G.p.bioquimica y nutricion 1 (1)

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
CURSO DE BIOQUÍMICA Y NUTRICION
GUIA DE PRACTICAS
Dr. José Chuquipiondo Ludeña
Dr. José Martín Chuquipiondo Arana
LIMA – PERU

NORMAS PARA EL USO Y TRABAJO EN EL LABORATORIO
1. Realizar las prácticas de laboratorio con el debido interés y responsabilidad.
2. Presentarse vestido correctamente con su correspondiente guardapolvo y
distintivo de la Universidad.
3. Poner maletines y mochilas en el estante, llevar a las mesas solo lapiceros
y cuadernos.
4. Está terminantemente prohibido beber o comer dentro del laboratorio.
5. Leer cuidadosamente la guía de práctica y tener en cuenta las indicaciones
de los profesores de práctica sobre el uso del material y equipos de
laboratorio, así como el orden, limpieza y seguridad que debe mantenerse.
6. Por cada práctica de laboratorio cada mesa de trabajo presentará un único
informe, el cual consta de las siguientes partes:
- Carátula.
- Objetivos.
- Marco Teórico.
- Desarrollo Experimental.
- Discusión de los resultados.
- Conclusiones.
- Cuestionario.
- Bibliografía
Dicho informe se presentará en la siguiente práctica en el horario y grupo
Respectivo.
7. El inicio de la pràctica es en la hora exacta programada. Se tendrà una
tolerancia de 10 minutos, luego de ese lapso de tiempo no se podrà
ingresar al laboratorio, por lo tanto se le considerarà como una inasistencia
y no tendrà derecho a nota de informe de pràcticas.
8. Las inasistencias en las prácticas no son recuperables en ninguno de los
grupos, calificándose al alumno con nota cinco (05). Aquel alumno que
acumule 30% de inasistencias no tiene derecho a nota práctica.
9. Cada alumno será integrante de una mesa de trabajo, a la cual pertenecerá
a lo largo del semestre académico.
10. Por mesa de trabajo, será nombrado un responsable que se hará cargo del
material y equipos recibidos así como de la presentación de los informes.
11. En caso de daño, deterioro o pérdida del material y/o equipos, el
responsable de mesa informará del hecho al profesor de prácticas, TODO
GRUPO ES RESPONSABLE DEL DAÑO CAUSADO, y deberá repararlo a la
brevedad posible, no más de una (01) semana después del incidente.
12. Al final de la práctica, se procederá a limpiar el material usado, con el fin
de entregarlo en las mismas condiciones en las que fueron recibidos, caso
contrario se le descontará un punto en la nota de informe a todo el grupo.
13. Una vez limpio el material, el responsable de mesa lo devolverá a la
persona encargada del laboratorio.
14. El laboratorio deberá quedar completamente limpio, las mesas secas y
limpias, debiendo arrojar todos los desechos al tacho de basura.

CURSO: BIOQUÍMICA Y NUTRICION
PRACTICA No 1
ESPECTROFOTOMETRIA
GENERALIDADES:
Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis
cuantitativos que se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz
transmitida a través de una solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias
naturalmente coloreadas ò que se han hecho de tal calidad mediante reacciones
químicas adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la
radiación queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una
reducción de su intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de
absorción de dichas moléculas.
Io I
Luz incidente Luz transmitida
Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma
selectiva determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas
pasar. La longitud de onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe con
mayor intensidad la luz, se denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda
máximo”.
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la
intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el
aumento del número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y

el observador. Este número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el
espesor del recipiente que contiene la solución, estos factores están considerados
en la “Ley de Lambert y Beer”, que rige los principios de la Espectrofotometría y
cuyas formas de expresión son:
Log (Io/I) = E. b. c = A = D.O.
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la
naturaleza de la
Sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentración de la solución.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T)
y la relación entre ambas es logarítmica.
CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:
Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un
Espectrofotómetro, existen dos formas:
- Método de la curva standard o curva de calibración.
- Factor de calibración.
a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios estándares de
concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en
un sistema de coordenadas en el que se colocan las lecturas en las
ordenadas (Eje Y) y las concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta
obtenida (Función lineal), se puede extrapolar la absorbancia o densidad
óptica de la muestra problema, hallando la concentración de la misma en
el eje de las abscisas.
b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término
que se relaciona con la concentración de una sustancia con su
absorbancia, es decir la intensidad que absorbe una sustancia de
concentración conocida (Standard o Patrón).

Así tenemos:
Donde:
Fc = factor de calibración.
A = absorbancia del tubo standard.
[Standard] = concentración del standard.
Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de
una muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera
(diluciones) se podrá usar directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc
Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución
(Fd) que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol / Vol o
Donde:
Vol = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.
Vol o = Volumen total.
Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra
problema se procederá usando la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc. dil
Fc = [ Standard ] / A

Donde:
A = Absorbancia de la muestra problema.
Fc = Factor de calibración.
Dil = Factor de dilución.
[MP] = Concentración de la muestra.
EXPERIMENTO
1. Preparar la siguiente batería de tubos:
Solución stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.
Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los
tubos Standard (I-II-II-IV).
Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda (‫)ג‬
en el espectrofotómetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).
2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de
absorbancia en el eje de las Ordenadas vs concentración de bicromato de K
en el eje de las Abscisas.
3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la
muestra problema (Problema X).
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones standard y
sus Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibración ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes
métodos:
- A.- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.
- B.- Usando Factor de Calibración, multiplicando su absorbancia por el factor
de calibración del standard.
Tubo I Tubo II Tubo III Tubo IV TUBO X
Bicromato de potasio 0.8 ml 1 ml 1.3 ml 1.5 ml ---
Agua destilada 9.2 ml 9 ml 8.7 ml 8.5 ml 9 ml
Concentración (mg %) --- --- --- --- ---
Muestra X --- --- --- --- 1 ml

CUESTIONARIO:
1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotómetro.
2.- ¿Qué diferencias existen entre un fotocolorímetro y un espectrofotómetro?.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible con sus
respectivas longitudes de ondas.
4.- Qué relación matemática existe entre Absorbancia y Transmitancia?
5.- Construya una curva de calibración con los siguientes valores:
Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4 Standard 5
Concentration 5 mg/dl 10 mg/dl 20 mg/dl 30 mg/dl 40 mg/dl
Absorbancia 0.025 0.050 0.100 0.150 0.200
Con la curva obtenida hallar la concentración de las siguientes muestras, sabiendo
que sus absorbancia fueron:
Muestra A........................0.015
Muestra B........................0.125
Muestra C........................0.350

PRACTICA No 2
LOS AMINOÁCIDOS Y LAS PROTEINAS COMO ELECTROLITOS: SU
CAPACIDAD AMORTIGUADORA EN EL ORGANISMO HUMANO
FUNDAMENTO BIOQUIMICO:
Una propiedad importante de los aminoácidos, consecuencia del hecho de que
todos ellos tienen grupos carboxilo (-COOH) y grupos amino (-NH2) es su conducto
como electrolitos. Es costumbre considerar los grupos COOH como de naturaleza
acídica y los grupos NH2 como de carácter básico.
Hemos estudiado en las clases teóricas el comportamiento de los aminoácidos
como iones dipolares y la conducta de ellos durante su titulación con ácido y álcalis
de modo que se comportan como verdaderas sustancias tampones,
amortiguadores ò buffers, para el sostenimiento del pH del medio interno dentro
de estrechos límites (7.35 a 7.45). Explicamos también el comportamiento
amortiguador del ion dipolar glicina al añadirle iones H+ o al añadirle OH-
impidiendo las variaciones bruscas del pH sanguíneo. La representación de un
aminoácido tal como la glicina por la fórmula NH2CH2COOH sugiere que se trata de
una sustancia en la que el grupo amino actúa como una base conjugada y el grupo
COOH como un ácido. Se ha observado, sin embargo, que esta formulación no es
la correcta del estado iónico de un aminoácido en solución acuosa. La verdadera
representación es aquella que dimos del ion dipolar (A) y que es la siguiente:
(Estructura A)
H H
R C COO- R C COOH
Estructura (A) NH3 Estructura (B) NH2
Y que es la forma en la cual se encuentran en el torrente circulatorio, es decir, al
pH fisiológico (7.4) los grupos carboxilo existen como la base conjugada, esto es,
como ión carboxílico R-COO-; y al mismo pH, la mayoría de los grupos amínicos
están predominantemente en la forma protónica R-NH3
+
La estructura (A) iónica es la prevalente en la sangre y en la mayoría de los
tejidos. La estructura (B) no puede existir a ningún pH. La conveniencia nos

enseña sin embargo que la estructura (B) se use por razones didácticas y para
explicar la mayoría de las ecuaciones que entrañan reacciones distintas a las de
los equilibrios protónicos. La contribución más importante a la conducta de una
proteína como electrolito procede de los grupos ionizables existentes en las
cadenas laterales de los aminoácidos. La curva de titulación de una proteína ò
aminoácido con ácido ò álcali vendrá determinada en gran medida por el número
de cada uno de estos grupos ionizables de las cadenas laterales de sus unidades
de aminoácidos. Por estas razones las soluciones de proteínas tienen una poderosa
capacidad tampón.
Esta propiedad amortiguadora es de importancia decisiva en los sistemas
biológicos y ha sido estudiada con especial cuidado con relación a los
amortiguadores de la sangre humana cuyo pH es controlado dentro de estrechos
límites, tal como les expliqué en la clase teórica. Les dije que los valores de pH
sanguíneo varían dentro de lo normal entre 7.35 a 7.45, cuando la sangre alcanza
valores por debajo de 7.35 se produce acidosis; y cuando los valores de pH se
elevan por encima de 7.45 se produce alcalosis. La sangre contiene otros dos
sistemas tampones que son:
1) El Sistema bicarbonato/Acido carbónico (pK: 6,1)
2) El sistema fosfato mono sódico/di sódico (pK: 6,8)
La proteína màs importante de la sangre del ser humano es la Hemoglobina que
tiene gran capacidad tampón en la proximidad del pH 7.4, lo cual se debe a su
elevado contenido de histidina (grupo imidazol) Aproximadamente el 60% de la
capacidad tampón de la sangre total se debe a la Hb, y un 20% es atribuible a las
proteínas del plasma (seroalbùminas y globulinas).
Recordemos que según lo propuesto por Bronsted: un ácido es una sustancia que
al ionizarse genera iones Hidrógeno, H+
, una base es toda sustancia capaz de
aceptar estos iones hidrógeno. Como los ácidos ceden protones y las bases los
captan, a cada ácido le corresponde, como es lógico, una base conjugada. Es
decir, si un ácido cede un protón, el ion, así formado, puede captarlo de nuevo
comportándose como base. Por lo tanto, los procesos de cesión ò captura de
protones transcurren de forma reversible:
Cesión de protones
AH A-
+ H+
Acido captación de protones Base
El ácido y la base conjugada forman un par ácido/base.
Las soluciones que contienen ácidos débiles y sus sales se llaman soluciones
tampón, buffers ò amortiguadores. Su finalidad es impedir ò amortiguar las
bruscas variaciones del pH.
El pH de una solución amortiguadora puede calcularse utilizando la ecuación de
Henderson-Haselbach:

SAL
pH = pK + log ------------
ACIDO
A partir de esta ecuación se deduce que el pH de una disolución tampón depende
de la naturaleza del ácido que la integra y de la proporción entre la sal y el ácido
(logaritmo de la relación entre ambos) y no de las concentraciones absolutas de
cada uno de estos componentes. La eficacia amortiguadora es máxima cuando el
cociente de la relación sal/ácido es próximo a la unidad.
El objetivo de la presente práctica es demostrar la capacidad tampón de un
sistema amortiguador empleando un ácido débil y la sal del ácido débil y estudiar
la curva de titulación ò valoración de un ácido débil HA, como el ácido acético
(0.1N) y una base fuerte NaOH 0.1N y las variaciones del pH con respecto a
diferentes proporciones relativas entre la sal y el ácido de una solución tampón. (el
pK del ácido acético es 4.76) antes de agregar la base, el pH se debe solamente a
la presencia del ácido. Pero tan pronto como se añade algo de la base (NaOH
0.1N), ésta reacciona con una cantidad equivalente del ácido y forma una cantidad
equivalente de sal y agua. El ácido débil más su sal disuelta constituyen una
solución tampón (par amortiguador), cuyo pH puede calcularse mediante el uso de
la ecuación de H-H: pH = pK – log sal/ácido.
Se determinará el pH con el potenciómetro y se evaluarán los cambios en el pH
con la adición de volúmenes definidos de una base conocida (NaOH 0.1N).
Graficaremos en un sistema de coordenadas cartesianas los valores de pH vs los
ml de base agregados y obtendremos así la curva de titulación para el ácido.
Se empleará el equipo potenciómetro para determinar el pH, instrumento que
determina el pH en función de la fuerza electromotriz de una celda formada por un
electrodo de referencia, la solución problema y un electrodo de vidrio muy sensible
a los hidrogeniones.
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS:
Potenciómetro.
Beakers de 50 ml de vidrio (11 para cada mesa de trabajo).
Baguetas de vidrio (3 por cada mesa).
Pipetas de 10 ml graduadas 1/10 (3 por cada mesa).
Agua destilada.
Solución de CH3-COOH 0.1N.
Solución de NaOH 0.1N.
Papel milimetrado ò cuadriculado.
PARTE EXPERIMENTAL:

Mezclar los volúmenes de CH3-COOH 0.1N y de NaOH 0.1N con agua destilada
señalados en la tabla siguiente, mezclar bien y luego medir el pH en cada uno de
los 11 Beakers con el potenciómetro:
Beaker Nº Acido acético
0.1 N (ml)
NaOH
0.1N (ml)
Agua
destilada
(ml)
pH
1 10 0 10
2 10 1 9
3 10 2 8
4 10 3 7
5 10 4 6
6 10 5 5
7 10 6 4
8 10 7 3
9 10 8 2
10 10 9 1
11 10 10 0
En cada mesa los alumnos construirán su gráfica de valoración colocando en las
coordenadas los valores de pH en orden creciente y en el eje de las abscisas los
volúmenes de NaOH 0.1N añadidos en cada Beakers.
pH
ml NaOH añadido
CUESTIONARIO:
1.- Graficar la curva de valoración del ácido acético 0.1N vs. NaOH 0.1N.
2.- Identificar el punto de semi-valoraciòn y máxima capacidad tampón.
3.- Explique que es un par tampón, como funciona y porqué las proteínas
sanguíneas son amortiguadores.
4.- Describa las principales sustancias amortiguadoras del organismo
humano.

PRACTICA No 3
FACŢORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo, llamados enzimas
son proteínas que intervienen en las reacciones biológicas, acelerando la velocidad
de reacción hasta alcanzar su punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente
específicas en las reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados
sustratos) sobre los que actúan.
La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la velocidad en
reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de la cinética proporcionan
una herramienta bioquímica muy útil para calcular la concentración de una enzima
en una muestra biológica y comparar su actividad catalítica con la de otras
enzimas. Además, las mediciones cinéticas permiten describir de manera
cuantitativa el efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una
enzima.
La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada en parte
por las concentraciones de la enzima y el sustrato. A medida que progresa la
reacción, aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición
de los correspondientes sustratos, en tanto que la concentración de la enzima no
se altere.
La actividad enzimática puede expresarse:
a) Por la desaparición del sustrato (S).
b) Por la aparición de productos (P).
c) Por modificación de cofactores (C).
El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:
[E] + [S] [E] + [P]
C C'
Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:
1) Concentración de sustrato [S]
2) Concentración de la enzima [E]

3) pH del medio
4) Influencia de la temperatura
5) Efecto de inhibidores y activadores
En la presente práctica estudiaremos el efecto de estos factores sobre la actividad
enzimática de la amilasa salival sobre el almidón.
La amilasa es una enzima que degrada moléculas hidrocarbonadas complejas en
componentes más pequeños, tiene un PM de 40,000 a 50,000 daltons. Es
producida por el páncreas exocrino y las glándulas salivales para ayudar a digerir
el almidón. La amilasa humana se denomina “alfa-amilasa” por su capacidad para
romper los enlaces polisacáridos alfa-1,4 al azar. Los enlaces alfa-1,6 de los puntos
de ramificación no se alteran. El producto final de la acción de la alfa-amilasa
sobre el almidón es la formación de dextrinas, maltosas y algunas moléculas de
glucosa. El pH óptimo al cual actúa es 6.9 a 7 y se requiere cloro para su
activación.
En la práctica la actividad enzimática se medirá por la desaparición del sustrato
(disminución de la turbidez en los tubos que contienen almidón), la cual se
determinará en el espectrofotómetro a 650 nm.
EXPERIMENTO A
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA, DE LA TEMPERATURA Y
DEL ION CLORO SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL
1) Preparar los siguientes tubos:
Tubos No. I II III IV V VI VII-C
Solución almidón 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Buffer phosphate pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Soluciòn salina (NaCl 1%) 2.8 ml 2.6 ml 2.4 ml 2.2
ml
--- 2.2
ml
2.2 ml
Agua destilada --- --- --- --- 2.2
ml
--- ---
2) Colocar los tubos I al V en un baño de agua a 37°C, durante 5 minutos. El
tubo VI servirá de comparación para ver el efecto de la temperatura sobre
la acción enzimática por lo que se deja a temperatura ambiente.
3) Agregar la solución de enzima:

Solución amilasa 0.4 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6
ml
1.6
ml
1.6
ml
---
4) Colocar nuevamente los tubos I al V en baño de agua a 37°C durante 20
minutos, el tubo VI se mantiene a temperatura ambiente.
5) Luego hacer el control final de la reacción con el reactivo de yodo, de la
siguiente manera:
HCl 0.05 N 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
de los tubos de reacción
correspondientes agregar
0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5 ml
Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5
ml
0.5
ml
0.5
ml
0.5 ml
6) Mezclar y dejar en reposo por 10 minutos.
7) Leer las absorbancia al espectrofotómetro a 650 nm.
8) La diferencia de las absorbancia entre los tubos nos indicará la actividad
enzimática para cada tubo.
9) Graficar en papel milimetrado: Actividad enzimática en el eje Y vs
concentración de la enzima [E] en el eje X.
EXPERIMENTO B
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD
DE LA AMILASA SALIVAL
Tubos No. I II III IV V
Solución de almidón 1% 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml
Buffer phosphate pH 6.6 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada 5 ml 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml
2) Mezclar bien los tubos. Hacer un control con la solución yodada con todos
los cinco tubos de la misma manera que se hizo en el experimento anterior
y leer las absorbancia de dichos controles a 650 nm. Dichas absorbancia se
tomarán como lecturas iniciales.
3) Luego añadir 1 ml de solución de enzima a cada tubo y colocarlos en el
baño de agua a 37°C por 20 minutos.

4) Sacar los tubos y hacer un control con solución yodada de cada uno. Las
lecturas de absorbancia se tomarán ahora como lecturas finales.
5) Hacer la diferencia:
Actividad enzimática = Lectura inicial – Lectura final
El resultado de esta diferencia se considerará como actividad enzimática.
6) Determinar el Km experimental de la amilasa para el almidón a partir de
una gráfica de actividad enzimática contra [S] (Ecuación de Michaelis-
Menten) y una gráfica de dobles inversas: 1/actividad enzimática contra
1/[S] (Ecuación de Lineweaver-Burk). Graficar en papel milimetrado.
EXPERIMENTO C
EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL
Tubos No. I II III
Solución de almidón 1% 5 ml 5 ml 5 ml
Solución salina (NaCl 1%) 2 ml 2 ml 2 ml
Buffer phosphate pH 6.6 2 ml --- ---
Buffer phosphate pH 3.7 --- 2 ml ---
Buffer phosphate pH 8.0 --- --- 2 ml
2) Mezclar y colocar los tubos en baño de agua a 37°C por 5 minutos.
3) Añadir a cada tubo 2 ml de solución de enzima (amilasa).
4) Colocar nuevamente los tubos a 37°C por 20 minutos.
5) Extraer los tubos del baño y realizar el control mediante la solución yodada,
como en el experimento anterior.
6) Realizar el estudio crítico comparativo de ellos. Sacar conclusiones.
7) Graficar en papel milimetrado una curva de actividad enzimática vs pH.
CUESTIONARIO:
1.- Cuál es la importancia del Km.
2.- Qué efectos produce las altas temperaturas sobre las enzimas.
3.- Como se clasifican las enzimas?
4.- A que se llaman zimógenos e isoenzimas.
5.- Que son cofactores y mencione ejemplos.

PRACTICA No 4
EVALUACIÓN NUTRICIONAL BIOQUÍMICA Y ANTROPOMETRICA
La evaluación nutricional es parte de la evaluación integral del estado de salud de
un individuo. Es un requisito indispensable siempre que se desea mejorar,
promover o mantener un buen rendimiento físico, un buen estado de salud y
nutrición, además de dar una idea más exacta del nivel de rendimiento que se
tiene y que se puede alcanzar.
El objetivo general de la práctica es determinar el estado nutricional mediante un
diagnóstico que permita conocer el nivel nutricional actual, sobre todo aquellos
mas frecuentes en nuestro medio como el Marasmo y el Kwashiorkor.
ESTADO NUTRICIONAL: Es la condición de salud resultante en el tiempo, del
balance entre lo consumido y lo requerido, dependiendo de la Edad, Sexo, Peso,
Talla, etc. De cada persona. Es necesario considerar la calidad y cantidad de los
nutrientes consumidos y la utilización de estos en el organismo.
EVALUACIÓN NUTRICIONAL: Emplearemos métodos Antropométricos y
Bioquimico-Antropometricos además del Balance Nitrogenado y Evaluación
Inmunológica.
1. Evaluación antropométrica :
Emplearemos los Índices PESO/TALLA; Circunferencia del Brazo(CB);
Circunferencia Muscular del Brazo (CMB); Espesor del Pliegue Cutáneo del Tríceps
(EPCT); Índice de Masa Corporal (IMC); entre otros.

2. Evaluación bioquímica :
Utilizaremos la Proteína Total y la Albumina Séricas como índices de masa
proteica visceral.
El Balance Nitrogenado lo utilizaremos para evaluar los ingesta en relación
con la excreción de Nitrógeno.
Como Evaluador Bioquimico-Antropomedico (Mixto) utilizaremos el índice
Creatinina Urinaria/Talla para la evaluación de la masa muscular esquelética.
3.Evaluacion Inmunológica :
Empleando los TEST de Hipersensibilidad Cutánea Retardada: Tuberculina,
Candidina, etc.
3. Evaluación Clínica :
Diferenciaremos el Marasmo del Kwashiorkor en sus mas importantes
diferencias Bioquímicas y Clínicas.
EXPERIMENTO “A”
EVALUACION DE LA MASA PROTEICA VISCERAL
DETERMINACIÓN DE PROTEINAS Y ALBÚMINA EN SUERO
FUNDAMENTOS DEL METODO:
Los enlaces peptídico de las proteínas reaccionan en un medio alcalino con el ion
cúprico del reactivo de Biuret, estabilizado por tartrato, para formar un complejo
de color violeta cuya máxima absorción se da a 540 nm.
NaOH
Cobre + proteína Complejo cupro-proteico
El dosaje de proteínas totales tiene poco valor como prueba aislada porque la
alteración en una de las fracciones puede ser balanceada por una alteración
opuesta de otra fracción. Por lo tanto, es importante que adicionalmente se
determine la concentración de albúmina.
La albúmina tambièn va a ser dosada por el método de Biuret, pero previamente al
suero se le hace un tratamiento con sulfato de sodio y eter etílico para lograr la
separación de las globulinas y permitir solo el dosaje de albúminas.

REACTIVOS PROVISTOS:
Reactivo EDTA/Cu: Complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil
aril poli éter (AAP).
Reactivo BCF: Solución de 3,3´,5,5’-tetrabromo Cresolsulfon ftaleínas (en
polioxietilén lauril éter).
Suero Patrón: Solución de Albumina y Globulinas en estado nativo con titulo
conocido de proteínas (Biuret o Kjeldhal) y Albumina (unión BCF).
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS EN SUERO:
Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:
Blanco
(ml)
Standard
(ml)
Muestra
(ml)
Agua Destilada 50 ul --- ---
Estándar (Suero Patrón) --- 50 ul ---
Muestra --- --- 50 ul
Reactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar, incubar a 37°C.
Leer las absorbancia a una longitud de onda de 540 nm.
CALCULOS: Calcular la concentración de proteínas (en g/dl), utilizando el método
del Factor de Calibración.
La lectura del tubo blanco debe ser restada de la lectura de los tubos muestra y
standard para obtener una absorbancia neta, sin la intervención del color propio
del reactivo.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA EN SUERO:
Preparar tres tubos y agregar en cada uno lo siguiente:
Blanco
(ml)
Standard
(ml)
Muestra
(ml)
Standard (Suero Patrón) --- 10 ul ---
Muestra --- --- 10 ul
Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar y mantener los tubos entre 15 y 28°C durante 10 minutos.
Leer las absorbancias a una longitud de onda de 625 nm.

CALCULOS: Calcular la concentración de albúmina (en g/dl) utilizando el método
del Factor de Calibración, en forma similar que para el caso de las proteínas
totales.
P.T.(g/dl)
PROTEINAS TOTALES (g/dl) =--------------------------
S
Alb. (g/dl)
ALBUMINA (g/dl) =------------------------------
S
Albumina (g/dl)
RELACION A/G =---------------------------------------
P.T. (G/DL) – Alb. (g/dl)
VALORES NORMALES:
Proteínas Totales= 6.1 – 7.9 g/dl.
Albúmina = 3.5 – 4.8 g/dl.
Relación A/G = 1,2 a 2,2
CUESTIONARIO.-
1.- Diga Ud. Como se evalúa la masa Proteica Visceral?
2.- Que cosa es la Presión Oncotica de las Proteínas y como explica Ud. El Edema
por Desnutrición.
3.- Que tipo de Trastornos Nutricionales conoce según lo explicado en clases?
4.- Investigue la importancia nutricional que tiene la Transferrina, pre albúmina y
proteína transportadora de retinol plasmática.
5.- Qué es el Índice de Masa Corporal, como se calcula, valores normales e
interpretación?

PRACTICA No 5
DETERMINACIÓN DE LA GLICEMIA, INVESTIGACIÓN DE GLUCOSURIA
El mantenimiento de la glicemia, o concentración plasmática de glucosa, en los
organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los
órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal. La coordinación de
los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la
relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan
(almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va seguida, en las
personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la
puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa
(por glucólisis, entre otras), aceleración de la Gluconeogénesis y disminución
de la glucogenólisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de
insulina, una hormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la
producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las
células, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia);
así ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente
de insulina" o "tipo I".
El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en
antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglucemia significativa.

Experimento A: DETERMINACIÓN DIRECTA DE LA GLICEMIA
(concentración de glucosa en suero)
FUNDAMENTO TEÓRICO
Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento
de la concentración de glucosa en sangre (glicemia), que se produce de manera
repentina y además es severa. Una hiperglucemia superior a 124 mg/dl detectada
en más de una ocasión en ayunas, además se considera también un valor mayor a
200 mg/dl en cualquier momento son indicativos de posible diabetes, diagnóstico
que debe confirmarse con otras pruebas.
La determinación de glucosa sanguínea es una prueba muy frecuente en
bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como
enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos.
Hay dos tipos de métodos químicos:
a. Reducimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa.
Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos
métodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa
verdadera. Ejemplos son el método de Folin-Wu y el de Somogy-Nelson.
b. Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al
sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que
emplea orto-toluidina.
En cuanto a los métodos enzimáticos:
a. Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-
fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de
NADPH, que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el
método de referencia recomendado por las organizaciones internacionales.
b. Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en
esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de la muestra
problema y de los estándares. Se explica a continuación:

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la
oxidación de la D-glucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de
hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4-aminofenazona y
al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será
proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. El esquema de la
reacción es el siguiente:
MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo de 10 ml.
Pipetas.
Espectrofotómetro.
Agua destilada.
Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-
aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
La muestra de sangre extraída del paciente será centrifugada y se separará el
suero. Hacer una dilución del suero midiendo exactamente en un tubo de ensayo
0.2 ml de suero y agregar 4.8 ml de agua destilada, mezclar hasta homogenizar.
Luego se preparan los siguientes tubos:

Tubos: Blanco Standard Muestra
Muestra (Suero diluido) --- --- 20 ul
Estándar de glucosa --- 20 ul ---
Reactivo de glucosa 2 ml 2 ml 2 ml
Incubar los tres tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Mezclar bien la
solución. Leer las absorbancias en el espectrofotómetro a 505 nm.
CALCULOS
Encontrar la concentración de glucosa en la muestra utilizando el método del
factor de calibración.
VALORES NORMALES
La glicemia normal en ayunas es de 70 a 110 mg/dl.
Experimento B: INVESTIGACIÓN CUALITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA
FUNDAMENTO TEORICO
En estado normal no existen cantidades detectables de glucosa en orina, por lo
menos con los métodos habitualmente utilizados en el laboratorio. La glucosuria
(presencia de glucosa en orina) se presenta en la diabetes Mellitus pero cuando se
supera el umbral renal de glucosa que ocurre cuando la glicemia es mayor de 180
mg/dl.
Para la detección cualitativa de glucosa en orina se basa en la acción de la glucosa,
que reduce las sales de cobre en medio alcalino por ebullición. Para ello
utilizaremos el reactivo de Benedict el cual contiene: sulfato de cobre, citrato de
sodio y carbonato de sodio.
Pipetas.
Mechero de Bunsen.
Reactivo de Benedict.
Pinzas porta tubos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Tubos: I II
Orina normal (gotas) 10 gotas ---
Orina DM (gotas) --- 10 gotas
Reactivo de Benedict (ml) 2 ml 2 ml
Calentar directamente a la llama de un mechero hasta la ebullición de la mezcla en
cuestión. Si la orina contiene glucosa, se observa un precipitado color verde,
amarillo ò rojo ladrillo dependiendo de la cantidad en que se halle presente la
glucosa en la orina. De ser negativa la reacción permanecerá de color azul.
CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué es la diabetes Mellitus y como se diagnostica desde el punto de vista del
laboratorio?
2.- Explique en que consiste el umbral renal y la tasa de reabsorción de la
glucosa.
3.- Describa los métodos que existen para el dosaje de la glicemia.
4.- Explique el mecanismo de acción de los reactivos de Benedict y de Fehling.
5.- Que son la hemoglobina glicosilada y la fructosamina y cuál es su importancia
en la diabetes?

PRACTICA No 6
TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA POST PRANDIAL
Definición de DM
La diabetes Mellitus es un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por
la presencia de hiperglucemia resultante de un defecto en la secreción de insulina,
en la acción insulínica, o en ambas.
Clasificación de DM

Diagnóstico
Es muy importante el diagnóstico temprano de la enfermedad debido a que niveles
elevados de glucosa, aún cercanos al límite superior normal, producen daños en la
microvasculatura de retina y riñón
Existen otras entidades fisiopatológicas relacionadas con hiperglucemia que no
llegan a cumplir los criterios de diabetes pero que son muy importantes ya que
deben ser vigiladas ya que estos pacientes presentan riesgo elevado de
evolucionar a diabetes. Estas son la tolerancia disminuida a la glucosa y la glucosa
en ayunas anormal.
Tolerancia disminuida a la glucosa es aquel caso cuando después de una
prueba de tolerancia con 75 g de glucosa se obtienen a las dos horas valores
mayores a 140 y menores a 200 mg/dl.
La glucosa anormal en ayunas es aquel caso en que los valores en ayunas
son mayores a 110 pero menores a 126 mg/dl.

Experimento A: TEST DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA Y GLUCOSA
POSTPRANDIAL
FUNDAMENTO TEÓRICO
Las pruebas de tolerancia a la glucosa oral fueron utilizadas por mucho tiempo
para diagnóstico de Diabetes Mellitus o intolerancia disminuida, pero ya no se
utilizan de rutina, pero si pueden servir tanto para la Diabetes como para la
intolerancia. Importante es recalcar que los niveles importantes en ambos casos
son los obtenidos a las dos horas, y que la cantidad de glucosa a ingerir debe ser
de 75 gramos. El disolver 75 gramos en por lo menos 300 ml de agua hace la
solución más agradable al paladar y por lo tanto tendrán más aceptación por parte
del paciente.
Ayunas 70-110 mg/dl
30 min <200 mg/dl
1 hora <180 mg/dl
2 horas <140 mg/dl
En caso de la prueba de tolerancia de 75 gramos en adultos en niños se debe
utilizar una cantidad de glucosa correspondiente al peso del niño (1,75 g de
glucosa por Kg de peso). Es de suma importancia recordar que antes de iniciar
cualquier prueba de tolerancia a la glucosa oral, se debe pedir una muestra de
orina al paciente, para hacerle un análisis cualitativo glucosa. Esto debido a que si
el paciente presenta glucosuria, no se debe realizar la prueba de tolerancia, ya que
la glucosuria indica en la gran mayoría de los casos, niveles sanguíneos de glucosa
elevados y la ingesta de altas concentraciones de glucosa le podría provocar al
paciente un shock hiperglicémico.
Existen otras pruebas de tolerancia que son aceptadas tanto por la
Organización Mundial de la Salud como por la American Diabetes Association, estas
son las relacionadas con la Diabetes Mellitus Gestacional.

La curva de tolerancia a la glucosa para tamiz de la DMG consiste en la ingesta
en ayunas de 50 gramos de glucosa, se mide la glicemia a la hora, si los niveles
son menores a 140 mg/dl se desecha la DMG, si los niveles son iguales o mayores
a 140 mg/dl se debe proceder a hacer la prueba confirmatoria para DMG. Esta
consiste en ingerir en ayunas 100 gramos de glucosa y hacer una curva de tres
horas. Si dos de los niveles obtenidos en dicha curva sobrepasan los valores
indicados en la siguiente tabla, se hace el diagnóstico de DMG.
Ayunas 105 mg/dl
1 hora 190 mg/dl
2 horas 165 mg/dl
3 horas 145 mg/dl
La prueba de glucosa postprandial viene a ser una prueba de tolerancia a la
glucosa acortada, donde solo se considera el valor basal y el de las dos horas.
Ayunas 70-110 mg/dl
2 horas <140 mg/dl
Micro pipetas automáticas de 10 ul.
Espectrofotómetro.
Solución patrón de glucosa (100 mg/dl).
Reactivo de color de glucosa, que contiene: Glucosa oxidasa, peroxidasa, 4-
aminofenazona, fenol, tampón fosfato pH: 7.0
Se determinará la glicemia en muestras obtenidas a una persona en forma basal,
a los 30 min, 60 min y 120 min. Luego de tomar la muestra sanguínea basal se le
da de tomar al paciente 75 gr de glucosa disuelto en 300 mL de agua con unas
gotas de limón. Las muestras de sangre extraídas de la persona serán
centrifugadas y se separarán los sueros. Para la determinación de las glicemias se
utilizará el método de la glucosa oxidasa – peroxidasa (GOD-POD).

Tubos: Blanco Standard Muestra
(0’)
Muestra
(30’)
Muestra
(60’)
Muestra
(120’)
Muestra --- --- 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul
Estándar --- 20 ul --- --- --- ---
Reactivo de glucosa 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Incubar los tubos en Baño María de 37ºC por 10 minutos. Leer las absorbancias
para cada una de los tubos en el espectrofotómetro a 505 nm.
CALCULOS
Encontrar la concentración de glucosa en cada una de las muestras utilizando el
método del factor de calibración.
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos de glicemia obtenidos en el experimento construir en un papel milimetrado una
gráficade tiempovs.Glicemiay apreciar lacurvadetoleranciaalaglucosa.
2.- Como sería esta curva en el caso de una persona normal, un diabético y un intolerante a la
glucosa.
3.- Que importanciatieneladetección de microalbuminuriaenunapersona.
4.- Quésonyen que casos sehace un dosaje de péptidoCy deinsulinaenun paciente diabético.
5.- Cuáles sonlas complicaciones agudas ycrónicas deladiabetes?

PRACTICA No 7
DOSAJE DE AMILASA SERICA Y URINARIA
La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce principalmente en la
fracción exocrina del páncreas y en las glándulas salivales.
Su acción se dirige particularmente a escindir los enlaces alfa 1-4 glucosìdicos de
los polisacáridos como almidón y glucógeno.
En pacientes con pancreatitis aguda, la amilasa sérica empieza a elevarse en las
primeras 2 a 3 horas de la enfermedad, alcanzando los valores más elevados entre
las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles
normales entre el 3º y 6º día. También se ve aumentada en este caso la excreción
urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 días, luego de que la
actividad sérica ha alcanzado los niveles normales.
También es posible encontrar valores aumentados en pacientes con ulcera gástrica
o duodenal perforada, obstrucción intestinal, obstrucción de conductos biliares,
pancreatitis crónica, hipertiroidismo, carcinoma de cabeza de páncreas,
administración de opiáceos y en general cualquier caso de “abdomen agudo” o
intervención quirúrgica en regiones próximas al páncreas.
Las parotiditis bacterianas y virales, que producen bloqueo de la secreción de
amilasa salival, se asocian también con elevaciones en los niveles de amilasa
sérica.
PANCREATITIS AGUDA:
Definición: Es un desorden inflamatorio del páncreas, en el cual la función
pancreática normal debe ser restaurada una vez que la causa primaria del evento
agudo es superado.

Causas:
- Pancreatitis por cálculos biliares: 60% (en nuestro medio)
- Pancreatitis alcohólica: 80% (en países Anglosajones)
- Pancreatitis de causa idiopática: 30%
- Pancreatitis por tumores
- Pancreatitis por condiciones metabólicas asociadas
- Hipertrigliceridemia
- Hipoparatiroidismo
- Hipercalcemia
- Hiperlipoproteinemia Tipo V; también tipos I y IV
- Pancreatitis por Toxinas (Insecticidas)
- Pancreatitis por picadura de escorpión en América del Sur y Central
- Pancreatitis por Metanol
- Pancreatitis traumática (Trauma abdominal)
- Pancreatitis Iatrogénica: ERCP, por corte esfínter de Oddi Cirugía
pancreatobiliar,
transplante renal-Vasculitis- SIDA-Parasitosis
PANCREATITIS CRÓNICA:
Definición: Es un estado inflamatorio crónico que determina un daño irreversible
de la estructura y función pancreática. El curso clínico de la pancreatitis crónica
puede consistir en ataques recurrentes agudos o una relativa progresión de
síntomas.
En 1988 la clasificación Marseilles - Roma de Pancreatitis reconoció la Pancreatitis
Crónica Obstructiva subsecuente a la pancreatitis crónica. Ésta es causada por la
lesión obstructiva, es la forma más común de pancreatitis, la que se caracteriza
por cambios crónicos irreversibles.
Causas:
- Pancreatitis Alcohólica
- Pancreatitis Idiopática
- Pancreatitis Crónica Tropical
- Pancreatitis Hereditaria
- Pancreatitis por Hipoparatiroidismo
- Pancreatitis por Lesiones Traumáticas del Conducto Ductal

Experimento A: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN SUERO
En este método el sustrato, almidón tamponado, se incuba con la muestra,
produciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo
de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no
hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato control (sin muestra)
es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en Unidades Amilolíticas
(Smith & Roe)/decilitro (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarogènicas
(Somogy)/decilitro.
MATERIALES Y REACTIVOS:
- Espectrofotómetro.
- Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Tubos de ensayo y cubetas de lectura.
- Baño María a 37ºC.
- Reloj o timer.
- Sustrato: solución de almidón 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer
fosfato 0.1 mol/l en NaCl 0.15 mol/l.
- Reactivo de yodo: solución 0.01 eq/l de yodo en HCl 0.02 mol/l.
Preparar los siguientes tubos:
Control Muestra
Sustrato 1 ml 1 ml
Dejar unos minutos en baño de agua a 37ºC y agregar:
Muestra --- 20 uL
Incubar a 37ºC. A los 7’30” exactos, agregar:
Reactivo de yodo 1 ml 1 ml
Mezclar por agitación suave. Retirar los tubos del baño y agregar:
Agua destilada 8 ml 8 ml
Mezclar por inversión.
Leer en espectrofotómetro a 640 nm, llevando a cero el aparato con agua
destilada.

Experimento B: DETERMINACIÓN DE AMILASA EN ORINA
El procedimiento es igual que el caso anterior, solamente que en este caso la
muestra en lugar de suero es orina diluida la cual debe obtenerse de la siguiente
manera:
El paciente debe orinar descartando esta micción, dos horas después vuelve a
orinar y recoge toda la orina. Esta muestra, que corresponde a dos horas de
diuresis, se diluye a 200 ml con agua destilada. La determinación se efectúa con
20 uL de esta dilución, obteniéndose el resultado directamente en Unidades
Amilolíticas/hora.
CALCULO DE LOS RESULTADOS:
Para ambos experimentos se empleará la siguiente fórmula:
Abs. Control - Abs. Muestra
Amilasa UA/dl = --------------------------------------- x 1000
Abs. Control
Unidades: Una Unidad Amilolíticas (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100
ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las
condiciones de la reacción. En esta técnica se incuban 20 uL de muestra con 0.5
mg de almidón contenidos en 1 ml de Sustrato durante 7 minutos y medio, lo que
equivale a incubar 100 ml de suero con 10,000 mg de almidón durante 30
minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra
sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción
de almidón digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA:
Suero
(UA/dl)
Orina
(UA/hora)
Normal <120 <260
Pancreatitis aguda 300 a 12000 Más de 900
Pancreatitis crónica Hasta 200 Más de 300
Parotiditis 200 a 350 350 a 750
Parotiditis con complicación pancreática Más de 350 Más de 750
Procesos abdominales agudos (sin
pancreatitis)
Normal Normal
CUESTIONARIO:
1.- Explique como se produce la activación de las enzimas producidas por el
páncreas exocrino?
2.- En una pancreatitis que importancia tiene el dosaje de las enzimas: lipasa,
tripsina, elastasa y fosfolipasa A2?
3.- Explique como se produce la digestión completa del almidón en nuestro tubo
digestivo.
4.- Cuál es el cuadro clínico de una pancreatitis aguda?
5.- Qué otros exámenes auxiliares se pueden realizar para confirmar el
diagnóstico de pancreatitis?

PRACTICA N°08
CETOACIDOSIS DIABÉTICA
BASE BIOQUÍMICA.
La Diabetes Mellitus se caracteriza por hiperglucemia y otros desarreglos que se
deben a una inadecuada acción de la Insulina sobre los tejidos corporales, ya sea
porque exista un reducido nivel circulante de Insulina ó una resistencia de los
tejidos blanco a sus acciones .La Diabetes se divide en dos categorías –
a) Diabetes Tipo I ó Diabetes Insulina dependiente ó Diabetes juvenil (llamada así
porque se inicia en la juventud) y la Diabetes tipo II ó no insulina dependiente
(diabetes de inicio en la edad madura). Pueden haber tipos intermedios que se
superponen.
(A)LA DIABETES TIPO I afecta al 10 % de los pacientes diabéticos y la
dependencia de la Insulina significa que no solamente que la insulina es necesaria
para el óptimo control de la glucosa sanguínea, que también podría ser cierto para
la forma tipo II, sino que “sin Insulina exógena el paciente es mas proclive a
desarrollar CETOACIDOSIS diabética.
(1) Se sabe que esto refleja una completa ó casi ausencia de insulina en estos
pacientes, en contraste con la falta parcial de insulina ó la resistencia a la insulina
característica de los pacientes del tipo II.
(2) Otra característica clave de los pacientes con Diabetes tipo I es su
presencia en niños y adultos jóvenes y su presencia en las personas mas bien
delgadas que obesas.
(B) LA DIABETES TIPO II comúnmente afecta a las personas de edad madura, y
con sobrepeso.
(1) Como algo de insulina es producida en estos pacientes, no se produce
cetoacidosis
(2) Sin embargo puede ser necesario el tratamiento con insulina para prevenir la
severa hiperglucemia.

Debemos saber desde ahora que se puede producir Diabetes secundaria ó
alterarse la tolerancia a la glucosa de modo secundario a ciertas enfermedades
que afectan la producción ó la acción de la Insulina, tales como la pancreatitis
crónica, el Síndrome de Cushing, la acromegalia, la alteración de los receptores de
insulina y otras.
El síntoma mas común que produce la hiperglucemia es la poliuria(Aumento del
volumen urinario) y la polidipsia( incremento en la ingesta de agua), lo cual se
debe a la diuresis osmótica inducida por la glucosa. El incremento en la ingesta de
agua es una respuesta a deshidratación y sed..Se produce disminución de peso
corporal, debido a la pérdida de glucosa por la orina y a los efectos catabólicos de
la disminución de la acción de la insulina, a pesar de la mayor ingesta de alimentos
(Polifagia).La debilidad generalizada refleja las alteraciones metabólicas .Las
infecciones de la piel, vulva y tracto urinario son frecuentes sobre todo en los
casos no controlados debido a que la hiperglucemia disminuye la resistencia a las
infecciones. La alteraciones en la retina son precoces.
CET0ACIDOSIS DIABETICA:
Se produce en los diabéticos insulinodependientes cuyo nivel de insulina circulante
es insuficiente para permitir una utilización de la glucosa por los tejidos
periféricos y para inhibir la producción de glucosa y el catabolismo tisular. El
incremento del Glucagón y el aumento de las hormonas que aumentan en
respuesta al stress ( como la adrenalina, noradrenalina, cortisol y hormona del
crecimiento) contribuyen a los desarreglos metabólicos. La insuficiente cantidad
de insulina reduce la utilización periférica de glucosa y junto con el exceso de
glucagón incrementan la producción hepática de glucosa a través de la
estimulación de la Gluconeogénesis y la glucogenólisis y la inhibición de la
glicólisis. La degradación de las proteínas en los tejidos periféricos suministra un
flujo de aminoácidos hacia el hígado como substrato para la Gluconeogénesis. El
resultado es la hiperglucemia .La diuresis osmótica resulta de la elevación de la
glucosa (y cuerpos cetónicos) y genera hipovolemia, deshidratación y pérdida de
sodio, fosfato de potasio y otras substancias por la orina. La depleción del volumen
estimula la liberación de catecolaminas lo cual se opone a la acción de la insulina
en el hígado y contribuye a la LIPOLISIS.
CETOGENESIS:
La lipólisis acentuada que resulta de la falta de insulina y del exceso de
catecolaminas moviliza los ácidos grasas libres desde sus depósitos en el tejido
adiposo y en lugar de reesterificarse con el glicerol para formar Triacilgliceroles, el
hígado desvía
sus rutas metabólicas hacia la producción de cuerpos cetónicos. El glucagón
incrementa el nivel de carnitina, que capacita a los ácidos grasos a entrar en la
mitocondria, donde ellos sufren beta oxidación hacia cuerpos cetónicos.

Además el glucagón disminuye el contenido hepático de malonil CoA, que es un
inhibidor de la oxidación de ácidos grasos.
ACIDOSIS: El incremento de la producción hepática de cuerpos cetónicos
(Acetoacetato y beta hidroxibutírico) excede la capacidad corporal de
metabolizarlos ó excretarlos. Sus H+
son tamponados por el bicarbonato,
conduciendo a una caída del bicarbonato sérico y del pH sanguíneo. Se encontrará
entonces: hiperglucemia, hipercetonemia, acidosis metabólica, disminución del
bicarbonato, disminución del pH sanguíneo y presencia en la orina de glucosa
(glucosuria) y cuerpos cetónicos ó cetonuria.
OBJETIVO DE LA PRACTICA.-
Aprender a interpretar los niveles de bicarbonato sérico, pH sanguíneo y presencia
de cuerpos cetónicos en la orina en presencia de Cetoacidosis Diabética.
EXPERIMENTO A:
DOSAJE DE BICARBONATO SÉRICO
Reactivos y materiales:
HCl 0.01 N
NaOH 0.01 N
Fenolftaleína 20 mg% soluciòn alcohólica
Alcohol Etílico (corriente)
Muestras problemas de bicarbonato para titularlas..
Pipetas de 5 ml graduadas al décimo
Pipetas de 1 ml graduadas al centésimo
Beakers de vidrio de 100 ó 50 ml
Baguetas de vidrio
Baño María de 37°C
Reloj de intervalos
Método:
En un Beakers de vidrio colocar:
5 ml de HCl 0.01 N
1 ml de suero
2 gotas de alcohol
Agitar y luego reposo 2 min.
Añadir 3 gotas del indicador fenolftaleína.
Colocar a 37° C en Baño María por 10 minutos.
Titular con NaOH 0.01N, hasta obtener un color rosado pálido.
Anotar la cantidad de NaOH gastado.

Cálculos:
(5 - X ml gastados de NaOH en la titulación) x 10 = mMol/ Litro de HCO3-
Considerar que:
a) 1ml de NaOH 0.01 N equivale 0.01 mEq HCO3 –
b) Vol. de muestra usada en la titulación: 1 ml
c) Expresar los valores de HCO3-
en mMol/Litro
Valores Referenciales (Normales): 22 á 26 mMol/Litro
EXPERIMENTO B:
INVESTIGACION DE CUERPO CETONICOS en la ORINA
Test de Rothera.- Esta prueba depende de la la reacción entre la Acetona y el
nitroprusiato para formar un complejo coloreado púrpura rojizo. Indica la
presencia de acetoacetato y/o acetona.
Reactivos:
Cristales de sulfato de amonio
Solución de Nitro prusiato al 10% en soluciòn acuosa, la cual deberá ser fresca.
Amoniaco solución (Hidróxido de amonio concentrado)
Muestra problema: orina
Tubos de prueba de vidrio de 13x 100 mm aproximadamente
Pipetas Pasteur capilares ó pipetas de vidrio de 1 ml terminales
Espátulas ó baja lenguas de madera.
Baguetas de vidrio.
Procedimiento:
NO SE DEBERA PIPETAR NINGUN REACTIVO CON LA BOCA. PROHIBIDO
HACERLO. Colocar aproximadamente 2 ml de orina en un tubo de prueba y
añadirle con la espátula aproximadam.0.5 g de sulfato de amonio en cristales.
Disolver con baguete. Añadir 2 á 3 gotas de sol. Nitro prusiato 10%.
Mezclar bien Por la pared lateral del tubo de prueba, sin pipetear con la boca,
lentamente, en zona deslizar el amoniaco con una pipeta Pasteur ó pipeta de
vidrio. Deberán quedar dos capas bien definidas. Esperar unos minutos y ver la
formación de un anillo morado en la interface en caso positivo para cuerpo
cetónicos .Si no aparece este color la prueba es negativa.

CUESTIONARIO:
1.- Explique la formación de cuerpos cetónicos y porque se producen.
2.- Explique las diferencias entre cetoacidosis diabética y coma hiperosmolar.
3.- Como se diagnostica a un paciente que está en cetoacidosis diabética?
4.- A qué se llama: exceso de bases y reserva alcalina.
5.- Explique los diferentes métodos de laboratorio que existen para el dosaje
tanto de bicarbonato en sangre como de cuerpos cetónicos en orina.

PRACTICA Nº 9
PERFIL LIPIDICO: COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO
El nivel sérico de colesterol ha sido objeto en los últimos años de numerosas
investigaciones tanto en individuos sanos como enfermos.
Desde un punto de vista médico la determinación de colesterol en forma aislada tiene
utilidad diagnóstica limitada. Sin embargo, su concentración varía de manera más o
menos predecible en un gran número de condiciones clínicas. Se ha visto que el colesterol
es uno de los factores contribuyentes a la formación de ateromas dado que las
complicaciones arterioescleróticas prevalecen en individuos hipercolesterolemicos.
Diversos estudios epidemiológicos han permitido observar además, que el riesgo de
contraer enfermedad cardíaca coronaria (ECC) para los individuos (varones de más de 40
años) con colesterolemia menor ò igual a 200 mg% es 3 veces menor que entre
individuos con más de 230 mg% y 6 veces menor que entre individuos con más de 260
mg%.
Sin embargo, actualmente se sabe que es necesario conocer además la distribución de las
lipoproteínas encargadas del transporte: HDL (lipoproteínas de alta densidad),
considerada como el “factor protector” y LDL (lipoproteínas de baja densidad),
consideradas como el verdadero “factor de riesgo”. Las funciones biológicas inherentes a
los distintos grupos de lipoproteínas, las variaciones en su composición y los resultados
de los diversos estudios epidemiológicos, indican que los valores aislados de colesterol
HDL y colesterol LDL no pueden tomarse como índices predicativos de riesgo, sino que es
necesario conformar un perfil Lipidico con los valores de colesterol total, colesterol LDL y
colesterol HDL.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO
El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa
hidrólisis enzimática de los esteres mediante una lipasa de origen fungal. El agua
oxigenada generada en la oxidación, produce la copulación oxidativa del fenol con la 4-
aminofenazona (4-AF) mediante una reacción catalizada por la peroxidasa. El producto es
una quinonaimina roja con absorbancia máxima a 505 nm.
Lipasa
Esteres de colesterol colesterol + ácidos grasos
CHOD
Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2
POD
H2O2 + 4-AF 4-(p-benzoquinona monoimino)-fenazona + 4 H2O
REACTIVOS:
Standard: solución de colesterol 200 mg%
Enzimas: suspensión conteniendo lipasa fungal (300 U/ml), colesterol oxidasa (3 U/ml) y
peroxidasa (20 U/l).
Reactivo 4-AF: solución de 4-aminofenazona (25 mmol/l).
Reactivo Fenol: solución de fenol (55 mmol/l).
Reactivo de trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo colocar en una probeta 50
partes de agua destilada, 5 partes de reactivo 4-AF, 5 partes de reactivo fenol y llevar a
100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de enzimas previamente homogenizadas.
Mezclar por inversión, sin agitar.
PROCEDIMIENTO:
En tres tubos colocar:
Tubos Blanco Standard Muestra
Standard --- 20 uL ---
Muestra --- --- 20 uL
Reactivo de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Incubar 15 minutos en Baño María a 37ºC.
Leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

CALCULO DE RESULTADOS:
Calcular la concentración de colesterol total en suero, aplicando el método del factor de
calibración.
Recordar que la concentración del standard de colesterol es de 200 mg%
Los valores de colesterol en sangre fluctúan según edad, sexo y hábitos de dieta y de
ejercicio. Sin embargo, es preferible no hacer referencia a valores “normales”, pues la
norma promedio de una población no necesariamente refleja ausencia de riesgo
patológico en el caso de colesterol.
Menos de 200 mg% valor deseable
200 a 239 mg% valor frontera
Mayor de 240 mg% valor alto
Experimento B: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL HDL EN SUERO
Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las
lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL y VLDL) mediante el agregado de
Sulfato de Dextrán de PM 500,000 en presencia de iones Mg++.
En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la
determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema más
conveniente.
REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Contiene una solución de Sulfato de Dextrán y de
Cl2Mg.H2O
PROCEDIMIENTO:
En un tubo medir 0.5 ml de muestra y agregar 0.05 ml (50 ul) de Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 30-40 minutos en refrigeración (4-10°C). No colocar en el congelador.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

Standard --- 20 ul ---
Muestra “Sobrenadante” --- --- 100 ul
CALCULOS:
De acuerdo al método del factor de calibración, considerando que la concentración del
standard es de 45.7 mg%.
VALORES NORMALES:
40 – 65 mg%
Experimento C: DETERMINACIÓN DE COLESTEROL LDL EN SUERO
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se separan del suero precipitándolas
selectivamente mediante el agregado de polímeros de alto peso molecular. Luego
de centrifugar, en el sobrenadante quedan las demás lipoproteínas (HDL y VLDL),
el colesterol ligado a las mismas se determina empleando el sistema más
conveniente.
Por diferencia entre el colesterol total y el determinado en el sobrenadante, se
obtiene el colesterol unido a las LDL.
REACTIVOS:
REACTIVO PRECIPITANTE.- Solución de sulfato de polivinilo disuelto en
polietilenglicol (PM 600).
PROCEDIMIENTO:
En un tubo, colocar 0.2 ml (200 ul) de suero problema y añadir 0.1 ml (100 ul) de
Reactivo Precipitante.
Homogenizar agitando (sin invertir) durante 20 segundos.
Dejar 15 minutos en un baño de agua a 20-25°C.
Centrifugar a 3000 rpm. X 03 minutos
Usar el sobrenadante como muestra.

Muestra “Sobrenadante” --- --- 100 uL
Incubar 15 minutos en baño de agua a 37ºC.
CALCULOS:
LDL Colesterol = Colesterol total - (Abs muestra neta x factor de calibración)
La concentración del standard es de 62.4 mg%.
VALORES NORMALES:
Riesgo bajo o nulo: Menor de 140 mg%
Riesgo moderado: 140 a 190 mg%
Riesgo elevado : Mayor de 190 mg%
CUESTIONARIO:
1.- Qué es RIESGO CORONARIO y como se calcula?
2.- Explique que diferencias hay entre la arterioesclerosis y la ateroesclerosis?
3.- Describa como se produce la biosíntesis de colesterol dentro del organismo.
4.- Explique que es el colesterol VLDL y como se calcula.
5.- Que rol cumplen los triglicéridos y como se realiza su metabolismo.

PRACTICA Nº10
PERFIL LIPIDICO II: TRIGLICERIDOS
Los triglicéridos forman la mayor parte del peso seco del tejido adiposo, constituyendo
por lo tanto una potente forma de almacenamiento de energía.
El movimiento de ácidos grasos entre los distintos compartimientos del organismo, se
produce con gran rapidez en respuesta a diversos estímulos (dieta, actividad física,
stress, edad, etc.). Por este motivo es de esperar que los triglicéridos (uno de los más
importantes vehículos para el transporte de ácidos grasos) varíen también su
concentración en respuesta a estos factores fisiológicos.
Sin embargo, el equilibrio de estos mecanismos puede verse alterado, conduciendo a
niveles anormales de triglicéridos circulantes. La persistencia de esta condición, se
asocia con numerosas patologías, tales como enfermedad hepática, renal,
Hiperlipidemias esenciales, etc.
Un caso que resulta de particular interés es el aumento de triglicéridos en individuos
obesos, en los cuales tiene importancia pronostica, respecto a la probabilidad de
desarrollar enfermedad cardíaca coronaria. Alrededor del 50% de los lípidos de las
lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son triglicéridos, por lo
que es posible relacionar a los triglicéridos con la patogénesis de la arteriosclerosis
coronaria. Este punto de vista está sustentado por el hecho de que un gran porcentaje
de pacientes con infarto de miocardio también exhiben Hipertrigliceridemia.
Para la determinación de triglicéridos en suero se usará la determinación enzimática de
glicerol a partir de glicéridos.
Los métodos enzimáticos se basan en la determinación del glicerol contenido en las
moléculas de los triglicéridos, tras la hidrólisis (química ò enzimática) para remover los
ácidos grasos. La determinación enzimática del glicerol ha sido usada durante muchos
años; sin embargo, en estos métodos se empleaba la hidrólisis alcalina de los
triglicéridos. El reciente desarrollo del uso de enzimas (lipasa, usualmente combinada
con una proteasa) para catalizar la hidrólisis, ha posibilitado el empleo de métodos
directos, rápidos y específicos. Los sistemas totalmente enzimáticos eliminan el uso de
reactivos cáusticos, extracción con solventes, baños de altas temperaturas y mezclas
de adsorción para la remoción de Fosfolípidos. Estudios recientes se han concentrado
en desarrollar reactivos con lipasas, que hidrolizan completamente los triglicéridos.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO
Se producen reacciones químicas basadas en la determinación química de glicerol a
partir de glicéridos.
La primera etapa consiste en que los triglicéridos son hidrolizados enzimáticamente por
una lipoproteína lipasa específica, produciendo glicerol y ácidos grasos.
Lipoproteína lipasa
Triglicéridos Glicerol + 3 ácidos grasos
En una segunda etapa el glicerol se fosforila a glicerol-1-fosfato en presencia de
glicerolkinasa.
Glycerol kinasa
Glycerol + ATP Glicerol-1-P + ADP
En una tercera etapa el derivado fosforilado se oxida mediante la glicerol fosfato oxidasa
(GPO), con producción de agua oxigenada.
GPO
Glicerol-1-fosfato + O2 H2O2 + dihidroxiacetonafosfato
Finalmente el agua oxigenada así formada produce la unión oxidativa del fenol y la 4-
aminofenazona, en reacción catalizada por la peroxidasa (POD), con formación de una
quinonaimina roja.
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol 4-(p-benzoquinona monoimino) fenazona + 4 H2O
REACTIVOS PROVISTOS:
- Standard: solución acuosa de glicerol equivalente a 200 mg% de
triglicéridos.
- Buffer: solución de buffer conteniendo clorofenol a pH 7,5.
- Enzimas: Viales conteniendo lipoproteína lipasa, glicerol kinasa (GK),
glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP)
y 4-aminofenazona (4-AF).

INSTRUCCIONES DE RECONSTITUCION Y MEZCLADO:
- Standard: listo para usar.
- Reactivo de trabajo:
*5/10 x 20 ml: agregar 20 ml de Buffer a un vial de Enzimas.
Mezclar hasta disolución completa. Homogenizar y fechar.
*4 x 50 ml: reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción
de Buffer y luego transferir al frasco de Buffer enjuagando varias veces.
Homogenizar y fechar.
MATERIAL REQUERIDO:
- Espectrofotómetro.
- Probeta, micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
- Frasco de vidrio color ámbar.
- Cubetas espectrofotométricas.
- Baño de agua a 37ºC.
- Reloj ò timer.
PROCEDIMIENTO:
Homogenizar la muestra antes de usar, especialmente frente a sueros lechosos.
En tres tubos de ensayo marcados B (Blanco), S (Standard) y M (Muestra), colocar:
Reactivo de Trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar.
Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con agua
destilada.
Corregir las lecturas con el blanco y usar las lecturas corregidas para los cálculos.
Para hallar la concentración de triglicéridos en el suero problema, se debe utilizar el
método del factor de calibración.
Triglicéridos (mg%) = M x Fc

El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los
siguientes valores de triglicéridos:
Deseable: < 150 mg%.
Moderadamente elevado a elevado: 150 – 199 mg%.
Elevado: 200 – 499 mg%.
Muy elevado: > 500 mg%.
CUESTIONARIO:
1.- Describa las características principales de los lípidos y su clasificación.
2.- Explique la importancia biológica de los triglicéridos.
3.- Como se produce la digestión y absorción de los triglicéridos.
4.- Mencione la proporción de triglicéridos dentro de las lipoproteínas y la acción de la
lipasa lipoproteíca.
5.- Enumere los diferentes métodos tanto químicos como enzimáticos para el dosaje de
triglicéridos.

PRACTICA Nº 11
MASA PROTEICA VISCERAL Y ESQUELÉTICA
Para evaluar el estado nutricional de una persona utilizamos el metabolismo
proteico (síntesis y degradación).
Las proteínas en el organismo se distribuyen didácticamente en dos
compartimientos:
a) Compartimiento Proteico Visceral.
b) Compartimiento Proteico Somático ò esquelético.
Las proteínas del compartimiento visceral se evalúan mediante los niveles de
Transferrina, Pre-albúmina, Proteínas totales y Albúmina en suero, que por su
relativamente corto tiempo de vida (albúmina es de 20 días) rinde una estimación
razonable del compartimiento proteico visceral. En esta práctica utilizaremos la
Proteína Total y la Albúmina sérica.
Las proteínas del compartimiento somático ò esquelético la evaluaremos mediante
la relación entre la excreción de la Creatinina urinaria en 24 horas y la talla de la
persona, relación que es un fiel índice de la masa muscular esquelética.
Así mismo mediante el Peso y la Talla se evaluará la masa corporal total.

Experimento A: DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES Y
ALBÚMINA EN SUERO
Determinación de Proteínas Totales:
Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino,
para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad
es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.
Determinación de Albúmina:
La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la
Bromo Cresolsulfon Ftaleínas (BCF), en presencia de un exceso de colorante, en medio
tamponado a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto al blanco de
reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.
REACTIVOS:
Reactivo EDTA/Cu: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en NaOH 875 mmol/l y alquil aril poli
éter (AAP).
Reactivo BCF: solución de Bromo Cresolsulfon Ftaleínas (en polioxietilèn lauril éter).
Suero Patrón: solución de albúmina y globulinas en estado nativo con título conocido de
proteínas (Biuret ò Kjeldhal) y albúmina (unión BCF).
MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotómetro.
Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Tubos de ensayo.
Baño María a 37ºC.
Reloj ò timer.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEINAS TOTALES:
Blanco Standard Muestra
Agua destilada 50 uL --- ---
Suero Patrón --- 50 uL ---
Reactivo EDTA/Cu 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar los tubos.
Incubar durante 15 minutos en Baño María a 37ºC.
Leer en espectrofotómetro a 540 nm.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA:
Suero Patrón --- 10 uL ---
Reactivo BCF 3,5 ml 3,5 ml 3,5 ml
Mezclar los tubos.
Mantenerlos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Proteínas totales (g/dl) = M x fc fc = P.T. (g/dl) / S
Albúmina (g/dl) = M x fc fc = Alb. (g/dl) / S
Albúmina (g/dl)
Relación A/G = ---------------------------------------
Prot. Tot. (g/dl) - Alb. (g/dl)
PROTEÍNAS TOTALES: 6,1 a 7,9 g/dl.
ALBÚMINA: 3,5 a 4,8 g/dl.
RELACION A/G: 1,2 a 2,2

Experimento B: DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA
La Creatinina reacciona con el picrato alcalino en medio tamponado, previa
desproteinizaciòn con ácido pícrico, obteniéndose un cromógeno que se mide a 510 nm.
REACTIVOS:
Reactivo 1: ácido pícrico 41,4 mmol/l.
Reactivo 2: buffer glicina/NaOH 1 mol/l, pH final 12,4.
Standard: soluciòn de Creatinina 2 mg%
MATERIAL REQUERIDO:
Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo.
Micro pipetas y pipetas capaces de medir los volúmenes indicados.
Reloj ò timer.
PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Medir la diuresis, tomar una alícuota y efectuar una dilución 1:50 de la misma.
Luego en tres tubos de ensayo preparar lo siguiente:
Standard --- 0,5 ml ---
Orina diluida (1:50) --- --- 0,5 ml
Agua 1 ml 0,5 ml 0,5 ml
Reactivo 1 2 ml 2 ml 2 ml
Reactivo 2 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Mezclar por inversión.
Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
M
Creatinina en orina (mg/24 horas) = ------ x 20 mg/l x 50 x V
S
Siendo:
V = volumen de la diuresis expresado en litros/24 horas.
M = Absorbancia neta del tubo muestra.
S = Absorbancia neta del tubo standard.

900 a 1,500 mg/24 horas.
VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL
PROMEDIO
POBLACIONAL
DESNUTRICIÓN
Relación Cr U 24h / Talla
(mg 24h/m)
Hombres: 830
Mujeres: 680
Hombres: < 660
Mujeres: < 430
Relación Peso / Talla
(Kg/m)
Hombres: 37
Mujeres: 34
Hombres: < 30
Mujeres: < 29
Proteínas totales (g/dl) 7 < 6
Albúmina (g/dl) 4 < 3,5
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en los experimentos, realizar la valoración nutricional de
dicha persona sabiendo que es varón, pesa 60 Kg, su talla es 1,56 m y su volumen
urinario en 24 horas fue de 1000 ml.
2.- Como hubiera sido la valoración nutricional en el caso que la persona hubiera sido
mujer?
3.- Mencione las características generales de las proteínas y su clasificación.
4.- Qué son las globulinas y cuáles son sus clases?
5.- Describa los métodos de dosaje tanto químicos como enzimáticos para proteínas
totales, albúmina, globulina y Creatinina.

PRACTICA N° 12
METABOLISMO DE LA BILIRRUBINA
Base Bioquímica.-
La bilirrubina es un pigmento amarillo , que se produce en el ser humano a
partir del Núcleo HEM ( que es una Protoporfirina Tipo IX ó Tetrapirrol
macrocíclico, molécula que tiene insertado un átomo de Hierro ).Sobre este núcleo
HEM actúa la enzima Oxigenasa Heme de los microsomas. Esta Oxigenasa rompe
el enlace alfa metano del anillo tetrapirrólico y se abre la molécula , convirtiéndose
en el pigmento verde Biliverdina, el cual es subsecuentemente hidrogenado y
forma Bilirrubina .Esta reducción la realiza la enzima citosólica biliverdina
reductasa que es una enzima NADPH dependiente. Por cada mol de HEME
catabolizado por esta ruta se produce un mol de bilirrubina, de CO2 y de ión
férrico. La producción diaria de bilirrubina a partir de todas sus fuentes en el
hombre es de 250 a 350 mg. Aproximadamente el 85% de la bilirrubina total
producida se deriva de la molécula del HEM de la Hb liberada a partir de los
eritrocitos senescentes que son destruidos en el sistema retículo endotelial del
hígado, bazo y médula ósea. El 15% remanente se produce a partir de la
destrucción de las células precursoras de los eritrocitos en la médula ósea (
llamada “eritropoyesis inefectiva”) y también proviene del catabolismo de otras
proteínas que contienen núcleo Hem como la mioglobina, citocromos, peroxidasa
y que están distribuidas a través de todo el organismo.
Después de su producción en los tejidos periféricos, la bilirrubina es transportada
al hígado asociada a la albúmina .La Bilirrubina es rápidamente captada por los
hepatocitos, se transporta y se conjuga al acido glucurónico ( UDP – glucurónico
transferasa) para producir mono y diglucuronato de bilirrubina los cuales se
excretan en la bilis.
y después de ser excretados hacia el intestino delgado . En el tracto intestinal los
glucorónidos de bilirrubina se hidrolizan a la forma no conjugada por el pH al

alcalino del intestino delgado, y por la acción catalítica de la betaglucuronidasa
del hígado, células epiteliales intestinales y las bacterias. La bilirrubina no
conjugada es posteriormente reducida por la flora bacteriana anaeróbica intestinal
para formar un grupo de tres tetrapirroles incoloros colectivamente llamados
Urobilinógeno que luego se reducen y forman tres productos: estercobilinógeno,
mesobilinógeno y urobilinógeno. Hasta el 20% de los urobilinógeno producidos
diariamente son reabsorbidos desde el intestino hacia la circulación para ir al
hígado(Circulación entero. Hepática). La mayor parte del urobilinógeno
reabsorbido es captado por el hígado y es re-excretado en la bilis y solamente un 2
a 5 % entra a la circulación general y aparece en la orina. En la parte mas baja
del tracto intestinal, los tres urobilinógeno se oxidan espontáneamente y
producen los pigmentos estercobilina, mesobilina y urobilina, y así estos pigmentos
adquieren color marrón y que son los pigmentos que le dan color a las heces.
Existen enfermedades congénitas y enfermedades adquiridas que afectan uno ó
mas de los pasos involucrados en la producción, captación, depósito,
metabolismo y excreción de la bilirrubina y la hiperbilirrubinemia es
frecuentemente el resultado de estos trastornos. Esta bilirrubinemia puede ser a
predominio No conjugado (Indirecta) ó Conjugado (Directa) dependiendo del tipo
de desorden.
La hiperbilirrubinemia causa Ictericia. Cuando la cifra de bilirrubina en la sangre
excede de l mg % , existe hiperbilirrubinemia .La hiperbilirrubinemia puede
deberse a la producción de mas bilirrubina de la que el hígado normal puede
excretar o a la insuficiencia de un hígado dañado para excretar la bilirrubina
producida en cantidades normales. Ante la ausencia de daño hepático, la
obstrucción de los conductos excretorios del hígado, previniendo la excreción de la
bilirrubina, también causará hiperbilirrubinemia. En todos estos trastornos, la
bilirrubina se acumula en la sangre y cuando alcanza una cierta concentración(
aproximadamente de 2 a 2. 5 mg%) se difunde dentro de los tejidos los cuales
adquieren color amarillo, este trastorno se denomina ictericia. La concentración de
bilirrubina en el suero es de gran valor, por eso en la presente practica la
emplearemos.

Estado Bilirrubina Sérica
Mg%
Urobilinógeno
Urinario
Bilirrubina
Urinaria
Urobilinógeno
fecal
NORMAL
Ictericia
Hemolítica
Hepatitis
Ictericia
Obstructiva
Conjugada: 0.1 a 0.4
No Conjugada 0.2 a
0.7
Elevación No
Conjugada
Elevaciones de
Ambas, con
predominio.
Conjugada
Elevación de ambas a
predominio
Conjugada
0.a 4 mg/24 hs
Aumentado
Disminuido
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
Presente
40 a 280 mg/
24 hs
Aumentado
Disminuido
Escaso o
ausente
Dentro de las causas de Ictericia Hemolítica tenemos:
Anemias hemolíticas, ictericia fisiológica neonatal (Inmadurez hepática para
captación, conjugación y secreción de la bilirrubina), Síndrome de Crigler-Najar
(Alteración de la conjugación de bilirrubina), Enfermedad de Gilbert,
Hiperbilirrubinemia tóxica (Agentes farmacológicos).
Experimento A: DOSAJE DE BILIRRUBINA SERICA
FUNDAMENTO:
El suero sanguíneo es tratado con el reactivo diazoico (Acido Sulfanílico + Nitrito
de sodio) y se produce un complejo coloreado de color rojo violáceo debido a la
presencia de bilirrubina conjugada al acido glucurónico (Directa) color que
desarrolla directamente.. La Bilirrubina no conjugada (Indirecta) requiere además
la presencia de cafeína ó alcohol metílico para que se desarrolle el color. Entonces
para obtener la producción de color debido a ambas bilirrubinas debemos añadir
cafeína ó metanol y tendremos la producción de un color debido a la suma de
ambas bilirrubinas que llamamos Bilirrubina Total. Estos colores son comparados
espectrofotométricamente con el color producido por una solución standard de
bilirrubina de concentración conocida.

REACTIVOS NECESARIOS:
- Desarrollador: Solución acuosa de Benzoato de Cafeína 0,13 mol/l
tamponada y estabilizada.
- Nitrito de Sodio: Solución de Nitrito de Sodio 0,07 mol/l.
- Reactivo Sulfanílico: Solución de acido Sulfanílico 29 mmol/l y acido
clorhídrico o,17 mol/l
- Bilirrubina Estándar: Para la calibración periódica del equipo.
- Agua Destilada.
INSTRUCCIONES DE USO.-
- Desarrollador: listo para su uso.
- Reactivo Sulfanílico: listo para usar.
- Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar una parte de
nitrito de sodio con 21 partes de reactivo Sulfanílico. Rotular y Fechar
METODOLOGIA.-
Colocar los reactivos en tubos de prueba marcados ,según la siguiente tabla:
Reactivos
Tubo
Blanco
( B )
Tubo
Bilirrubina Directa
( D )
Tubo
Bilirrubina Total
( T )
Tubo
Standard de
Bilirrubina
(mg %)
Muestra (suero) 200 uL 200 uL 200 uL ---
Agua destilada 2,5 ml 2.5 ml --- ---
Desarrollador --- --- 2.5 ml 2,5 ml
Rvo. Sulfanílico 200 uL --- --- ---
Diazorreactivo --- 200 uL 200 uL 200 uL
Standard 200 uL
Mezclar de inmediato, cada tubo por inversión.
Reposo 5 minutos a temperatura ambiente.
Lectura en espectrofotómetro en 530 nanómetros, colocando el espectrofotómetro
en cero de Absorbancia con Agua destilada.
Anotar los resultados de cada lectura.
CALCULOS:
Bilirrubina Total mg% = (T - B) x Factor
Bilirrubina Conjugada (Directa) mg % = (D – B) x Factor
Bilirrubina No Conjugada (Indirecta ó Libre) = (Bilirrubina Total – Bilirrubina
Directa)

- Adultos = Directa: hasta 0.2 mg/%
Total: hasta 1.0 mg/%
- Recién nacidos =
Nacidos a término Prematuros
Sangre de cordón 2.5 mg%
Hasta las 24 horas 6.0 mg% 8.0 mg%
Hasta las 48 horas 7.5 mg% 12.0 mg%
Del 3º al 5º día 12.0 mg% 24.0 mg%
Loa valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del
adulto al mes del nacimiento.
En los prematuros, los niveles de Bilirrubina tardan màs en alcanzar la
normalidad, dependiendo del grado de inmadurez hepàtica
Experimento B: INVESTIGACION DE UROBILINOGENO EN ORINA
El Urobilinógeno se forma en la fase intestinal del metabolismo de la bilirrubina y
se encuentra en todas las orinas normales en muy pequeñas cantidades, menores
de 4 mg / 24 hs. Se forma en el intestino como hemos señalado en las clases
teóricas por la acción de las bacterias sobre los pigmentos biliares excretados por
el hígado. También dijimos que luego que se excreta la bilirrubina conjugada al
conductillo biliar llega al duodeno; la bilirrubina conjugada no es reabsorbida sino
que: o bien se excreta como tal en la heces, o bien se transforma en
UROBILINOGENO (y derivados asociados) por acción de las bacterias del colon. El
urobilinógeno se puede reabsorber en el intestino delgado (Íleon) y en el colon y
pasa a la circulación portal, llega al Hígado y allí se re-excreta a la bilis y el resto
llega al riñón y se excreta con la orina.
Cuando existe una alteración en la captación y excreción hepática de urobilinógeno
( como en la enfermedad hepatocelular) ó la síntesis de bilirrubina como en la
hemólisis, la excreción diaria del urobilinógeno aumentará en forma significativa
Por el contrario, si no pasa bilis al intestino, como en la colostasis u obstrucción
biliar extra hepática interfieren en la fase final del catabolismo de la bilirrubina y
ocasiona un descenso notable en la producción y excreción urinaria del
urobilinógeno. Entonces, la medida del urobilinógeno en la orina resulta muy útil
para diferenciar las posibles causa de hiperbilirrubinemia como ocurre en la
obstrucción completa de los conductos biliares, la urobilina estará ausente en la
orina.

La excreción se incrementará en todas aquellas condiciones en que exista una
excesiva destrucción de los eritrocitos y en aquellos casos de daño parcial del
parénquima hepático. En las nefritis muy avanzadas puede estar ausente la
Urobilina
Fundamento de la prueba de Ehrlich para la investigación de
Urobilinógeno en orina (Método Cualitativo):
Esta prueba se basa en la reacción entre el urobilinógeno y el reactivo de
paradimetil amino benzaldehído, para rendir un complejo coloreado rojo cereza
Reactivo de Ehrlich:
Disolver 10 gm de Paradimetilaminobenzaldehido en una mixtura de 75 ml de
agua y y 75 ml de HCl concentrado.
Procedimiento: A 2 ml de orina en un tubo de prueba , añadirle 0.5 ml del
Reactivo de Ehrlich y mezclar bien. Observar el color de la mixtura.
Interpretación. Cantidades normales de Urobilinógeno en la orina no producirán
color. Cantidades aumentadas(patológicas) del pigmento urobilinógeno producirán
un color rojizo cereza que se observa bien mirando el tubo desde arriba del
tubo(boca del tubo) contra un fondo blanco.
En la actualidad usamos para la investigación de Urobilina en orina el método de
las tiras reactivas que se introducen directamente en la muestra de orina. Estas
cintas están impregnadas en el área correspondiente de una sal de metoxibenceno
diazonio estable que produce con el urobilinógeno, casi instantáneamente un
complejo de color rojo azoico. Se considera normal que en la zona reactiva para
urobilinógeno no se produzca decoloración alguna o que los colores que aparezcan
sean mas claros que los observados para l mg % .Esta prueba es específica para el
urobilinógeno.
CUESTIONARIO:
1.- Explique la formación de la bilirrubina.
2.- En que casos se produce una elevación de la bilirrubina total , tanto a
expensas de la bilirrubina directa como de la indirecta.
3.- Como se forma el urobilinógeno y qué importancia tiene?
4.- Qué es la ictericia y como se evalúa.
5.- Cuáles son los métodos conocidos para el dosaje de bilirrubina

PRACTICA Nº13
TRANSAMINACION
IMPORTANCIA CLINICA:
Las transaminasas son enzimas ampliamente difundidas en el organismo, que
catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, en
una de las más importantes reacciones del metabolismo proteico. El interés clínico
está centrado especialmente en dos de ellas: TGO (transaminasa glutámico
oxalacética) y TGP (transaminasa glutámico pirúvica).
Estas enzimas tienen acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad
sérica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de la actividad será
evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran, de los cuales
resultan particularmente importantes corazón e hígado.
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un
marcado aumento de la actividad de la TGO, debido a la liberación al torrente
sanguíneo de esta enzima, tan abundante en músculo cardíaco.
En este caso no existirá aumento en la actividad sérica de TGP ò será mínimo.
En hepatitis virales y otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis
de tejido, habrá un incremento considerable de la actividad sérica de
transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como ictericia.
En este caso, la TGP será la enzima predominante debida a su gran concentración
en el tejido hepático.
Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en traumas
accidentales o quirúrgicos y en distrofias musculares y miosis.
Una reacción de transaminación consiste en la interconversión de un grupo amino
(NH2-CH-COOH) de un aminoácido, con un grupo cetónicos (O=C-COOH) de un
cetoácido. Este intercambio está catalizado por enzimas conocidas con el nombre
de transaminasas. En el suero humano, por lo general, se determinan dos tipos
principales: la Glutámico Oxalacética (TGO) y Glutámico Pirúvica (TGP).

Ellas catalizan las siguientes reacciones:
TGO
L-aspartato + -cetoglutarato Oxalacetato + glutamato
TGP
L-alanina + -cetoglutarato Piruvato + glutamato
El Oxalacetato y el Piruvato así formados, reaccionan con el reactivo 2,4-
dinitrofenilhidrazina (2,4 – DNFH), generando fenilhidrazonas, las cuales en medio
alcalino (NaOH) producen un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional
a la actividad enzimática de transaminasas en la muestra.
REACTIVOS:
1.- Sustrato TGO:
Solución conteniendo 100 mmol/l de l-aspartato y 2 mmol-l de alfa-
cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
2.- Sustrato TGP:
Solución conteniendo 200 mmol/l de l-alanina y 2 mmol/l de alfa-
Cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mmol/l, pH 7,4.
3.- Reactivo 2,4-DNFH:
Solución conteniendo 1 mmol/l de 2,4-dinitrofenilhidrazina en ácido clorhídrico
1 mmol/l.
Esta solución es corrosiva y debe guardarse en frasco oscuro.
4.- Standard de Calibración:
Solución de Piruvato de sodio 2 mmol/l. Para efectuar la curva de calibración.
Listo para usar en la curva de TGP. Diluir 1:2 con sustrato par la curva de
TGO.
5.- Hidróxido de Sodio Diluyente para Enzimas concentrado:
Solución de hidróxido de sodio 4 mol/l
Antes de usarse, se deberá diluir el contenido de este frasco a 1 litro de agua
destilada para así alcanzar la concentración requerida de NaOH 0.4mol/l.
Es importante notar que el hidróxido de sodio debe conservarse en frasco de
plástico y no de vidrio. Conservar el frasco lejos del reactivo de color pues los
vapores pueden contaminar ambos reactivos.

EXPERIMENTO A
DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS (TGO Y TGP) EN SUERO
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR TGO ò TGP EN SUERO:
Preparar los tubos:
Blanco Muestra
Sustrato (TGO ò TGP) 0.5 ml 0.5 ml
Colocar en Baño María a 37ºC unos minutos y luego agregar:
Muestra (suero) --- 100 Ul
Agua destilada 100 uL ---
Mezclar por agitación suave e incubar exactamente 30 minutos y agregar:
Reactivo 2,4-DNFH 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar. Dejar 10 minutos a 37ºC. Luego agregar:
NaOH 0.4 mol/l 5 ml 5 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño. Después de 2 minutos leer en el
espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a cero de absorbancia con agua
destilada.
NOTA: Para el cálculo de resultados se debe emplear una curva de calibración.

EXPERIMENTO B
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE LA CURVA DE
CALIBRACIÓN
Antes de utilizar por primera vez el juego de reactivos, preparar una curva de
calibración para TGO y otra para TGP, de acuerdo a las siguientes indicaciones:
Pipetear en dos series de tubos:
Tubo Agua
destilada
(ml)
Sustrato
(ml)
Standard de
calibración
(ml)
TGO
(U/l)
TGP
(U/l)
I 0.2 1.00 0.00 0 0
II 0.2 0.95 0.05 7 9
III 0.2 0.90 0.10 12 18
IV 0.2 0.85 0.15 20 25
V 0.2 0.80 0.20 28 37
VI 0.2 0.75 0.25 37 46
VII 0.2 0.70 0.30 48 56
VIII 0.2 0.60 0.40 81 79
IX 0.2 0.50 0.50 --- 113
Nota: Utilizar sustrato TGO para la curva de calibración de TGO y sustrato TGP
para la curva de calibración de TGP, respectivamente.
Mezclar y agregar a cada tubo, 1 ml de reactivo 2,4-DNFH.
Mezclar. Incubar 10 minutos a 37ºC.
Agregar 10 ml de hidróxido de sodio 0.4 mol/l a cada tubo.
Mezclar y esperar 10 minutos a temperatura ambiente antes de leer.
Leer la Transmitancia a 505 nm usando agua destilada como blanco de lectura. El
color es estable durante solo 30 minutos.
Restar a cada lectura la obtenida con el tubo Nº1, obteniéndose las Absorbancias
Netas.
Graficar en papel milimetrado los valores de absorbancias netas en el eje vertical,
y en el eje horizontal las U/l de TGO ó TGP según sea el caso, que se indica en la
tabla superior.
Determinar en el gráfico los puntos correspondientes a cada tubo. Uniéndolos se
obtienen las curvas respectivas para TGO y TGP.
Tener en cuenta que para cada técnica debe utilizarse el gráfico correspondiente.

Se consideran valores normales de transaminasas (TGO y TGP) hasta 12 U/l. Si
bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de
transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse
sospechosos.
CUESTIONARIO:
1.- Explique en que consiste el fenómeno de transaminación y donde se realiza
en el organismo?
2.- Que relación existe entre las transaminasas y las enfermedades hepáticas?
3.- Como se encuentran las transaminasas en el infarto agudo de miocardio?
4.- Señale cuáles son los métodos de análisis conocidos para dosaje de
transaminasas?
5.- Existe variación de transaminasas con la edad?

PRACTICA Nº14
BALANCE NITROGENADO
El objetivo de esta práctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el
Balance Nitrogenado. Explicaremos los parámetros más representativos de la
excreta nitrogenada en general.
Se evalúa los egresos de N mediante el nitrógeno ureico urinario en 24 horas y la
excreción de nitrógeno creatinìnico urinario en 24 horas empleando la formula de
nitrógeno total estimado (NTE), según Ramírez Velazco.
FORMULA: BN = INGESTA N – (NTE + 2)
NTE = N. UREICO + N. CREATININICO
Excreción fecal: 2 gr/24 horas.
N Ingerido: gr de proteínas/6.25
Nota: Si el paciente presenta albuminuria, añadir a la excreta:
Proteína urinaria/6.25
EXPERIMENTO A : DETERMINACIÓN DE CREATININA URINARIA
La Creatinina se forma endógenamente en el metabolismo muscular y es removida
de la sangre por filtración glomerular y excretada en la orina sin ser reabsorbida en
los túbulos. Por lo tanto, es el riñón el que regula, como único órgano excretor, el
nivel de Creatinina en la sangre. Si se restringe la función renal aumenta la
Creatinina en el plasma, proporcionalmente a la lesión orgánica. Un aumento

continuo aunque escaso del nivel de Creatinina en suero debe considerarse como
un signo de pronóstico desfavorable, ya que puede tratarse de una irreparable
restricción de la función renal.
Como se forma en el organismo, los factores exógenos no pueden influir su nivel
sérico. Por este motivo la determinación simultánea de la Creatinina en suero y
orina permite el cálculo del claréense o depuración de Creatinina y representa un
método excelente de la medida de la filtración glomerular.
En un medio alcalino que contiene picrato, la Creatinina presente en la muestra,
reacciona con éste formando un complejo rojizo, cuya mayor absorción se da a
530 nm.
Creatinina + picrato Complejo Creatinina-picrato
REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solución de ácido pícrico 0.05M
Reactivo 2.- Solución de hidróxido de sodio 0.75N
PROCEDIMIENTO:
Recolectar orina de 24 horas.
Diluir la orina completando a 2000 ml con agua destilada.
Nota: Si el volumen de la orina recolectada durante las 24 horas supera los 2000
ml la prueba debe realizarse sin diluirla, pero en el momento de realizar los
cálculos en vez de multiplicar el resultado por 2000, debe multiplicarse por el
volumen total (ml).
Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)
Orina diluida --- --- 0.02
Standard --- 1.0 ---
Agua 2.5 1.5 2.5
Reactivo 1 3.5 3.5 3.5
Reactivo 2 1.0 1.0 1.0
Mezclar bien.
Después de transcurridos 20 minutos leer la absorbancia a una longitud de onda
de 530 nm contra el blanco.

CALCULOS:
Abs muestra
Creatinina en orina (mg/24 h) = ------------------ x 2000
Abs standard
VALORES NORMALES: 500 – 1500 mg/24 h.
Dato: Creatinina x 0.37 = Nitrógeno creatinìnico.
EXPERIMENTO B : DETERMINACIÓN DE UREA URINARIA
El producto final más importante del metabolismo proteico es la UREA. Esta es
excretada en la orina en mayor cantidad que cualquier otra sustancia.
Concentraciones elevadas de urea en sangre son indicador de una inadecuada
función excretora y por consiguiente de la función renal.
La urea sanguínea puede aumentar por otras razones además de excreción renal
insuficiente, dichas causas se clasifican en: Pre-renal, son los estados en los cuales
se altera la circulación por el riñón y Post-renal por obstrucción de las vías
urinarias. Por ello la información más exacta con respecto a la habilidad excretora
de la urea por los riñones requiere de una comparación de la concentración de
urea en sangre (BUN) y en la orina. Fisiológicamente la urea se eleva debido a una
dieta hiperproteica o con la edad y disminuye durante una dieta de bajo valor
proteico.
La urea presente en la muestra es hidrolizada hasta amoníaco y dióxido de
carbono, mediante una reacción catalizada por la enzima ureasa:
Ureasa
Urea + H2O CO2 + 2 NH3
El amoníaco en presencia de una base reacciona con fenol e hipoclorito de sodio
formando azul de indo fenol. La intensidad de color azul es proporcional a la
cantidad de urea en la muestra.
REACTIVOS:
Reactivo 1.- Solución de fenol y nitro prusiato de sodio.
Reactivo 2.- Solución de hipoclorito de sodio en NaOH 0.625N
Enzima.- Solución de ureasa.
PROCEDIMIENTO:
Se diluye la orina a 1:50 con agua destilada.

Blanco (ml) Standard (ml) Muestra (ml)
Standard --- 0.01 ---
Orina diluida --- --- 0.01
Enzima 2 gotas 2 gotas 2 gotas
Mezclar e incubar los tubos en un Baño María a 37°C por 5 minutos.
Asegurarse que los reactivos no se hayan quedado en las paredes de los tubos.
Luego agregar en cada tubo, 1 ml del Reactivo 1, y posteriormente 1 ml del
Reactivo 2.
Mezclar el contenido de los tubos e incubarlos en un baño de agua a 37°C por 5
minutos.
Transcurrido este tiempo agregar 4 ml de agua destilada en cada tubo.
Mezclar los tubos por inversión y proceder a leer la absorbancia en un
espectrofotómetro a 540 nm vs el blanco.
CALCULOS:
Abs muestra
Urea (mg/dl) = --------------------- x 60 x Factor de dilución
Abs standard
Dato: Urea x 0.466 = Nitrógeno ureico.
VALORES NORMALES:
Nitrógeno ureico.- 7 a 14 gr/24 hrs.
Urea.- 15 a 30 gr/24 hrs.
BN = Ingesta nitrogenada – (N ureico + N creatinìnico + 2)
BN = ...................... gr/24 hrs.
CUESTIONARIO:
1.- Con los datos obtenidos en la práctica, calcular el balance nitrogenado del
paciente sabiendo que ingirió 8 gr de proteínas en 24 horas .
2.- De donde proviene la Creatinina?
3.- A que se denomina uremia y que consecuencias trae?
4.- A que se llama BUN y que representa?
5.- Para que sirve la depuración de Creatinina en orina de 24 horas?

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