El documento describe métodos para medir la concentración de proteínas, incluyendo espectrofotometría y curvas de calibración. Explica cómo construir una curva estándar midiendo la absorbancia de muestras con concentraciones conocidas de proteína y usarla para determinar la concentración de proteínas en muestras problema. También compara métodos como Biuret, Lowry, Bradford y absorbancia a 280 nm, discutiendo sus ventajas y desventajas.

1. Espectrofotometría y curva estandar
Objetivos
-Medir la concentración de pro-
teina en una muestra
-Conocer el manejo de los equi-
pos que se usarán
-Construir curvas de calibración
y comprender su importancia

2. Utilizamos los métodos espectrofotométri-
cos para medir la concentración de
proteína(s) en una muestra problema
Según la región del espectro absorbida,
puede ser:
-Visible (colorimetría)
-UV (ultravioleta)

3. ESPECTROFOTÓMETRO
Color Longitud de onda(nm)
Violeta 380-430
Azul 430-500
Cian 500-520
Verde 520-565
Amarillo 565-590
Naranja 590-625
Rojo 590-740

4. Ley de Beer & Lambert
Establece que la absorbancia es proporcional al
número de moléculas absorbentes
A = ε·c·l
A = absobancia
c= concentración
C
l=longitud de la celda
ε= coeficiente de extinción o absortividad
molar

5. Coeficiente de extinción
o absortividad molar
Es una propiedad intrínseca de los compuestos. Es una medida de
absorción de las sustancias a una determinada longitud de onda
Unidades: ε[=]M-1cm-1
F o Phe 260nm W o Trp 295 nm
Y o Tir 275nm

7. Determinación de la
concentración de proteína
Métodos para determinar la concentración
de proteína en una muestra problema
-Absorbancia a 280 nm
-Reacción del Biuret
- Método de Lowry
- Método de Bradford

8. Método de absorbancia a 280nm
-Absorción de los residuos
de tirosilo y triptofanilo
-Se lee a 280nm
-Sensibilidad:
0.05-2.0mg(prot)/ml
-Método no destructivo.

9. Método Biuret
-Formación del complejo
(violeta-prupura)
Cu-Proteína ---------->
-Condiciónes alcalinas
-Se lee a 540 nm
-Sensibilidad:
1.0-6.0 mg(prot)/ml.

10. Método Lowry
--El complejo proteína-Cu (reacción de Biuret) se hace
reaccionar con el reactivo de Folin-Ciocalteu o
-Reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico
(incrementa la intensidad del color azul)
-Se lee a 750 nm
-Sensibilidad:
0.1-2.0 ug(prot)/ml

11. Método
Bradford
-Unión del colorante azul
de Coomasie a proteína
-Condiciones de reacción
fuertemente ácidas
-Se lee a 595nm
-Sensibilidad:
1.0-10.0 ug (prot)/ml

12. Método Ventajas Desventajas
Alta especificidad por
proteínas
Biuret Poco sensible
Pocas interferencias
Barato
Distintas proteínas reaccionan
Mayor sensibilidad que diferente
Lowry
Biuret
Interferencia con sulfato de amonio
Bradford Muy sensible Interferencia con detergentes
Directo Interferencia con ácidos nucléicos
A 280nm
No se pierde la muestra t1/2 (lámpara UV) 1000h/hombre

13. Curva Patrón
Es un gráfico que permite
conocer la cantidad de proteí-
na en muestras problema a
partir de concentraciones co-
nocidas de proteína, utilizan-
do la ecuación de la recta o
interpolando las absorban-
cias obtenidas

14. Determinación de proteínas por absor-
bancia a 280 ηm
1. Rotular los tubos de microfuga
2. Añadir los volúmenes del estándar de BSA que se indican en la tabla y
completar con agua.
3. Encender el espectrofotómetro por lo menos 15 minutos antes de la
determinación y
seleccionar la λ de 280 ηm.
4. Utilizar celda de cuarzo para realizar las mediciones.
5. Ajustar el espectrofotómetro a cero con agua.
6. Realizar las lecturas.
7. Llenar la tabla con los datos de absorbancia.
8. Calcular la concentración de proteína de acuerdo al volumen añadido de
la
solución estándar.