Este documento presenta las respuestas a 10 preguntas sobre tres métodos para cuantificar proteínas (Bradford, Lowry y Lambert-Beer). Explica los principios químicos de cada método, cómo se calculan las concentraciones de proteínas, y discute las ventajas, desventajas e interferencias de cada uno. También compara los resultados obtenidos al aplicar los métodos a una muestra problema y analiza cuál sería el método más adecuado para cuantificar una mezcla de proteínas.

1. CUESTIONARIO PRÁCTICA 3
1. Representa las rectas patrones para Bradford y Lowry .Calcula las
concentraciones de proteínade la muestra problema para ambos métodos ,
según los datos obtenidos en los experimentos realizados.
En la gráfica anterior puede verse en absicsas las concentraciones y en ordenadas las
absorbancias. Se representa la recta patrón generada con los datos de las
concentraciones y las absorbancias medidas. También se representa el valor de
absorbancia igual a 0,994 calculada como la media aritmética de las tres mediciones
realizadasconla muestra y la recta interpolada a partir del patrón que pasa por dicho
punto. A partir de su ecuación empleando la absorbancia se calcula la concentración,
obteniendo un valor de 0,6424 mg/ml
Se repite el mismoprocedimientode cálculoque enla cuantificación de Lowry con los
datos de absorbancia obtenidos en este caso. Los resultados obtenidos son: la
absorbancia de la muestra es de 0,418 y la concentración de 0,5162 mg/ml
2. Las réplicas de la muestra problema dan el mismo valor ? Por qué ?
No, dan diferente valor y con diferente variabilidad en el rango de medidas. En
la cuantificación de Lowry la variación de las medidas observadas es de un
11,74 % .En cambio en la cuantificación de Bradford la variación es de 6,7 % .

2. Esta diferencia se debe a la mayor dificultad del procedimiento de Lowry que
da lugar a errores en su ejecución, mientras que la variación observada en
Braford es atribuible a la variabilidad estadística causada por errores de
medición ,instrumentación ,etc …
3. Calcula el coeficiente de extinción molar (M-1.Cm-1) de la BSA y la
concentración de la muestra problema, según los datos obtenidos mediante
la lectura de la absorbancia a 280nm.
Según la ecuación de Lambert-Beer:
A =Ꜫ.c. L, donde
A: absorbancia
Ꜫ: coeficiente de extinción, M-1 cm-1
L: longitud del medio (cubeta), cm
Calculamos Ꜫ del patrón BSA a partir de la concentración y la medición de la
absorbancia: c= 0,25 mg/ml, A=0,056
0,25 mg/l x 103ml/1l x 1g/103mg x 1 mol BSA/66.463 g = 3,76149x10-6M
Ꜫ = A/c.L = 0.056/3,76149x10-6 = 14.887 M-1 cm-1
Y a continuación calculamos la concentración de la muestra problema:
c = A/ Ꜫ.L = 0,023/14.887 = 1,54x10-6 M
1,54x10-6 M x 66.463 = 0,1024 mg/ml
Los valores obtenidos presentan errores significativos:
- El coeficiente de extinción de BSA es muy inferior al que se encuentra en la
literatura, que es de 43824 M-1 cm-1
- El error en la determinación de Ꜫ del patrón BSA se propaga al càlculo de la
concentración obteniéndose un valor entre 5 y 6 veces inferior a los valores
obtenidos con los otros métodos. Pero si se empleara el valor correcto de Ꜫ,
la concentración aún sería menor. Por tanto se deduce que el valor de las
absorbancias medidas presenta un error sistemático significativo.
4. Podríamos usar el valor E de la BSA para calcular la concentración de otra
muestra de proteína desconocida?
No ya que el coeficiente de extinción molar es característico de cada proteína
en condiciones definidas de longitud de onda, solvente y temperatura.
También depende de las características del instrumento utilizado. Por esta
razón, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de
extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se utiliza una solución patrón
con concentraciones conocidas de analito.

3. 5. Describe el principio químicoen el que se basan los métodos Bradford y
Lowry. Porque usamos la longitud de onda de 750 nm para Lowry y 595 nm
para Bradford?
El método Bradford se basa en el cambio de colorante en respuesta a
diferentes concentraciones de proteínas . Este compuesto interacciona con
aminoácidos básicos (especialmente arginina ) y aromáticos (mediante enlaces
electrostáticos y de Wan der Waals), según el contenido de estas dos
componentes la intensidad de absorción variará. Esta unión del colorante con
las proteínas provoca un cambio del pico de absorción del colorante desde
465nm a 595nm . Por eso se emplea la longitud de onda a 595nm. Por lo tanto,
este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de
presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se
convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína ( por eso , en el
blanco encontramos una coloración marrón)
En el método Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de
las proteína en el que el color azul fuerte lo crean 2 reacciones:
1) reducción de los iones Cu++ bajo condiciones alcalinas forma un complejo
con enlaces péptidos de las proteínas y se reduce a Cu+ ( reacción Biuret )
2) Reducción del agente Folin-Ciocalteu por el complejo Cobre-Peptido que
subsecuentemente provoca un cambio de color en la solución hacia azul
con una absorción detectable en un espectrofotómetro en el rango de 650
a 750 nm . Por eso se emplea la longitud de onda de 750nm
6. Por qué usamos cubetas de metacrilato para medir absorbancias a 595 y
750nm ,y cubetas de cuarzo para medir la absorbancia a 280nm ?
Las cubetas de cuarzo se emplean para medir la absorbancia a 280nm porque
por debajo de 320nm el cristal y los plásticos (metacrilato) absorben mayor
parte de la luz y se interferiría en el resultado . En cambio , las de metacrilato
son adecuadas para longitudes de onda entre 380 y 780nm.
7. Compara los resultados obtenidos para los tres métodos de cuantificación y
discute sobre las posibles interferencias.
Una vez realizadas las 3 cuantificaciones se obtienen los siguientes resultados :
Bradford : 0,5161588 mg /ml de
concentración problema
Lowry: 0,642427 mg/ ml de
concentración problema

4. Lambert –Beer : 0,102 mg/ml de concentración problema ( error en
absorbancia ).
Discusión de resultados :
Los métodos de Bradford y Lowry se han realizado siguiendo el procedimiento
sin cometer errores importantes . Las réplicas de la muestra problema han sido
parecidas sin observarse una dispersión importante de valores para una misma
muestra. Sin embargo la propia dificultad procedimental, especialmente en el
caso de Lowry, nos ha inducido a cometer pequeños errores que acumulados
dan lugar a la diferencia de los valores.
Respecto el cálculo de la concentración de Lambert Beer se observa un
resultado anómalo debido a las posibles interferencias en la metódica ,una
mala ejecución del protocolo, fallos en la instrumentación o falta en la
homogenización de los reactivos .. que han provocado que la absorbancia de
las muestras fuera erróneo.
8. Haz una lista de ventajas y desventajas de los tres métodos :
Método de Bradford :
 Ventajas :
o Es muy sensible , puede detectar 1-20 µg de proteína
o Es muy rápido
o Hay pocos materiales que interfieran
o No tiene incubaciones
o Capacidad de identificar bastantes aminoácidos
o Permite utilizar cubeta metacrilato.
 Inconvenientes :
o Los detergentes interfieren , incluso trazas de los productos de
limpieza pueden invalidar los resultados .
o Depende fuertemente de la composición de los aminoácidos.
o Tiñe las cubetas empleadas.
Método Lowry :
 Ventajas :
o Es bastante sensible y es capaz de detectar hasta 1 ug de
proteína .
o Permite utilizar cubeta metacrilato.
 Inconvenientes :
o Requiere bastante tiempo
o Algunas proteínas no responden al método.
o Lo puede perturbar bastantes materiales, por ejemplo, sulfato
de amonio , glicina y mercaptanos.
o El tiempo de incubación es critico
o Sensible a muchas interferencias

5. o Es más adecuado para comparar diversas soluciones de una
misma proteína que para realizar mediciones absolutas.
Ecuación de Lambert Beer :
 Inconvenientes :
o La ley L-B solo es válida para soluciones diluidas porque para
concentraciones altas Ꜫ varia con la concentración debido a
fenómenos de dispersión de la luz, cambios de medio,
agregación de moléculas , etc.
o Requiere la utilización de cubetas de cuarzo
o Se ve influenciada por interferencias de los materiales que
absorben UV
 Ventajas :
o Es un método rápido
o No se pierde la muestra utilizada
9. Discute el efecto del tween 20 , el SDS y del B- mercaptoetanol sobre los
métodos de Bradford y de Lowry. Coinciden estos resultados con el listado de
ventajas y desventajas de ambos métodos?
A continuación se da una tabla con las absorbancias obtenidas al añadir estos
productos restando el valor de la absorbancia del blanco.
PRODUCTO BRADFORD LOWRY
B-mercaptoetanol 0,037 0,105
Tween20 Interferencia elevada -0.073
SDS 0,142 0,004
Blanco 0 0
El B-mercaptoetanol debido a su acción reductora rompe los puentes de
disulfuro entre las proteínas y esto da lugar a una interferencia que es más
significativa en el caso de Lowry que en Bradford.
Se puede comprobar que tal como indica la bibliografía los detergentes
invalidan el empleo del método de Bradford ya que producen una interferencia
elevada, principalmente el Tween 20. En el caso del SDS se nota menos debido
a que el producto está bastante más diluido, aunque de todas formas se
obtiene una absorbancia claramente superior al blanco. Por el contrario el
método de Lowry es bastante robusto frente a la presencia de detergentes i las
absorbancias son bastante similares a las del blanco. Estos resultados también
son coherentes con la bibliografía.
.

6. 10. En el caso de que se necesitara cuantificar la concentración total de una
mezcla de proteínas, qué método sería el más adecuado? por qué ?
En general el método más adecuado depende de la composición de la mezcla y
sus propiedades, por ejemplo el espectro de absorción de la luz para identificar
la longitud de onda más adecuada. En general el método de Lowry presenta
una mayor sensibilidad pero es válido para un rango menor de proteínas que el
método de Bradford. También es fundamental conocer los componentes de la
mezcla para identificar posibles interferencias. Sin embargo, en caso de no
disponer de ninguna información, el más adecuado sería el de Bradford por su
mayor generalidad y porque el de Lowry es más adecuado para comparar
diversas soluciones de una misma proteína que para realizar mediciones
absolutas.