Este documento describe diferentes técnicas inmunológicas como la electroforesis, la inmunodifusión de Ouchterlony, ELISA e inmunoquimioluminiscencia. Explica sus principios, aplicaciones clínicas y variantes como ELISA directo, indirecto, competitivo y de sándwich. Además, provee contexto histórico sobre el desarrollo de estas técnicas y ejemplos de su uso para detección de antígenos y anticuerpos de enfermedades como VIH y Alzheimer.

1. “Técnicas de difusión en gel y electroforesis.
Inmunoensayo de ligandos”
Inmunología Clínica
UNIVERSIDAD DE SONORA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS
DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
Hermosillo, Sonora a lunes 05 de octubre del 2020

2. Técnicas de difusión en
gel
y
electroforesis

3. Introducción.
Contexto histórico
● Siglo XIX: Primeros trabajos basados en
electroquímica
● Arne Tiselius en 1931 desarrolla el “aparato de
Tiselius”
● Ouchterlony desarrolla técnicas inmunológicas.
Örjan Ouchterlony
(1914–2004)

4. Electroforesis.
Generalidades
¿Qué es?
Técnica de separación de moléculas con
base
en su carga neta en un campo eléctrico.
Fines:
● Analíticos
● Preparativos
● Métodos inmunoquímicos. Electroforesis en agarosa

5. La electroforesis:
● Utiliza distintos medios de soporte, por ejemplo: poliacetato de celulosa.
● Geles como la agarosa.
● pH 8,2 - 8,6
Las inmunoglobulinas, en promedio, poseen poca carga en este pH por lo que
migran poco desde el punto de aplicación.

6. Técnicas de difusión en gel.
Inmunodifusión doble por Ö. Ouchterlony
● Análisis cualitativo
de antígenos.
● Reacción antígeno-
anticuerpo por
medio de una
precipitación.

7. ● 2 Antígenos + anticuerpo homólogo = rx de identidad
● 2 Antígenos no relacionados + mezcla anticuerpos específicos = rx no identidad
● 1 Antígeno homólogo + antígeno menos afín = Rx de identidad parcial
Reacción de identidad
parcial
Reacción de no
identidad
Reacción de identidad
Posibles patrones

8. Reacción de identidad parcial.

9. Inmunoelectroforesis
1
2

10. Inmunoensayo
de
ligandos

11. Radioinmunoensayo
● El radioinmunoensayo
desarrollada en 1959 por Yalow
y Berson.
● Uso de material radioactivo.
● Precursor de los ensayos
inmunoenzimáticos.
Rosalyn Yalow (1921-2011)

12. ¿Por qué ya no se usa el radioinmunoensayo?
● Algunos radioisótopos poseen vidas medias muy
cortas.
● Riesgos considerables para la salud.
● Entrenamiento y permisos especiales.
● Sistemas de desecho apropiados

13. ELISA (Ensayo por Inmunoabsorción ligado a enzimas)
Principio básico: aprovechamiento de unión antígeno-
anticuerpo, generando reacciones fácilmente observables
y/o medibles.
Clasificación de ELISA:
● Directos
● Indirectos
● Sandwich
● Competitivo
Generalidades

14. Términos importantes
● Fase Sólida
● Anticuerpo Primario
● Anticuerpo Secundario
● Cromóforo

15. ELISA DIRECTO

16. Consideraciones
● Es adecuado para detectar antígenos de alto peso molecular.
● Se considera que es el ELISA más simple y rápido.
● Sin embargo, presenta desventajas:
○ Marcaje directo de anticuerpos primarios requiere:
■ Mucho tiempo
■ Dinero
■ Especificidad comprometida.

17. ELISA INDIRECTO

18. ELISA SANDWICH

19. Detección simultánea del antígeno p24 de HIV-1 y de anticuerpos
anti HIV-1 y anti HIV-2
● ELISA indirecto y Sandwich aplicado en una
sola prueba.
● Fase sólida:
○ Antígenos: gp41 de HIV-1 y gp36 de HIV-
2
○ Anticuerpos monoclonales anti-p24
● Se utiliza mezcla de antígenos y anticuerpos
marcados con biotina
● Uso de conjugado de peroxidasa unido a
estreptavidina
Biotina
Estreptavidina

20. ● Lo que permite un cambio de color visible es añadir tetrametilbencidina (TMB) y H2O2.
● TMB actúa como donador de hidrógeno para la oxidación de H2O2 mediante peroxidasa.
● TMB forma una diimina de color azul y luego vira a amarillo al añadir ácido sulfúrico
(stopper)
H2SO4 Viraje a amarillo,
leible a 450 nm
Prueba positiva a VIH -> Viraje a azul y amarillo
Prueba negativa a VIH -> Sin cambios

21. ELISA competitivo
● Se utiliza para detectar o cuantificar antígenos presentes
en bajas cantidades.
● Este tipo de ELISA es el más complejo.
● También conocida como ELISA de inhibición.
● Se requiere que el anticuerpo primario tenga una alta
especificidad para el antígeno.
● Método directo
● Método indirecto

22. ELISA COMPETITIVO DIRECTO

23. ELISA COMPETITIVO INDIRECTO

24. Estudio de ELISA competitivo de la Proteína de Cadena Neuronal en
orina en la enfermedad de Alzheimer
● Elisa competitivo directo.
● La proteína de la cadena neuronal (NTP) aumenta
en pacientes con demencia.
● Puede cuantificarse en la primera orina del día del
paciente
● Fase sólida:
■ Antígeno estándar de la proteína NTP

25. ● Anticuerpo IgG marcado con fosfatasa alcalina.
● sustrato p-nitrofenil-fosfato reaccionara con la fosfatasa alcalina ligada al
anticuerpo.
● La reacción se detiene con NaOH mostrando una coloración amarillenta.
Viraje a amarillo,
leible a 405 nm
NaOH
Prueba positiva para NTP: no se mostrará una coloración o
habrá una variación con los valores estándar.
Prueba negativa para NTP: viraje a amarillo

26. Inmunoquimioluminiscencia
● Basada en la técnica ELISA (sándwich o
competitivo)
● Uso de éster de acridina, luminol o AMPPD.
● Emisión de una señal de luz directa o
inversamente proporcional a la concentración
de la molécula de interés.
● Bajo volumen tanto de muestra como de
reactivos.

27. Conclusiones
CONCLUSIONES

28. Referencias.
● Abbas, A., Lichtman, A., Pillai, Shiv. (2015) Inmunología celular y molecular. (8a ed).
Editorial Elsevier Saunders. España. Apéndice IV: Técnicas de laboratorio usadas con
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