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Universidad Autónóma de Queretaró
Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto
Reporte de Practica #4:
Pruebas Bioquímicas y
Medios de cultivo 2
Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos
Profesora:
Erika Beatriz Álvarez Hidalgo
Equipo #9:
Alma Marina Peralta Ruiz
Rebeca Alejandra Oloarte Pulido
Juana María López Martínez
16 de octubre del 2013
INTRODUCCIÓN
El metabolismo es toda una serie de reacciones que ocurren en los seres
vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como son: la
composición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la
captación de luz para el caso de los fotótrofos, así como de síntesis de material
celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo).
En el laboratorio es posible conocer las características metabólicas de los
microorganismos, inoculando en diferentes medios de cultivo, con sustratos que
pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes
esenciales para su crecimiento, y dependiendo del desarrollo de dichos
microorganismos se hacen pruebas para observar sus reacciones y así poder
identificar el tipo de microorganismos presente en el medio, estas pruebas se
conocen como pruebas bioquímicas.
Las pruebas bioquímicas que utilizamos para esta práctica fueron:
Indol
Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en
triptófano; después de 24–48 horas de crecimiento se le agrega xilol (un derivado
dimetilado del benceno) al tubo con el caldo para poder separar el indol producido,
después se agita y se le agrega reactivo de Kovacs (alcohol isoamilico, p-
dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado); un resultado positivo
mostrará la formación de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual
pondrá de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilización del triptófano por
el microorganismo (la molécula de tritófano se rompe y uno de esos productos es
el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del
reactivo de Kovacs.
Rojo de metilo
El rojo de metilo es un indicador de pH; actúa entre pH de 4,2 y 6,3
variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar
la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un
carbohidrato. El microorganismo de estudio se cultiva en un caldo de cultivo con
algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa aunque se pueden
utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc., adicionado con el
rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir el cambio del
color del medio a rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la
glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran
cantidad de ácidos orgánicos producidos. Una prueba negativa no cambia el color
del medio (color amarillo)
Voges Proskauer
Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por
descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la
glucólisis). La acetoína es un producto intermedio de la fermentación butilén-
glicólica, que conduce a la formación de 2, 3 butanodiol. Tanto la acetoína como el
2, 3 butanodiol son productos neutros de la fermentación de la glucosa que llevan
el pH del medio a un valor aproximado de 6 o más, y un aumento en la producción
de dióxido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetoína en un
medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxígeno se oxida a
diacetilo; el diacetilo reacciona con compuestos que contengan núcleos de
guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un
compuesto color rojo–rosado–violáceo. Se agrega α-naftol para aumentar la
sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacterias, e
indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica.
Citrato
Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato
como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa
la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el
citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se
hace crecer al microorganismo de estudio en agar citrato. Un resultado positivo es
cuando se observa crecimiento bacteriano; si no se observa crecimiento
bacteriano entonces el resultado es negativo. Actualmente el medio más utilizado
es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual
posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de
crecer, producirá ácidos orgánicos provenientes de la utilización del citrato, el
medio se alcaliniza y el indicador cambia el color del medio a azul, esto será un
resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un
resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá siendo verde.
Oxidasa
El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima
Citocromo C oxidasa. Se trata de una enzima que oxida el citocromo C de la
cadena transportadora de electrones. Este se detecta utilizando el tetra para
fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser
oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando
se oxida se pone púrpura.
Catalasa
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa; el peróxido de
hidrógeno se produce cuando la bacteria utiliza el azúcar por vía oxidativa. Al ser
éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción
de la enzima catalasa (H2O2 → H2O +
1
2
O2).
Termonucleasa
Se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa termoestable
estafilocócica (termonucleasa), es una prueba indirecta de la presencia de
grandes cantidades de Staphylococcus aureus, así como de la posible formación
de enterotoxina estafilocócica. La producción de esta enzima se inhibe en
anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para
su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos
fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 °C
por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus.
Agar TSI
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad
de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único
medio. También permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una
prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia
Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
 bacterias fermentadoras de la glucosa
 bacterias fermentadoras de la lactosa
 bacterias fermentadoras de sacarosa
 bacterias aerogénicas
 bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan
azufre.
Si la bacteria fermenta la glucosa, acidificará el medio cambiando su color a
amarillo mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de
color rojo; si la bacteria fermenta lactosa o sacarosa, acidifica la superficie del
medio volviéndolo color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie permanece
roja; si la bacteria produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de
hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo (la producción de ácido
sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación
de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la
bacteria es fermentadora de glucosa). Si aparece rotura o desplazamiento del
medio, significa que la bacteria es productora de gas.
SIM (Sulfuro – Indol – Motilidad)
El Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres
metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un
compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en
la superficie del medio.
El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se
observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona
de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la
zona inoculada.
Agar Lisina Hierro (LIA)
El LIA es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas:
la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, además de la presencia de sales
de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el
fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo
un cambio del indicador púrpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los
componentes del LIA determina primero una reacción de fermentación,
produciendo acidificación y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable
para la reacción de descarboxilacion que ocurre después, volviendo a su color
violeta original la parte del fondo del tubo.
La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus
y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a
cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno
forma un color violeta rojizo. La producción de H2S se evidencia por la presencia
de un precipitado negro por utilización de las sales de hierro.
Ureasa
Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de
hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta
prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo stuart
está estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8; el microorganismo de
estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el
sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio lo suficiente como para
cambiar el indicador (por encima de 8.0). Un cambio de color a rojo/fucsia indica
que la urea fue hidrolizada por la ureasa del microorganismo, si no cambia de
color entonces la prueba es negativa.
OBJETIVO
Realizar pruebas bioquímicas en medios de cultivo para sustratos
específicos que permitirán identificar bacterias así como demostrar actividades
metabólicas de las mismas.
MATERIALES
Agua peptonada (AP) Agar triple azúcar hierro (TSI) Rojo de metilo
Caldo rojo de metilo – Voges
Proskauer (RM–VP)
Medio SIM Asa de nicromo
Agar citrato (AC) Phenil n–diamina Reactivo de Kovacs
3 Cepas Gram – Peróxido de hidrógeno Matraces Erlenmeyer
3 Cepas Gram + Agitador magnetico Plato caliente
Balanza analítica Gradillas Probeta
Medidor de pH 24 Tubos de ensaye Autoclave
METODOLOGÍA
1. Preparar los medios de cultivo
2. Activar bacterias gram + y gram –
3. Inocular los medios de cultivo
4. Realizar pruebas bioquímicas
5. Analizar resultados
Pasos para preparar los medios líquidos, sólidos y semisólidos:
1.1)Suspender la cantidad necesaria de polvo para preparar el agar específico
en la cantidad de agua que se desee; en el caso del medio Rojo de
Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP) por cada litro de agua se le agregan 7g
de polipeptona, 5g de dextrosa (glucosa), y 5g de fosfato de potasio
K2HPO4 (buffer)
1.2)Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en el rango
permitido
1.3)Calentar con agitación frecuente
1.4)Hervir durante un minuto hasta disolución completa
1.5)Vaciar de 3 a 5 ml del medio de cultivo en tubos con tapa de rosca con
ayuda de una micropipeta
1.6)Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos, reservar para su uso
futuro en el caso de los medios sólidos; solidificar inclinado para formar un
pico en el caso de los medios sólidos.
PASOS PARA REALIZAR LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS:
INDOL
Inocular el agua peptonada, incubar a 37 °C por 48 horas; añadir unas
gotas de reactivo de Kovacs, agitar bien y dejar reposar el cultivo. El HCl
proporciona el pH ácido que requiere la reacción; el alcohol amílico es
insoluble en agua y menos denso. Observar un anillo rosa–rojizo en la
superficie
ROJO DE METILO
Se inocula el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48
horas, luego de terminado el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del
reactivo de rojo de metilo sin agitar.
VOGES PROSKAUER
Se inocular el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48
horas, luego se añaden unas gotas de alfa–naftol (0.6ml), se agita y se le
añade KOH (0.2ml) se agita nueva menta y se deja reposar. Observar
coloración roja.
CITRATO
Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola estría en la
superficie, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas y se realiza la lectura de
la prueba.
OXIDASA
Poner un trozo de papel filtro sobre una de las tapaderas de una caja de
Petri, añadir una gota del reactivo de oxidasa; depositar sobre el reactivo
masa bacteriana de forma rápida con ayuda de un palillo estéril o un asa de
platino nueva. Detectar un color azul – violeta intenso antes de 10
segundos.
CATALASA
Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de
una pipeta Pasteur, inocular y detectar la formación de burbujas.
TERMONUCLEASA
Se inoculan los tubos de caldo BHI (infusión cerebro corazón) y se incuban
a 37 °C por 24 horas, después se toman 5 µl de caldo inoculado y se llenan
los orificios respectivos de una lámina cubierta con medio TDA (contiene:
0.3g ADN, 10g Agar, 1 ml de solución de cloruro de calcio, 10g cloruro de
sodio, 3ml solución azul de toluidina y 1L de buffer tris), se incuba a 37 °C
por 1 a 4 horas. Un resultado positivo para termonucleasa se da por un halo
rosa alrededor de los orificios donde se puso el caldo BHI
TSI
Se inoculan los tubos de TSI con asa recta, se introduce el asa hasta 3 a 5
mm del fondo del tubo, luego de retirar el asa del fondo, se estría el pico
con un movimiento en zigzag, de un lado a otro; se incuba a 35 – 37 °C
durante 24 horas. Observar: amarillo = acidez (lactosa en superficie,
glucosa en el fondo), rosa = alcalinidad, negro = SH2, fractura o
desplazamiento del medio = gases
SIM
Los tubos con medio SIM se inoculan por picadura (asa recta), se incuban a
35 – 37 °C durante 24 horas. Se observa turbidez o en su defecto
crecimiento bacteriano sólo en el área en donde se inoculó
UREASA
Se siembra el microorganismo en un caldo urea o agar urea de
Christensen, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas.
LIA (AGAR LISINA HIERRO):
Se cultiva el microorganismo en agar LIA, se inocula en forma de estría y se
incuba a 37 °C por 24 horas. Se observa: color azul (hay movilidad), rojo
(no hay movilidad), enegrecimiento (descarboxila ornitina), ruptura de agar
(no descarboxila), fondo amarillo y superficie púrpura (descarboxilación de
lisina)
Diagrama de flujo para pruebas bioquímicas
Inicio
Prueba
Preparar medios de cultivo
IncubarIndol
TSI
LIA
SIM
Citrato
Oxidasa
Catalasa
VP
RM
Termo
nucleasa
Añadir reactivo de Kovacs
Observar movilidad
Añadir alfa naftol y KOH,
dejar reposar
Añadir una gota de reactivo
de oxidasa a un papel filtro
Inocular
IncubarInocular
IncubarInocular
IncubarInocular
IncubarInocular
IncubarInocular
IncubarInocular
IncubarInocular
Añadir reactivo de rojo de
metilo sin agitar
Interpretar
resultados
Con ayuda de un palillo
estéril, inocular el papel
Añadir una gota de agua
oxigenada en un portaobjetos
Agregar el microorganismo
con ayuda de un asa
Poner en los orificios de
una lámina de medio TDA
Incubar
Fin
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
Si
RESULTADOS
MEDIO DE
CULTIVO
COMPOSICIÓN PROCEDIMIENTO
RESULTADOS EN PRUEBAS
BIOQUÍMICAS
Agua
Peptonada
(AP)
10g Peptona de carne
5g Cloruro de sodio
pH final 7.2±0.2
Suspender 15 g de polvo en
1 litro de agua destilada.
Mezclar bien y distribuir.
Esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos.
Positivo: color rojo o rojo-violeta en la
superficie de la capa de alcohol en el
cultivo
Negativo: color amarillo
Caldo Rojo
de
Metilo/Voges
Proskauer
(RM/VP)
7g Polipeptona
5g Glucosa
5g Fosfato dipotásico
pH final 6.9±0.2
Suspender 17 g del polvo por
litro de agua destilada.
Calentar suavemente
agitando hasta disolver.
Distribuir y esterilizar en
autoclave a 118-121°C
durante 15 minutos.
Prueba del rojo de metilo:
Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.
Prueba de Voges Proskauer:
Positivo: desarrollo de un color rojo en
pocos minutos después de una
completa agitación del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.
Agar Citrato
(AC)
2g Citrato de sodio
5g Cloruro de sodio
1g Fosfato dipotásico
1g Fosfato monoamónico
0.2g Sulfato de magnesio
0.08g Azul de bromotimol
15g Agar
pH final 6.9±0.2
Suspender 24,2 g del medio
deshidratado por litro de
agua destilada. Dejar
reposar 5 minutos y mezclar
calentando a ebullición
durante 1 o 2 minutos.
Distribuir en tubos y
esterilizar en autoclave a
121°C durante 15 minutos.
Enfriar en posición inclinada.
Positivo: crecimiento y color azul en el
pico, alcalinidad.
Negativo: el medio permanece de
color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio
de color.
Agar Triple
azúcar hierro
(TSI)
3g Extracto de carne
20g Pluripeptona
5g Cloruro de sodio
10g Lactosa
10g Sacarosa
1g Glucosa
0.2g Sulfato de hierro y
amonio
0.2g Tiosulfato de sodio
0.025g Rojo de fenol
13g Agar
pH final 7.3±0.2
Suspender 62,5 g del polvo
por litro de agua destilada.
Mezclar bien y calentar con
agitación frecuente, hervir 1
o 2 minutos hasta disolución
total. Llenar hasta la tercera
parte de los tubos de
ensayo. Esterilizar a 121°C
por 15 minutos. Enfriar en
pico de flauta profundo.
Pico alcalino/fondo ácido (pico
rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
Pico ácido/fondo ácido (pico
amarillo/fondo amarillo): el
microorganismo fermenta glucosa,
lactosa y/o sacarosa.
Pico alcalino/fondo alcalino (pico
rojo/fondo rojo): el microorganismo es
no fermentador de azúcares.
La presencia de burbujas, o ruptura
del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
El ennegrecimiento del medio indica
que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico
Caldo BHI
200g Infusión de cerebro
de ternera
250g Infusión corazón
vacuno
10g Peptona
5g Cloruro de sodio
2g Glucosa
2.5g Fosfato disódico
15g Agar
pH final 7.4±0.2
Disolver 52 g de polvo en
un litro de agua destilada.
Calentar a ebullición hasta
su disolución total. Esterilizar
en autoclave durante 15
minutos a 121°C.
Termonucleasa positivo: color rosa
alrededor de los orificios de la lámina
TDA
Termonucleasa negativo: lamina TDA
color azul sin cambio alguno.
NO. DE
COLONIA
PROCEDENCIA GRAM AP RM VP CITRATO TSI SIM OXIDASA CATALASA
Rebeca
#3
Tierra G– – – + +
Glucosa +
Lactosa +
H2S –
– +
Rebeca
#8
Agua de tortuga G+ – +
Marina
#5
Tierra G– + + – –
Glucosa +
Lactosa +
H2S –
– +
Marina
#7
Agua de tortuga G+ – –
Juana
#2
Agua de tortuga G– – – – –
Glucosa –
Lactosa –
H2S –
+ +
Juana
#8
Tierra G+ + +
REFERENCIA AP RM VP CITRATO
E. Coli + + – –
REFERENCIA AP CITRATO TSI UREA LIA
Salmonella – +
Glucosa +
Lactosa –
H2S +
–
DL +
H2S +
REFERENCIA TSI OXIDASA
Pseudomonas
Glucosa –
Lactosa –
H2S –
+
REFERENCIA AP RM VP CITRATO TSI SIM COAGULASA CATALASA
S. Aureus S. Aureus+
S. epidermidis –
+
REFERENCIA CATALASA
Bacillus
Bacillus +
Clostridium –
DISCUSION DE RESULTADOS
De acuerdo a nuestros resultados se observa que probablemente la colonia
#5 de Marina sea E. Coli ya que comparándola con las cepas de referencia,
coincide en las 4 pruebas.
Por otro lado el cultivo 2 de Juana coincide con la cepa de referencia para
pseudomonas, por este motivo posterior a las pruebas bioquímicas se procedio a
cultivar este microorganismo en agar pseudomonas en el cual no presento
fluorescencia por lo que nos da a entender que si bien este microorganismo es
una pseudomona, no produce fluorescencia, investigando al respecto
encontramos la siguiente tabla:
Por tanto la cepa de pseudomonas que encontramos no es pseudomonas
aeruginosa, fluorescens o putida pero sí puede ser alguna de las otras que no
presentan fluorescencia.
Otro resultado interesante que obtuvimos fue de la colonia #7 de Marina la
cual mostro un resultado negativo para la prueba de catalasa por lo tanto es
probable que se trate de un clostridium.
La colonia #3 de rebeca dio resultado positivo para la prueba de citrato;
entre las bacterias que dan citrato positivo están la Klebsiella, Salmonella,
Serratia, entre otras, por lo que las bacterias que son citrato negativas quedan
descartadas entre ellas la shigella y escherichia.
CONCLUSIÓN
Las pruebas bioquímicas son de gran importancia en la identificación de
bacterias ya que los tipos distintos de microorganismos tienen diferentes
CEPA
CRECIMIENTO EN AGAR
PSEUDOMONAS
PRODUCCION DE
FLUORESCEÍNA
PRODUCCION DE
PIOCIANINA
P. aeruginosa Bueno + +
P. fluorescens Bueno + –
P. putida Bueno + –
P. mallei Bueno – –
P. stutzeri Bueno – –
S. maltophilia Bueno – –
B. cepacia Bueno – –
Escherichia coli Bueno – –
características en su metabolismo así como en la actividad enzimática que
desarrollan.
Es importante activar nuestras cepas previa realización de pruebas
bioquímicas para de esta forma tener un cultivo fresco, esto va a reducir las
alteraciones posibles que pudiera llegar a tener nuestro cultivo.
Algunas pruebas bioquímicas nos facilitan la identificación bacteriana más
que otras, por ejemplo en la prueba de citrato, el agar tiene un colorante que nos
permitirá detectar si las bacterias utilizan el citrato como única fuente de energía,
por lo que solamente necesitas sembrar tu microorganismo y no requieres de
agregar ninguna solución de reacción
Algunas pruebas como la termonucleasa necesitan de una segunda
incubación ya que requieren de calor para poder reaccionar
Las especies de pseudomonas son típicamente oxidasa positivas con
ausencia de gas a partir de glucosa, son negativas para la prueba de indol, rojo de
metilo y Voges Proskauer; también son generalmente móviles gracias a la
presencia de 1 o más flagelos polares que poseen. Las pseudomonas pueden ser
patógenas para los humanos, un ejemplo de esto es la P. aeruginosa que afecta
vías respiratorias.
BIBLIOGRAFÍA
Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack
Parker – Editorial Pearson
Manual de Medios de Cultivos – Editorial E. MERCK, 1990
Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica –
Jean F. Mac Faddin, Irma Lorenzo trad. Editorial Médica Panaméricana

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Pruebas bioquímicas

  • 1. Universidad Autónóma de Queretaró Licenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto Reporte de Practica #4: Pruebas Bioquímicas y Medios de cultivo 2 Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos Profesora: Erika Beatriz Álvarez Hidalgo Equipo #9: Alma Marina Peralta Ruiz Rebeca Alejandra Oloarte Pulido Juana María López Martínez
  • 2. 16 de octubre del 2013 INTRODUCCIÓN El metabolismo es toda una serie de reacciones que ocurren en los seres vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obtención de energía como son: la composición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). En el laboratorio es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos, inoculando en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de carbono y de otros nutrientes esenciales para su crecimiento, y dependiendo del desarrollo de dichos microorganismos se hacen pruebas para observar sus reacciones y así poder identificar el tipo de microorganismos presente en el medio, estas pruebas se conocen como pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas que utilizamos para esta práctica fueron: Indol Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en triptófano; después de 24–48 horas de crecimiento se le agrega xilol (un derivado dimetilado del benceno) al tubo con el caldo para poder separar el indol producido, después se agita y se le agrega reactivo de Kovacs (alcohol isoamilico, p- dimetilaminobenzaldehído y ácido clorhídrico concentrado); un resultado positivo mostrará la formación de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondrá de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilización del triptófano por el microorganismo (la molécula de tritófano se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs. Rojo de metilo El rojo de metilo es un indicador de pH; actúa entre pH de 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formación de ácidos orgánicos que se producen durante la fermentación de un
  • 3. carbohidrato. El microorganismo de estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algún carbohidrato fermentable, el más común es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc., adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una reacción positiva, es decir el cambio del color del medio a rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentación de la glucosa por la vía ácido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de ácidos orgánicos producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo) Voges Proskauer Algunos microorganismos producen acetoína o acetil metil carbinol por descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico (producto final de la glucólisis). La acetoína es un producto intermedio de la fermentación butilén- glicólica, que conduce a la formación de 2, 3 butanodiol. Tanto la acetoína como el 2, 3 butanodiol son productos neutros de la fermentación de la glucosa que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6 o más, y un aumento en la producción de dióxido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetoína en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxígeno se oxida a diacetilo; el diacetilo reacciona con compuestos que contengan núcleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo–rosado–violáceo. Se agrega α-naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacterias, e indicará que la glucosa es fermentada por la vía butanodiólica. Citrato Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como única fuente de carbono debido a la síntesis de la enzima citrato permeasa
  • 4. la cual permite la introducción del citrato al interior de la célula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los ácidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo de estudio en agar citrato. Un resultado positivo es cuando se observa crecimiento bacteriano; si no se observa crecimiento bacteriano entonces el resultado es negativo. Actualmente el medio más utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio sólido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producirá ácidos orgánicos provenientes de la utilización del citrato, el medio se alcaliniza y el indicador cambia el color del medio a azul, esto será un resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habrá crecimiento y el color seguirá siendo verde. Oxidasa El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de una enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de electrones. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida se pone púrpura.
  • 5. Catalasa El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa; el peróxido de hidrógeno se produce cuando la bacteria utiliza el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 → H2O + 1 2 O2). Termonucleasa Se utiliza para detectar la presencia de desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa), es una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus, así como de la posible formación de enterotoxina estafilocócica. La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 °C por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus. Agar TSI El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:  bacterias fermentadoras de la glucosa  bacterias fermentadoras de la lactosa  bacterias fermentadoras de sacarosa  bacterias aerogénicas  bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.
  • 6. Si la bacteria fermenta la glucosa, acidificará el medio cambiando su color a amarillo mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecerá de color rojo; si la bacteria fermenta lactosa o sacarosa, acidifica la superficie del medio volviéndolo color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie permanece roja; si la bacteria produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo (la producción de ácido sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa). Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. SIM (Sulfuro – Indol – Motilidad) El Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en la superficie del medio. El medio de cultivo tiene consistencia semisólida por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo, más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en la zona inoculada.
  • 7. Agar Lisina Hierro (LIA) El LIA es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina descarboxilasa y la lisina desaminasa, además de la presencia de sales de hierro sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos. La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio produciendo un cambio del indicador púrpura de bromocresol. La presencia de glucosa en los componentes del LIA determina primero una reacción de fermentación, produciendo acidificación y cambio de color del medio a amarillo y el pH favorable para la reacción de descarboxilacion que ocurre después, volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo. La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus y Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de oxigeno forma un color violeta rojizo. La producción de H2S se evidencia por la presencia de un precipitado negro por utilización de las sales de hierro. Ureasa Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo stuart está estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8; el microorganismo de estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio lo suficiente como para cambiar el indicador (por encima de 8.0). Un cambio de color a rojo/fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa del microorganismo, si no cambia de color entonces la prueba es negativa.
  • 8. OBJETIVO Realizar pruebas bioquímicas en medios de cultivo para sustratos específicos que permitirán identificar bacterias así como demostrar actividades metabólicas de las mismas. MATERIALES Agua peptonada (AP) Agar triple azúcar hierro (TSI) Rojo de metilo Caldo rojo de metilo – Voges Proskauer (RM–VP) Medio SIM Asa de nicromo Agar citrato (AC) Phenil n–diamina Reactivo de Kovacs 3 Cepas Gram – Peróxido de hidrógeno Matraces Erlenmeyer 3 Cepas Gram + Agitador magnetico Plato caliente Balanza analítica Gradillas Probeta Medidor de pH 24 Tubos de ensaye Autoclave METODOLOGÍA 1. Preparar los medios de cultivo 2. Activar bacterias gram + y gram – 3. Inocular los medios de cultivo 4. Realizar pruebas bioquímicas 5. Analizar resultados Pasos para preparar los medios líquidos, sólidos y semisólidos: 1.1)Suspender la cantidad necesaria de polvo para preparar el agar específico en la cantidad de agua que se desee; en el caso del medio Rojo de Metilo/Voges-Proskauer (RM/VP) por cada litro de agua se le agregan 7g de polipeptona, 5g de dextrosa (glucosa), y 5g de fosfato de potasio K2HPO4 (buffer) 1.2)Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en el rango permitido 1.3)Calentar con agitación frecuente 1.4)Hervir durante un minuto hasta disolución completa 1.5)Vaciar de 3 a 5 ml del medio de cultivo en tubos con tapa de rosca con ayuda de una micropipeta
  • 9. 1.6)Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos, reservar para su uso futuro en el caso de los medios sólidos; solidificar inclinado para formar un pico en el caso de los medios sólidos. PASOS PARA REALIZAR LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS: INDOL Inocular el agua peptonada, incubar a 37 °C por 48 horas; añadir unas gotas de reactivo de Kovacs, agitar bien y dejar reposar el cultivo. El HCl proporciona el pH ácido que requiere la reacción; el alcohol amílico es insoluble en agua y menos denso. Observar un anillo rosa–rojizo en la superficie ROJO DE METILO Se inocula el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48 horas, luego de terminado el tiempo de incubación se añaden 5 gotas del reactivo de rojo de metilo sin agitar. VOGES PROSKAUER Se inocular el medio de cultivo RM/VP, se incuba a 35 – 37 °C durante 48 horas, luego se añaden unas gotas de alfa–naftol (0.6ml), se agita y se le añade KOH (0.2ml) se agita nueva menta y se deja reposar. Observar coloración roja. CITRATO Se inocula el agar de superficie inclinada con una sola estría en la superficie, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas y se realiza la lectura de la prueba. OXIDASA Poner un trozo de papel filtro sobre una de las tapaderas de una caja de Petri, añadir una gota del reactivo de oxidasa; depositar sobre el reactivo masa bacteriana de forma rápida con ayuda de un palillo estéril o un asa de platino nueva. Detectar un color azul – violeta intenso antes de 10 segundos.
  • 10. CATALASA Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur, inocular y detectar la formación de burbujas. TERMONUCLEASA Se inoculan los tubos de caldo BHI (infusión cerebro corazón) y se incuban a 37 °C por 24 horas, después se toman 5 µl de caldo inoculado y se llenan los orificios respectivos de una lámina cubierta con medio TDA (contiene: 0.3g ADN, 10g Agar, 1 ml de solución de cloruro de calcio, 10g cloruro de sodio, 3ml solución azul de toluidina y 1L de buffer tris), se incuba a 37 °C por 1 a 4 horas. Un resultado positivo para termonucleasa se da por un halo rosa alrededor de los orificios donde se puso el caldo BHI TSI Se inoculan los tubos de TSI con asa recta, se introduce el asa hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo, luego de retirar el asa del fondo, se estría el pico con un movimiento en zigzag, de un lado a otro; se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas. Observar: amarillo = acidez (lactosa en superficie, glucosa en el fondo), rosa = alcalinidad, negro = SH2, fractura o desplazamiento del medio = gases SIM Los tubos con medio SIM se inoculan por picadura (asa recta), se incuban a 35 – 37 °C durante 24 horas. Se observa turbidez o en su defecto crecimiento bacteriano sólo en el área en donde se inoculó UREASA Se siembra el microorganismo en un caldo urea o agar urea de Christensen, se incuba a 35 – 37 °C durante 24 horas. LIA (AGAR LISINA HIERRO): Se cultiva el microorganismo en agar LIA, se inocula en forma de estría y se incuba a 37 °C por 24 horas. Se observa: color azul (hay movilidad), rojo (no hay movilidad), enegrecimiento (descarboxila ornitina), ruptura de agar (no descarboxila), fondo amarillo y superficie púrpura (descarboxilación de lisina)
  • 11. Diagrama de flujo para pruebas bioquímicas Inicio Prueba Preparar medios de cultivo IncubarIndol TSI LIA SIM Citrato Oxidasa Catalasa VP RM Termo nucleasa Añadir reactivo de Kovacs Observar movilidad Añadir alfa naftol y KOH, dejar reposar Añadir una gota de reactivo de oxidasa a un papel filtro Inocular IncubarInocular IncubarInocular IncubarInocular IncubarInocular IncubarInocular IncubarInocular IncubarInocular Añadir reactivo de rojo de metilo sin agitar Interpretar resultados Con ayuda de un palillo estéril, inocular el papel Añadir una gota de agua oxigenada en un portaobjetos Agregar el microorganismo con ayuda de un asa Poner en los orificios de una lámina de medio TDA Incubar Fin No No No No No No No No No Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si
  • 12. RESULTADOS MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIÓN PROCEDIMIENTO RESULTADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS Agua Peptonada (AP) 10g Peptona de carne 5g Cloruro de sodio pH final 7.2±0.2 Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Positivo: color rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo Negativo: color amarillo Caldo Rojo de Metilo/Voges Proskauer (RM/VP) 7g Polipeptona 5g Glucosa 5g Fosfato dipotásico pH final 6.9±0.2 Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos. Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo. Negativo: color amarillo. Prueba de Voges Proskauer: Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de una completa agitación del tubo. Negativo: ausencia de color rojo. Agar Citrato (AC) 2g Citrato de sodio 5g Cloruro de sodio 1g Fosfato dipotásico 1g Fosfato monoamónico 0.2g Sulfato de magnesio 0.08g Azul de bromotimol 15g Agar pH final 6.9±0.2 Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada. Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Agar Triple azúcar hierro (TSI) 3g Extracto de carne 20g Pluripeptona 5g Cloruro de sodio 10g Lactosa 10g Sacarosa 1g Glucosa 0.2g Sulfato de hierro y amonio 0.2g Tiosulfato de sodio 0.025g Rojo de fenol 13g Agar pH final 7.3±0.2 Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo. Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico Caldo BHI 200g Infusión de cerebro de ternera 250g Infusión corazón vacuno 10g Peptona 5g Cloruro de sodio 2g Glucosa 2.5g Fosfato disódico 15g Agar pH final 7.4±0.2 Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta su disolución total. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Termonucleasa positivo: color rosa alrededor de los orificios de la lámina TDA Termonucleasa negativo: lamina TDA color azul sin cambio alguno.
  • 13. NO. DE COLONIA PROCEDENCIA GRAM AP RM VP CITRATO TSI SIM OXIDASA CATALASA Rebeca #3 Tierra G– – – + + Glucosa + Lactosa + H2S – – + Rebeca #8 Agua de tortuga G+ – + Marina #5 Tierra G– + + – – Glucosa + Lactosa + H2S – – + Marina #7 Agua de tortuga G+ – – Juana #2 Agua de tortuga G– – – – – Glucosa – Lactosa – H2S – + + Juana #8 Tierra G+ + + REFERENCIA AP RM VP CITRATO E. Coli + + – – REFERENCIA AP CITRATO TSI UREA LIA Salmonella – + Glucosa + Lactosa – H2S + – DL + H2S + REFERENCIA TSI OXIDASA Pseudomonas Glucosa – Lactosa – H2S – + REFERENCIA AP RM VP CITRATO TSI SIM COAGULASA CATALASA S. Aureus S. Aureus+ S. epidermidis – + REFERENCIA CATALASA Bacillus Bacillus + Clostridium –
  • 14. DISCUSION DE RESULTADOS De acuerdo a nuestros resultados se observa que probablemente la colonia #5 de Marina sea E. Coli ya que comparándola con las cepas de referencia, coincide en las 4 pruebas. Por otro lado el cultivo 2 de Juana coincide con la cepa de referencia para pseudomonas, por este motivo posterior a las pruebas bioquímicas se procedio a cultivar este microorganismo en agar pseudomonas en el cual no presento fluorescencia por lo que nos da a entender que si bien este microorganismo es una pseudomona, no produce fluorescencia, investigando al respecto encontramos la siguiente tabla: Por tanto la cepa de pseudomonas que encontramos no es pseudomonas aeruginosa, fluorescens o putida pero sí puede ser alguna de las otras que no presentan fluorescencia. Otro resultado interesante que obtuvimos fue de la colonia #7 de Marina la cual mostro un resultado negativo para la prueba de catalasa por lo tanto es probable que se trate de un clostridium. La colonia #3 de rebeca dio resultado positivo para la prueba de citrato; entre las bacterias que dan citrato positivo están la Klebsiella, Salmonella, Serratia, entre otras, por lo que las bacterias que son citrato negativas quedan descartadas entre ellas la shigella y escherichia. CONCLUSIÓN Las pruebas bioquímicas son de gran importancia en la identificación de bacterias ya que los tipos distintos de microorganismos tienen diferentes CEPA CRECIMIENTO EN AGAR PSEUDOMONAS PRODUCCION DE FLUORESCEÍNA PRODUCCION DE PIOCIANINA P. aeruginosa Bueno + + P. fluorescens Bueno + – P. putida Bueno + – P. mallei Bueno – – P. stutzeri Bueno – – S. maltophilia Bueno – – B. cepacia Bueno – – Escherichia coli Bueno – –
  • 15. características en su metabolismo así como en la actividad enzimática que desarrollan. Es importante activar nuestras cepas previa realización de pruebas bioquímicas para de esta forma tener un cultivo fresco, esto va a reducir las alteraciones posibles que pudiera llegar a tener nuestro cultivo. Algunas pruebas bioquímicas nos facilitan la identificación bacteriana más que otras, por ejemplo en la prueba de citrato, el agar tiene un colorante que nos permitirá detectar si las bacterias utilizan el citrato como única fuente de energía, por lo que solamente necesitas sembrar tu microorganismo y no requieres de agregar ninguna solución de reacción Algunas pruebas como la termonucleasa necesitan de una segunda incubación ya que requieren de calor para poder reaccionar Las especies de pseudomonas son típicamente oxidasa positivas con ausencia de gas a partir de glucosa, son negativas para la prueba de indol, rojo de metilo y Voges Proskauer; también son generalmente móviles gracias a la presencia de 1 o más flagelos polares que poseen. Las pseudomonas pueden ser patógenas para los humanos, un ejemplo de esto es la P. aeruginosa que afecta vías respiratorias. BIBLIOGRAFÍA Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson Manual de Medios de Cultivos – Editorial E. MERCK, 1990 Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica – Jean F. Mac Faddin, Irma Lorenzo trad. Editorial Médica Panaméricana