Este documento trata sobre inmunomicrobiología e inmunodiagnóstico de hongos patógenos. Describe diferentes técnicas para la detección de antígenos y anticuerpos de hongos como Cryptococcus, Candida y Aspergillus que causan infecciones profundas. Se detalla el uso de pruebas como el látex de Cryptococcus para diagnóstico de criptococosis y ensayos de detección de antígeno como Platelia Candida Ag y Platelia Aspergillus para candidiasis y aspergilosis invasoras.

1. INMUNOMICOLOGIAINMUNOMICOLOGIA
20152015

2. INFECCIONES POR INHALACION DE ESPORASINFECCIONES POR INHALACION DE ESPORAS
Histoplasmosis
Blastomicosis
Paracoccidioidomicosis
Coccidioidomicosis
Aspergilosis
Zygomycosis
Cryptococosis

3. RESPUESTA INMUNOLOGICA DELRESPUESTA INMUNOLOGICA DEL
HUESPEDHUESPED
MEDIACION CELULAR MEDIACION POR ANTICUERPOSMEDIACION CELULAR MEDIACION POR ANTICUERPOS
IDR
AGLUTINACION
HEMAGLUTINACION
INMUNOPRECIPITACION
RIA,
ELISA, ETC.

4. INMUNODIAGNOSTICO DE HONGOS PATOGENOSINMUNODIAGNOSTICO DE HONGOS PATOGENOS
INVESTIGACION DE ANTIGENOSINVESTIGACION DE ANTIGENOS
Antigeno Polisacárido capsular : Cryptococcus neoformans:
Exoantígenos de C. albicans puede diferenciar C. tropicalis
Detección de los serotipos A y B de Candida albicans.
Antígenos liberados en cultivo: Extractos de medios de cultivo
INVESTIGACION DE ANTICUERPOSINVESTIGACION DE ANTICUERPOS
Técnicas de IDD,
•B. dermatitidis,
•P. brasiliensis,
•H. capsulatum,
•C. immitis,
•Candida
•Aspergillus, etc.

5. • Se han desarrollado diversos métodos alternativos al cultivo que
pueden proporcionar al clínico información rápida y fiable ante la
sospecha de una micosis invasora.
• Entre estos métodos destacan:
– Detección de antígenos,
– Deteccion de anticuerpos y
– Deteccion de componentes fúngicos no antigénicos.
• Algunas de estas técnicas serológicas ya se han convertido en
• herramientas básicas en el laboratorio de Microbiología Clínica
actual, como:
– Detección del antígeno capsular de Cryptococcus neoformans
– Detección de galactomanano en pacientes con aspergilosis invasora.

6. DETECCION DE ANTIGENODETECCION DE ANTIGENO
• Criptococosis
• La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y
especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis criptocócica.
• Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez técnica y
especificidad de la prueba.
• Permite el diagnóstico, en 10-15 min, de aproximadamente el 99%
de las meningitis criptocócicas y el 67% de las criptococosis
diseminadas.
• El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios días.
• Se utilizan dos tipos de técnicas, una cualitativa y otra cuantitativa.
• La técnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos casos de
criptococosis o para confirmar reinfección especialmente en el sida.

7. Antigeno cryptococo…….Antigeno cryptococo…….
• La técnica consiste en la detección de antígeno capsular
criptocócico mediante anticuerpos monoespecíficos dirigidos frente
a él y unidos a partículas de látex. La aglutinación de las partículas
de látex tras la reacción antígeno-anticuerpo se detecta a simple
vista..
• La técnica cuantitativa se emplea habitualmente para el seguimiento
• de la evolución de pacientes ya diagnosticados mediante el título de
antígeno capsular presente en la muestra clínica, que generalmente
es suero o LCR.
• Es útil para conocer la eficacia del tratamiento antifúngico aplicado.

8. CRYPTOCOCOSIS LATEXCRYPTOCOCOSIS LATEX
• FUNDAMENTO
• Consiste en la precipitación de particulas de latex sensibilizadas
con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C. neoformans en
muestras de LCR, suero y orina.
• Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de pacientes
con criptococosis meníngea.
• El limite de detección es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .
• Una reaccion negativa no descarta infección.
• La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento
progresivo de titulo es de mal pronostico.
• Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o
mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.
• Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clínicos con
pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion es
separar los complejos inmunes circulantes y destruir el factor
reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la sensibilidad
de la prueba.

9. CRYPTOCOCOSIS LATEX….CRYPTOCOCOSIS LATEX….
• LECTURA DE RESULTADOS
• La lectura es visual y se debe realizarse de la siguiente
manera:
• Negativo: suspensión granular muy fina con ausencia
de aglutinación
• Positivo +: suspensión con escasos grumos contra un
fondo homogeneo lechoso.
• Positivo ++: suspensión con escasos a moderados
grumos contra un fondo moderamente homogeneo.
• Positivo +++: suspensión con moderados a abundantes
grumos contra un fondo claro.
• Positivo ++++: suspensión con abundantes grumos
contra un fondo totalmente claro

10. CRYPTOCOCOSISCRYPTOCOCOSIS LATEXLATEX

11. TITULACIONTITULACION criptococoscriptococos
• Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe realizar
titulaciones para el seguimiento de tratamientos.
• Las diluciones recomendadas son:
– positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2;
– positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100
• Posteriormente para muestras seriadas del mismo
paciente se debe utilizar el mismo esquema de dilucion.
• El seguimiento se debe realizar hasta la negativizacion
de la aglutinación.
• Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de
tratamientos es conveniente realizarlas con el mismo
equipo para evita variaciones.

12. Falso positivoFalso positivo
La sensibilidad varía entre el 93% y el 100% con un 93-98% de
especificidad.
Puede haber falsos positivos:
•Presencia de factor reumatoide
•Pacientes con lupus
•Pacientes con sarcoidosis,
•Arrastre medio de cultivo de agar chocolate,
•Asas de platino o desinfectantes.
•Infección sistémica por Trichosporon ashaii
Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o
2-mercaptoetanol.

13. CANDIDOSISCANDIDOSIS
DETECCION DE ANTIGENOSDETECCION DE ANTIGENOS CIRCULANTESCIRCULANTES
La Candidosis diseminada representa una de las causas de infección más
importantes en lo que concierne a mortalidad y morbilidad en el paciente
inmunocompetente e inmunocomprometido.
Los métodos habituales de diagnóstico (hemocultivo) son negativos en las
candidosis profundas.
Los métodos serológicos no diferencian entre la colonización y la invasión.
Aglutinación con particulas de látex sensibilizadas:
Acs. monoclonales anti mananos
Acs. policlonales anti glucoproteínas

14. DETECCION DE ANTIGENO deDETECCION DE ANTIGENO de
CandidaCandida
• Candidiasis
• La detección de antígeno en pacientes con candidiasis invasora nos
ha permitido solucionar el problema diagnóstico que presenta esta
micosis.
• La detección de manano parece ser más sensible y especifica.
• Platelia Candida Ag (Bio-Rad)
• Es un ELISA que detecta manano en suero utilizando el anticuerpo
monoclonal EBCA1.
• Este anticuerpo reconoce residuos ß-1,5 del manano de C. albicans,
C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. parapsilosis y C.
pseudotropicalis pero no de C. krusei.
• El límite de detección de la prueba es 0,25 ng/ml de suero.
• .

15. DETECCION DE ANTIGENO deDETECCION DE ANTIGENO de
AspergillusAspergillus
• Aspergilosis
• La detección de galactomanano mediante un ELISA permite el
diagnóstico de la aspergilosis invasora.
• Especificidad del 89,6% y sensibilidad del 87,5%.
• Esta prueba en algunos estudios se ha demostrado que es positiva
antes de que aparezca la sintomatología clínica.
• Platelia Aspergillus EIA (Bio-Rad)
• La prueba es un ELISA que detecta galactomanano en suero
utilizando el anticuerpo monoclonal EBA-2, que reconoce el
galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger.
• El límite de detección de la prueba es 1 ng/ml de suero

16. DETECCION DE ANTIGENO deDETECCION DE ANTIGENO de
AspergillusAspergillus
• Actualmente, se considera un resultado positivo cuando el paciente
presenta dos muestras consecutivas con un índice ³0,5.
• La detección de galactomanano puede verse disminuída en
pacientes con enfermedad granulomatosa crónica y Síndrome de
Job
• El Platelia Aspergillus EIA no ha sido evaluado en profundidad en
plasma, orina, BAL y LCR.
• La prueba puede dar positiva con hongos del género Penicillium,
Alternaria y Paecylomyces.
• Alimentos como los cereales, pollo, pastas y productos lácteos
pueden contener galactomanano que puede ser adsorbido en niños
y pacientes con alteraciones en la barrera intestinal.
• Resultados falsos positivos en pacientes tratados con: piperacilina-
tazobactam y amoxicilina-clavulánico

17. (REACCIONES SEROLOGICAS)(REACCIONES SEROLOGICAS)
Aglutinación
Fijación de Complemento
Inmunoprecipitación en gel:
Inmunoelectroforesis
Inmunodobledifusión
Inmunofluorescencia
Inmunoenzimática (ELISA)
Radioinmunología

18. DETECCION DE ANTICUERPOSDETECCION DE ANTICUERPOS
• Dificultad de preparación de antígenos estandarizados
• Débil título de anticuerpos en el curso de las micosis
• Utilización generalmente para micosis profundas
• Reacciones cruzadas
• En cryptocosis no tiene utilidad
• Candidosis: actualmente detectan anticuerpos contra el manano, la
enolasa y los antígenos del micelio.
• Aspergilosis: La detección de anticuerpos específicos en suero es,
una prueba complementaria clásica para confirmar el diagnóstico
de aspergiloma pulmonar y de la aspergilosis broncopulmonar
alérgica (ABPA). Las técnicas empleadas son: la inmunodifusión
doble (IDD) y contrainmunoelectroforesis (CIE)

19. Inconvenientes de la InmunodifusionInconvenientes de la Inmunodifusion
Es lenta, precisa de una incubación de hasta 3 días, aunque
a las 24 h ya se pueden observar arcos de precipitación.
Puede producir reacciones cruzadas entre distintas especies
de Aspergillus y se extienden a otras especies de hongos e
incluso algunas bacterias.
Esta técnica no distingue el tipo de anticuerpo específico
presente en el suero (IgG, IgM o IgE).
Tiene una sensibilidad baja, Debido a éste problema esta
técnica no es de utilidad en aspergilosis invasoras.
El factor reumatoide y la proteína C-reactiva presentes en el
suero pueden causar falsas precipitinas.

20. DIAGNOSTICO INMUNOLOGICODIAGNOSTICO INMUNOLOGICO
DE LAS MICOSIS PROFUNDASDE LAS MICOSIS PROFUNDAS

21. DETECCION DE LA SENSIBILIDAD CUTANEADETECCION DE LA SENSIBILIDAD CUTANEA
Antígeno : Histoplasmina (filtrado del cultivo miceliano)
Reacción positiva:
Infección en evolución ( infiltración pulmonar, lesiones cutáneas) o
crónica ( calcificación pulmonar, esplénica )
Reacción negativa:
no excluye infección (comienzo, diseminación, anergia).
Induce la formación de anticuerpos
Presencia de reacciones cruzadas con otras micosis
Uso epidemiológico. Sin valor diagnóstico

22. Antigeno de histoplasmaAntigeno de histoplasma
• Las pruebas pueden aplicarse a muestras tales como:
suero, plasma, liquido peritoneal o LCR de pacientes
con enfermedad respiratoria, hepatoesplenomegalia,
signos de infección sistémica extrapulmonar o con
compromiso meníngeo, en pacientes que vivieron o
trabajaron en zonas endémicas de Histoplasma
capsulatum

23. InmunodifusionInmunodifusion

25. Reacción de identidad:Reacción de identidad:
Fusión completa de los anticuerpos del paciente con los
antígenos del hongo. Fusión de los extremos de las bandas
precipitantes del suero de referencia y del suero del paciente.
CONSTITUYE UNA PRUEBA POSITIVA
PONE EN EVIDENCIA QUE EL PACIENTE POSEE
ANTICUERPOS ESPECÍFICOS PARA EL ANTÍGENO DE UN
HONGO EN PARTICULAR..
Suero
Problema
Suero
Control
NO SE INTERPRETA COMO POSITIVA
Realizar otras pruebas complementarias como la IEF, FC,
ELISA, etc.
Reacción de identidad parcial:Reacción de identidad parcial:
Anticuerpos del paciente reaccionan en forma incompleta con el antígeno de
referencia. Esto ocurre por la existencia de fracciones antigénicas comunes a
varios hongos que reaccionan parcialmente con los anticuerpos del suero del
paciente (histoplasmosis-paracoccidioidomicosis).

26. Reacción de no identidad:Reacción de no identidad:
Las bandas de precipitación se entrecruzan. La muestra
del paciente presenta anticuerpos que pueden reaccionar
con uno de los múltiples componentes no específicos del
antígeno de referencia.
CONSTITUYE UNA PRUEBACONSTITUYE UNA PRUEBA
NEGATIVANEGATIVA

27. INMUNODOBLE DIFUSION HCINMUNODOBLE DIFUSION HC
TITULACIONTITULACION
M :M : La banda M se encuentra cerca del hoyo del antígeno
Histoplasmosis aguda o cronicaHistoplasmosis aguda o cronica..
de una infección pasada o
de una prueba cutánea reciente.
H :H : la banda H cerca del hoyo del suero control positivo.
Histoplasmosis activa y progresiva.Histoplasmosis activa y progresiva.
Puede persistir de uno a dos añosPuede persistir de uno a dos años

28. DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSDETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOS
• Actualmente se basa en la detección de D-arabinitol,DNA y (1®3)-
ß-D-glucano.
• El D-arabinitol es un metabolito producido por C. albicans, C.
tropicalis, C. parapsilosis y C. kefyr que puede detectarse mediante
cromatografía gas-líquido o mediante una técnica enzimática
• comercializada en Japón.
• Niveles elevados de D-arabinitol se han detectado en pacientes con
• candidiasis invasora y su monitorización se ha mostrado útil en el
seguimiento de estos pacientes.
• La técnica presenta falsos positivos en pacientes con insuficiencia
renal o en tratamiento con esteroides y suele ser necesario ajustar
las concentraciones de D-arabinitol con respecto a las de creatinina
o L-arabinitol. El D-arabinitol también puede detectarse en orina.

29. DETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOSDETECCION DE COMPONENTES NO ANTIGENICOS
• La detección de (1®3)-ß-D-glucano en plasma es otra posibilidad
diagnóstica en las micosis producidas por
– Candida,
– Aspergillus y
– Pneumocystis,
• El ser humano carece de glucanasas para digerir (1®3)-ß-D-
glucano y por tanto su eliminación es lenta.
• Existen varias pruebas comercializadas para la detección (1®3)-ß-
D-glucano, siendo el Fungitell la más recientemente comercializada.
Las pruebas para detectar (1®3)-ß-D-glucano pueden presentar
falsos positivos en pacientes sometidos a hemodiálisis con aparatos
que tengan membranas de acetato de celulosa, o en tratamiento
con albúmina, inmunoglobulinas, algunos agentes anticancerosos y
• sulfamidas

30. REACCION DE AMPLIFICACION ENZIMATICAREACCION DE AMPLIFICACION ENZIMATICA
(PCR(PCR))
DIAGNOSTICO FUTURODIAGNOSTICO FUTURO
Sondas quimioluminiscentes marcadas con Ester de Acridina:
H. capsulatum, B. dermatitides, C. immitis, C. neoformans.
(100% de especificidad y ± 96% de sensibilidad).
Identificación rápida (2 h.) vs 3 días para la investigación de
exoantígenos de un cultivo miceliano de 7 a 10 días de
desarrollo.

31. INMUNODIAGNOSTICO DEINMUNODIAGNOSTICO DE
HONGOS PATOGENOSHONGOS PATOGENOS
SONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS
Hibridación de ADN:
Identificación rápida, sensible y específica del material
genético detectado con sondas de ADN marcado.
Ventajas:
Detección e identificación simultánea, directamente de la
muestra clínica o de colonias aisladas con ayuda de la
amplificación enzimática, de sondas nucléicas

32. CANDIDOSISCANDIDOSIS
SONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS
Han sido desarrolladas para:
•Tipiaje del ADN del género, especies de Candida.
•Identificación de factores de virulencia C. albicans.
•Estudio de la morfogénesis C. albicans.
•Modo de acción de antifúngicos.

33. CRIPTOCOCOSISCRIPTOCOCOSIS
SONDAS NUCLEICASSONDAS NUCLEICAS
Permite identificar los 4 serotipos de C. neoformans ( Sonda
Accu Probe Soc. Gen-Probe), con
100% de sensibilidad y especificidad
Identificación muy rápida (1 h)
42 cepas aisladas de enfermos fueron identificadas
52 otras especies de levaduras no respondieron