE CADA TUBO PATRÓN
C1 * V1 = C2 * V2
C2 = C1 * V1
V2
C1: 0,4 mg/ml
V1: 0,1 ml
C2: X
V2: 6 ml C2 = 0,4 mg/ml * 0,1 ml
6 ml
C2 = 0,00666 (mg/ml)
C2 = 0,67 x 10-2 (mg/ml)

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1. Grafique en Excel la curva de la calibrado considerando los valores de absorbancia de los tubos 1 al 5 y sus
respectivas concentraciones que las debe obtener por el principio de dilución (C1 • V1 = C2 • V2).

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1. Grafique en Excel la curva de la calibrado considerando los valores de absorbancia de los tubos 1 al 5 y sus
respectivas concentraciones que las debe obtener por el principio de dilución (C1 • V1 = C2 • V2).
y = 20,54x + 0,0154
R² = 0,9989
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
Axis
Title
Axis Title
Chart Title
Gráfico: Curva de Calibrado
CONCENTRACIÓN
X
ABSORBANCIA
Y
Nº Tubo
1 0,0067 0,154
2 0,013 0,283
3 0,02 0,429
4 0,027 0,558
5 0,033 0,701
MP 0,481
Y = 20,54 X + 0,0154
R= 0,9989

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1. Grafique en Excel la curva de la calibrado considerando los valores de absorbancia de los tubos 1 al 5 y sus
respectivas concentraciones que las debe obtener por el principio de dilución (C1 • V1 = C2 • V2).
CÓMO HACER EL GRÁFICO EN EXCEL?

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Y = m * X
Y = 20,54 X + 0,0154
Ojo con unidades de m y 
Obtenga el valor del coeficiente de extinción () a través de la pendiente de la curva de calibrado (m)
realizando regresión lineal.
m =  * l =
1 cm
 = 20,54 (mg/ml)-1 * cm-1
20,54 (mg/ml)-1

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Y =  * l * C
Y = 20,54 X + 0,0154
20,54 (mg/ml)-1
3. Considerando el valor del coeficiente de extinción realice la determinación de la concentración de proteínas
utilizando la Ley de Lambert y Beer.
C = _0,481___ =
MP MP
MP 0,023 mg/ml

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y = 20,54x + 0,0154
R² = 0,9989
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
Axis
Title
Axis Title
Chart Title
0,481
0,023
Gráfico: Curva de Calibrado
CONCENTRACIÓN
X
ABSORBANCIA
Y
Nº Tubo
1 0,0067 0,154
2 0,013 0,283
3 0,02 0,429
4 0,027 0,558
5 0,033 0,701
MP 0,481
Y = 20,54 X + 0,0154
R2= 0,9989
0,023