Tecnicas de inmunodiagnostico

TECNICAS DE INPORTANCIA EN EL INMUNODIAGNOSTICO.

Información recopilada de interés veterinario.
Por; Alba Miriam Poche Ceballos
LCV. UDCA

1. AGLUTINACIÓN.
Son técnicas más sensibles que las anteriores que se usan para valorar la presencia de
Ac específicos en el suero. Se basan en la capacidad de los Ag particulados, unidos a
sus Ac complementarios, para aglutinarse dando lugar a un agregado que se ve a
simple vista.

Esta técnica puede ser:
- Cualitativa: resultado positivo o negativo.
- Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac.
Título de Ac es la inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacción
de aglutinación.
Dependiendo de la conformación del Ag, se pueden distinguir dos tipos básicos de
aglutinación:
1.1.1. AGLUTINACIÓN DIRECTA.
Se utilizan Ag formes o particulados en suspensión (bacterias protozoos o esporas).
Todos ellos exhiben determinantes antigénicos o epitopos en su periferia.

Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un suero problema:

- REACCIÓN POSITIVA: Los Ac frente a esos epitopos
producirán la correspondiente aglutinación y formación de IC,
evidenciándose mediante la aparición de un velo malla característico en el medio.
- REACCIÓN NEGATIVA: sí no hay Ac, no se formaran los IC y en consecuencia los Ag
particulados sedimentan formándose un anillo o botón bien definido en el fondo del
tubo o pocillo de reacción.
2.1.2. AGLUTINACIÓN INDIRECTA.
Para esta técnica se utilizan Ag particulado soluble sensibilizado (epitopos sobre un
soporte sólido inerte en solución). Se usan bolas de látex, carbón activo, bentonita,
etc.

1.1.2.1. AGLUTINACIÓN INDIRECTA EN PORTA.
Se suele efectuar sobre un porta y no en tubo o placa, mezclándose una gota de látex
sensibilizado y una gota de suero, verificándose la reacción en un tiempo muy corto
(2-10 minutos).
La reacción positiva se evidencia por la aparición de un moteado característico,
ausente en la negativa. Normalmente la técnica es cualitativa, con resultado +/-; pero
puede convertirse en cuantitativo, si la reacción se efectúa con diluciones seriadas.
1.1.2.2. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA.
Cuando en lugar de partículas inertes se usan eritrocitos convenientemente tratados
(hematíes de carnero tanizados), como soporte de los Ag (hematíes sensibilizados), se
denomina HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI). Se efectúa en placa de
microtitulacion, con diluciones seriadas de los sueros y la lectura es similar a la de la
aglutinación directa.
Esta prueba es un desarrollo directo de la prueba de Coombs que se usa para
determinar Ac contra Ag de la superficie de los eritrocitos.
- PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA: detecta Ac contra el Ag Rh en la madre gestante.

- PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: detecta la presencia de IC sobre la superficie de los
eritrocitos del recién nacido.

1.1.3. INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN.
Una variante es la INHIBICIÓN DE LA HAMAGLUTINACIÓN (IHA), en la que los posibles
Ac existentes en la muestra problema son neutralizados previamente, por lo que la
lectura de resultados se interpreta en sentido contrario a la hemaglutinación:
- REACCIÓN POSITIVA: presencia de botón.
- REACCIÓN NEGATIVA: aparición de velo.
Esta técnica se usa para diagnosticar microorganismos que por sí solos son capaces de
aglutinar glóbulos rojos, como el virus de la rubéola. Sí en el suero del enfermo hay Ac
contra el virus de la rubéola, se produce un bloqueo de los virus y se inhibe la
aglutinación. La ausencia de aglutinación se interpreta como POSITIVO, porque hay Ac
contra el virus de la rubéola.
1.2. REACCIONES DE LISIS.
Las reacciones inmunológicas que utilizan el complemento se basan en su capacidad
lítica. Esta capacidad lítica esta disminuida en enfermedades autoinmunes, deficiencias
congénitas y enfermedades infecciosas.
La formación de IC conlleva en muchos casos la fijación de complemento. Esta fijación
no es visible, pero puede revelarse al manifestarse alguna de las reacciones biológicas
del complemento (hemolisis).
1.2.1. REACCIONES PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
1.2.1.1. CAPACIDAD HEMOLÍTICA (CH50).
Es la principal prueba en el screning de los déficits del complemento

Se determina la concentración de suero que es capaz
de producir la lisis del 50% de un preparado estándar de
eritrocitos sensibilizados con Ac antieritrocitos. La prueba se efectúa en tubos o placas,
de acuerdo con la siguiente metodología:
a) Sensibilización de hematies de carnero, previamente lavados, por incubación con
hemolisina de carnero (Ac antieritrocitos de carnero).
b) Preparación de los sueros: se disponen tubos con diferentes cantidades de suero, a
los que se añade un volumen determinado de hematies de carnero sensibilizados.
Como control se dispone un tubo de lisis total, que contiene sólo hematies
sensibilizados y agua destilada. Después de la incubación se efectúa la lectura en el
espectrofotómetro.
c) Interpretación de resultados:
- Cada lectura se divide por la correspondiente a la lisis total y se multiplica por 100.
- Se representa gráficamente los ml de suero (ordenadas) frente a los porcentajes
calculados (abcisas) en un papel semilogarítmico.
- Se determina por extrapolación el valor correspondiente al 50%, que será la cantidad
de suero necesaria para lograr una capacidad hemolítica 50.
1.2.1.2. HEMOLISIS RADIAL SIMPLE.
Es similar a la inmunodifusión radial simple, pero aquí se produce hemolisis (se forma
un halo de hemolisis). Mide la actividad total de la vía clásica o CH100.
1.2.1.3. OTROS MÉTODOS PARA MEDIR EL COMPLEMENTO.
Se usan para medir los componentes individuales del complemento por separado:
- Nivel total: RIA, ELISA, nefelometría, turbidimetría.
- Nivel funcional: hemolisis de eritrocitos sensibilizados o reacción enzimática con un
sustrato que genera calor.
1.2.1.4. REACCIONES QUE UTILIZAN EL COMPLEMENTO: REACCIÓN DE
FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO (RFC).
- Esta prueba se usa para detectar Ac o Ag.
- El principio básico de una prueba de fijación de complemento es la activación y el
consumo (fijación) del complemento en presencia de una reacción Ag:Ac específica.
- El sistema de detección usado es la lisis de GR en la presencia del antisuero
específico para los GR (sistema hemolítico) si el complemento no se consume en la
reacción Ag:Ac inicial.
- En la mayoría de las reacciones Ag-Ac, el complemento se une al complejo y es
usado o fijado. Este proceso puede usarse para detectar cantidades muy pequeñas de
Acs. La concentración que detecta es de mgr/ml.
- Su ejecución requiere de gran cuidado y buenos controles.
- Se hace en dos etapas: la fijación del C’ y el revelado de la reacción con el sistema
hemolítico.
Las fases de la técnica:

a) Se añade una cantidad determinada del Ag
específico de aquellos Ac que se pretende detectar. si hay Ac en
el suero problema, se unirán a los Ag y se forman IC.
b) Se añade el complemento a la mezcla. Sí hay IC, éstos fijaran el complemento y se
consumirá. En caso contrario, el complemento quedara libre.
c) Se añade el sistema revelador de la reacción o sistema indicador, constituido por
una mezcla de células indicadoras (eritrocitos de carnero) y una cantidad de Ac
subaglutinante (Ac antieritrocitos de carnero).

d) Lectura de la prueba:
- REACCIÓN POSITIVA: no hay hemolisis porque el complemento se consumió en la
reacción inicial. Indica que hay Ac en el suero problema.
- REACCIÓN NEGATIVA: hay hemolisis porque el complemento no se consumió en la
reacción inicial. Indica la ausencia de Ac en el suero problema.

La prueba suele efectuarse en placas de plástico y realizando un banco de dilución para
hallar el título de Ac (ultimo pocillo en el que la reacción es positiva). Hay que realizar
controles porque los IC y algunos Ag bacterianos pueden fijar el complemento.

2. FLUORESCENCIA

Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas moléculas
(fluoróforos)

1°:Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un
fluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’
2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito
(típicamente 1-10 x 10-9 segundos), sufre cambios conformacionales y puede
interaccionar con su ambiente molecular. Consecuencias: La energía de S1’ es
parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se
emite la fluorescencia; no todas las moléculas inicialmente excitadas del estado 1
vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.
3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al
fluoróforo al nivel S0. A causa de la disipación de energía durante el estado excitado,
la energía de este fotón es menor.
La diferencia de energía es llamada “Stokes shift” (h?EX – h?EM) que es
fundamental para la sensibilidad de las técnicas de fluorescencia, ya que la emisión del
fluoróforo permite distinguirse del background.
2.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
- El mismo fluoróforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para moléculas
poliatómicas en solución las transiciones electrónicas son reemplazadas por un
espectro de energía llamado espectro de excitación de fluorescencia y de emisión. El
ancho de banda del espectro es un parámetro importante para cuando dos
fluoróforos son detectados simultáneamente.
- El espectro de emisión de fluorescencia es independiente de la longitud de
onda a la cual se excita. La intensidad de emisión es proporcional a la amplitud del
espectro de excitación a la longitud de onda de excitación.
- Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como
excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los máximos de
absorción del fluoróforo.
- Los espectros de absorción y de fluorescencia de un fluoróforo en general están
próximos (l más cortas y l más largas respectivamente). Esto es importante en la
elección de los filtros.

– La intensidad de la señal depende de los mismos
parámetros que la absorbancia, aunque también de la fuente de
excitación (comúnmente un láser de ion argón, longitud de 488 nm) y de la eficiencia
de recolección del detector.

- Las muestras biológicas marcadas con fluorescencia contienen típicamente más de
una especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la señal sea compleja. Otras
señales ópticas (como S2) quizás correspondan al background o a una segunda sonda
fluorescente.
- La detección de autofluorescencia puede ser minimizada por la selección de filtros
adecuados que reduzcan la transmisión de E2 respecto de E1.

- Quenching de fluorescencia: En muestras biológicas el fluoróforo está en solución y
puede interaccionar con otras moléculas. Como consecuencia de esta interacción se
puede producir una perdida de emisión fluorescente. Es un proceso de desexcitatción
no radiativa provocado por una molécula ajena al fluoróforo (compuestos no
fluorescentes), que recibe el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina
“quenching” de la fluorescencia
2.2. ELECCIÓN DEL FLUOROCROMO
- La elección de un fluorocromo dependerá de una serie de factores. Si se necesita un
único color el fluorocromo de elección será el FITC. El FITC es barato, tiene un alto
rendimiento cuántico y es relativamente hidrofílico. La rápida pérdida de la
fluorescencia bajo una intensa iluminación ultravioleta puede ser solucionado por el
añadido al preparado de fenilendiamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivos
son tóxicos para células vivas. El derivado triazínico de la fluoresceína, el dicloro-
triazinilamino fluoresceína (DTAF) posee propiedades ópticas muy similares al FITC
pero es mucho más estable.
- El segundo fluorocromo más popular es el isotiocianatotetrametil de rodamina
(TRITC), que es mucho más fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensa
fluorescencia roja del TRITC es fácilmente distinguible de la verde del FITC. Debido a
ello por varios años fueros los dos fluorocromos de elección para experimentos con

fluorescencia combinada. La pérdida de la
fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.

2.3. MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
- La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro
excitador que sólo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda
deseada. Esta radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del
objetivo sobre la muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y
emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es
enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se
refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la
radiación de excitación.

- Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorción del fluorocromo. Que no
llegue al ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromática o no.
- Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l más largas. Barrera:
Transparente a l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.
2.3.1. FUNDAMENTO.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después
este conjugado a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes de tejidos,

frotis de microorganismos o de células, o cultivo de
tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se
expone a la luz ultravioleta se producirá fluorescencia observable bajo el microscopio
de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una
enzima que cataliza una reacción por la cual se emite fluorescencia
2.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIÓN DE ANTICUERPOS POR
SUSTANCIAS FLUORESCENTES
A) Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener:
- Fluorescencia intensa
- Reacción específica con los antígenos
Depende de:
- Calidad y concentración de los Acs en el suero
- Propiedades de la sustancia fluorescente
- Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople
También influyen:
- Intensidad de marcación
- Homogeneidad de marcación
- Presencia en el conjugado de otras moléculas marcadas
B) Anticuerpos
- Para mayor especificidad utilizar antígenos puros para inmunizar
- Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
- Purificar la fracción de Ig a marcar
- Verificar título de anticuerpos
- Existe un estrecho paralelismo entre título precipitante y fluorescente
- Titulación de reactivos: Ac 1° y Conjugado deben titularse.
C) Fluorocromos
-El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtración en geles. Disponibilidad
filtros
D) Intensidad de marcación
- Fluorocromo puede ser conjugado en un número variable a cada molécula de
proteína, resultando diferentes grados de marcación.
- Mayor intensidad de marcación, mayor intensidad
- Marcación excesiva:

- Disminución del PI de las proteínas
- Alteraciones en las propiedades inmunológicas de los anticuerpos (6 ó 7 moléculas de
fluoresceína/ molécula de Ac es el límite máximo)
- Quenching de fluorescencia (disminución del rendimiento de emisión)
E) Homogeneidad de marcación
- Altamente marcadas: Fluorescencia inespecífica
- Medianamente marcadas: Resultados más satisfactorios
- Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa
2.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA

2.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.

Ac Policlonal Ac Monoclonal Pool de Ac
monoclonales
Fuerza de señal Excelente Regular a Buena Excelente
Especificidad Buena, pero a Excelente pero con Excelente
veces el posible reacción cruzada
background es
alto
Ventajas Señal fuerte Específico Señal fuerte
Desventajas No renovable Baja señal Específico
Background Disponibilidad
Se necesita titular

2.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.

Es una técnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac
específicos en el suero.
En esta técnica la visualización del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por
intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que
recibe el nombre genérico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son
formes o partículas (cortes de tejidos, bacterias, parásitos o cortes de
parásitos, etc).

2.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).

Se añade la solución de Ac fluorescente sobre el Ag,
previamente fijado en un porta o placa, se incuba, se lava y se
leen los resultados.

2.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).
El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego se
añade el anti-Ac fluoresceinado contra la región Fc del primero, se lavan y se leen los
resultados.

Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedades
autoinmunes.
2.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR
COMPLEMENTO.
Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, después de
añadir el Ac, se añade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se han
fijado los Ac. Debido a los pasos de amplificación de la vía clásica del complemento,
una molécula de Ac puede fijar muchas moléculas de C3b al Ag, que se revelan con Ac
anti C3b fluoresceinado. Es una técnica mucho más sensible.
En los tres casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observación del porta en
un microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). El
patrón de fluorescencia es característico de cada Ag.

3. HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA
Histoquímica es el estudio químico de los tejidos independientemente del método de
análisis empleado. En la práctica se emplea la palabra para designar el método junto
con el auxilio de los microscopios ópticos (MO) y electrónico (ME).
Esta técnica permite la identificación y localización de compuestos o radicales químicos
en las células y tejidos. Esto se consigue provocando reacciones que dan productos
insolubles que son coloreados o electrodensos y visibles por el MO y el ME .
A. PRINCIPIOS BÁSICOS.

1. QUE LOS COMPUESTOS QUE DEBEN SER
ANALIZADOS NO SEAN DIFUSIBLES.
Este problema se resuelve insolubilizando los compuestos que van a ser estudiados por
medio de la fijación del tejido.
- Se recomienda el uso de fijadores con alcohol para el estudio de sustancias
hidrosolubles como el glucógeno.
- Hay que evitar los fijadores ácidos en las técnicas de visualización del fosfato cálcico.
Los fijadores más utilizados son:
- Formaldehído para el MO .
- Glutaraldehído para el ME.
2. EL PRODUCTO DE LA REACCIÓN DEBE SER INSOLUBLE para evitar la difusión .
3 .EL MÉTODO UTILIZADO DEBE SER ESPECÍFICO PARA LA SUSTANCIA O GRUPO
QUÍMICO QUE SE ESTA ANALIZANDO. En algunas reacciones la intensidad del color
producido es proporcional a la concentración de la sustancia analizada.En este caso se
puede medir dicha sustancia con un histofotómetro.
B. PRINCIPALES SUSTANCIAS DE INTERÉS BIOLÓGICO DEMOSTRABLE
HISTOQUÍMICAMENTE.
1. IONES
IÓN DETERMINACIÓN
HIERRO - EL ión férrico se demuestra por la reacción con la mezcla de FERRO-
CIANURO POTÁSICO Y ÁCIDO CLORHÍDRICO que forma un precipitado
azul oscuro de ferrocianuro férrico.
- Esta reacción se usa para localizar los macrófagos del SRE y
diagnosticar enfermedades en las cuales hay depósitos de hierro en los
tejidos .
FOSFATO Reaccionan con NITRATO DE PLATA y se forma fosfato de plata que es
reducido por hidroquinona y forma un precipitado negro. Esta reacción
se usa para el estudio del hueso.
2. LÍPIDOS.
Se usan colorantes que se disuelven en las grasas como el SUDAN IV y el SUDAN
NEGRO.Los tejidos se sumergen en soluciones alcohólicas saturadas de colorantes muy
liposolubles y debilmente solubles en alcohol. Se usa para el diagnostico de
enfermedades metabólicas que producen depósitos intracelulares.
3. ÁCIDOS NUCLÉICOS.
ÁCIDO DETERMINACIÓN
NUCLÉICO
DNA Se usa la reacción de FEULGEN que consiste :
- Hidrólisis del DNA con ácido clorhídrico para extraer las bases púricas
y dejar en libertad los grupos aldehídicos del azucar.
- El reactivo de SCHIFF (fuchsina básica con anhídrido sulfuroso)

reacciona con el aldehído y forma un precipitado rojo.
Esta reacción presenta proporcionalidad entre la intensidad del color
producido y el contenido en DNA del núcleo.
RNA Tiene gran afinidad por los colorantes básicos (basofília) lo que hace
que se tiña intensamente con el AZUL DE TOLUIDINA o de METILENO.
4. PROTEÍNAS.
Su identificación se basa en métodos de detección de aminoácidos.
- Reacción de aminobenceno.
- Reacción de Sakaguchi que detecta la arginina de las proteínas básicas como las
histonas y protaminas.
5. POLISACÁRIDOS.
Se encuentran unidos a proteínas o en forma libre. En el caso de ser un polímero,
antes hay que tratar la muestra con un enzima glucogenolítico para que libere los
azucares.
La reacción más usada es la del PAS (ácido periódico-schiff). El ácido oxida a los
azucares en posición 1-2 y deja grupos aldehídos libres que reaccionan con el reactivo
de SCHIFF dando un compuesto insoluble y coloreado. De este modo se demuestra la
presencia de:
- Glucógeno en el hígado y músculo.
- Depósito intracelular de glucógeno en enfermedades congénitas.
- Glucosaminoglicano o mucopolisacárido que forman parte de los proteoglicanos.
- Glucoproteínas.
Los azucares ácidos también reaccionan con el colorante AZUL DE ALCIAN.
6. CATECOLAMINAS. El formoaldehído reacciona con las catecolaminas produciendo
compuestos fluorescentes.
7. ENZIMAS. Su localización se basa en la producción de un precipitado fuertemente
coloreado o electrodenso en el sitio de actividad enzimática.
ENZIMA DETERMINACIÓN
FOSFATASA ÁCIDA Se usa el método de GOMORI que consiste en incubar cortes de
tejidos en una solución que contengan GLICEROL FOSFATO
SÓDICO y NITRATO DE PLOMO a pH 5 .
La enzima libera el fosfato que reacciona con el plomo y da un
precipitado insoluble.Después se añade sulfito de amonio que
da color negro y electro denso al precipitado.
Se usa para localizar lisosomas.
DESHIDROGENASAS Se usan cortes no fijados junto con un compuesto químico
soluble y debilmente coloreado del tipo TETRAZOL.Eltetrazol es
reducido y forma un precipitado coloreado llamado FORMAZAN.

Se usa para detectar mitocondrias.
PEROXIDASA Promueve la reducción de ciertos sustratos, transfiriendo iones
hidrógenos desde el peróxido de hidrógeno al sustrato que se
reduce.
Como sustratos se usa el peróxido de hidrógeno y el
tetraclorato 3,3-diamino-bencidina que cuando se reduce forma
un compuesto coloreado, insoluble y electrodenso.

B. FLUORESCENCIA.
Sustancia fluorescente es la que absorbe luz de una longitud de onda determinada y
emite luz en otra longitud de onda mayor. En microscopía se suele usar la excitación
con luz ultravioleta.
1. COMPUESTOS FLUORESCENTES.
- Compuestos naturales constituyentes de las células: vitamina A, riboflavina(B2) y las
porfirinas.
- Colorantes con afinidad por las estructuras celulares como el Naranja de acridina que
se une a los ácidos nucléicos:
- DNA: fluorescencia verde amarillenta.
- RNA: fluorescencia roja amarillenta.
Esta prueba se usa en el diagnostico precoz del cáncer (células ricas en RNA).
2. INMUNOCITOQUÍMICA (INMUNOFLUORESCENCIA).
Sirve para identificar proteínas especificas. Se basa en la reacción Ag-Ac. Al Ac se le
puede marcar con un compuesto fluorescente. Es la método más usado para la
detección de auto-anticuerpos en enfermedades autoinmunes.
PREPARACIONES PERMANENTES
Describiremos primero las preparaciones histológicas permanentes (laminas) para el
estudio al microscopio óptico. Con este instrumento los objetos se examinan por
transparencia, siendo pocas las estructuras que se examinan directamente
(mesenterio, cola de renacuajo) y que pueden ser observadas “in vivo”, sin fijar y
teñir, como sucede en las preparaciones permanentes.
Los pasos que se siguen para obtener una preparación permanente son:
1º. Fijación
2º. Inclusión
3º. Corte con microtomo
4º. Coloración
A. FIJACIÓN.
- Se hace a fin de evitar la autolisis y destrucción celular.
- Los tejidos deben ser tratados inmediatamente después de ser cortados.

- Tiene por fin endurecer los tejidos, volviéndolos mas
resistentes a las etapas subsiguientes de la técnica
histológica.Hay que conservar la morfología y la composición química de los
componentes de los tejidos.
- Suele durar unas 12 horas.
La fijación puede ser realizada por procesos:

MÉTODO CARACTERÍSTICAS
FÍSICO - Calor, como en bacterilogía.
- Frió, como en el criostato.

QUÍMICO (uso de fijadores Fijadores:
que inmovilizan las proteínas
de los tejidos).Es la más - Cloruro de mercurio y ácido pícrico precipitan
usada en Histología. proteínas.
- Formaldehído, tetraóxido de osmio y glutaraldehído
apenas causan coagulación y se usan en ME.
Mezclas fijadoras:
- Liquido de BOUIN: pícrico/formol/acético glacial
- Liquido de HELLY: dicromato potásico/cloruro de
mercurio/formol

Este paso es ESENCIAL, puesto que las proteínas son las principales responsables de la
estructura celular y se degrada después de la muerte celular.
Habitualmente se hace una doble fijación con una solución tamponada de:
- Glutaraldehído.
- Tetraóxido de osmio.
B. INCLUSIÓN.
- Da consistencia firme a los tejidos para que se puedan obtener cortes
suficientemente finos.
- Las sustancias más usadas para este fin son:
- GELATINA, CELOIDINA, PARAFINA para la MO.
- RESINA EPOXI para la ME.
Hay una serie de tratamientos a los que hay que someter a una pieza antes de la
inclusión:

TRATAMIENTO CARACTERÍSTICAS
DESHIDRATACIÓN Se extrae el agua de los tejidos con baños de
concentraciones crecientes de etanol ( de 70% a
100%).
ACLARAMIENTO O Sustitución del etanol por un liquido miscible en
DIAFANIZACIÓN etanol y parafina.Se usa xilol, benzol o toluol que
dejan a la pieza translúcida.

INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN - Se colocan las piezas en parafina fundida a 60 ºC
en el interior de una estufa.
- Debido al calor , el xilol o toluol se evaporan y los
espacios que dejan libre son ocupados por la
parafina.
- Se lleva la pieza a un recipiente rectangular y se
deja solidificar.
- Inconvenientes:
- Destruyen muchas enzimas
- Eliminan compuestos liposolubles

C. CORTE CON MICROTOMO.
- Los bloques de parafina son seccionados por la cuchilla del microtomo, obteniéndose
cortes de 3 a 8 micras de espesor. Estos cortes son extendidos en agua caliente y
después se llevan a un portaobjetos.
- Para el microscopio electrónico se requieren cortes de 0.02 a 0.1 micra. El material
se incluye en plásticos bastante duros del tipo epoxi y para cortarlos se usa un
ultramicrotomo equipado con navaja de cristal o diamante.
- El microtomo de CONGELACIÓN SE USA PARA ESTUDIAR LOS LÍPIDOS DE LAS
ESTRUCTURAS CELULARES, ya que los solventes orgánicos los eliminan. Usa nieve
carbónica para congelar el tejido.
- CRIOSTATO es un microtomo de congelación más elaborado que permite la obtención
rápida de cortes sin pasar por todas las etapas anteriores, cuando se usa parafina.Son
muy utilizados en hospitales cuando se requiere un diagnostico rápido de un material
patológico.
El criostato es también muy útil en histoquímica , pues no inactiva las enzimas, pero
dificulta la difusión de las moléculas.
- MÉTODO DE CONGELACIÓN-DESECACIÓN: Se mantiene la actividad enzimática. Se
congela a -150 ºC y después se deshidrata lentamente a vació.
D. COLORACIÓN.
- Aumenta el contraste de las estructuras y hace a los tejidos visibles y diferenciables
unos de otros.
- Se realiza normalmente con MEZCLAS QUÍMICAS DE COLORANTES.
- La mayoría de los colorantes se comportan como ácidos o como bases y tienden a
formar sales con los radicales ionizables de los tejidos.
- Los componentes de los tejidos pueden ser:

SUSTRATO COLORANTE EJEMPLOS
BASÓFILO (tejidos que se BÁSICO (azul de toluidina y Nucleoproteínas y
tiñen fácilmente con azul de metileno, glicoproteínas ácidas.
colorantes básicos). hematoxilina).

ACIDÓFILO (tejidos que se ÁQCIDO (orange G, eosina y Proteínas básicas del
tiñen fácilmente con la fuschina ácida). citoplasma.
colorantes ácidos).

La doble coloración por la hematoxilina y la eosina es la más utilizada en la técnica
histológica.
OJO: Los colorantes no proporcionan datos sobre la naturaleza química de los
componentes a los que se unen.

TÉCNICA COMPONENTES NÚCLEO CITOPLASMA FIBRAS FIBRAS RETICULINA
COLÁGENAS ELÁSTICAS
Hematoxilina- Hematoxilina Azul - - Irregular -
eosina
Eosina - Rosa Rosa Irregular -

Hematoxilina Negro - - - -
férrica
TricromoMasson Fuchina-ácida y - Rojo - - -
Panceau
Verde luz - - Verde - -

Fuchina- Fuchina y - - - Púrpura -
resorcina resorcina
Impregnación Sales de plata - - Castaño - Negro
argéntica

Los factores que influyen en la tinción son:
- Pureza y concentración del colorante.
- pH y temperatura.
- Tiempo.
E. METACROMASIA.
Hay ciertos tejidos, como la matriz cartilaginosa, que al usar colorantes como el azul
de toluidina, se modifica el color azul por unión al tejido, pasando a púrpura. A este
fenómeno se le denomina metacromasia.
Los colorantes metacromáticos suelen ser básicos, como el azul de toluidina y tionina.
Los componentes tisulares que pueden colorearse metacromáticamente, denominados
cromotropos, son principalmente:
- Glucosaminoglicanos sulfatados, fuertemente ácidos de la matriz cartilaginosa y los
mastocitos del tejido conectivo.
- Nucleoproteínas.
F. MANIPULACIÓN EXPERIMENTALES DE CÉLULAS VIVAS.
Las técnicas de tinción pueden ser:
- VITALES: no provocan la muerte. Se usan colorantes relativamente no venenosos
que son retenidos selectivamente por algunas células del organismo. Se inyecta al
animal vivo.

- SUPRAVITALES: se agrega el colorante a las células
o tejidos que permanecen vivos después de ser separados del
organismo.
Ejemplos:
- El carmín y azul tripán se usan para el estudio de la fagocitosis.
- El rojo neutro para identificar los distintos tipos de leucocitos.
- El verde jano tiñe las mitocondrias.
- La alizarina se une a la matriz ósea recién formada y se ha usado para el estudio de
la formación del hueso.
G. CRIOFRACTURA.
Permite el estudio de la ultraestructura de las células sin los posibles artefactos
producidos por la fijación y la inclusión (ej: membrana plasmática). Sirve para el
examen de cortes ultrafinos.
Fases:
1º. Congelar el tejido a temperatura muy baja.
2º. Fracturar con una cuchilla de metal afilada. El tejido fracturado se mantiene a muy
baja temperatura y en alto vacío, así se elimina el agua por sublimación. La superficie
fracturada muestra elevaciones y depresiones correspondientes a las diversas
estructuras de los tejidos.
3º. Hacer una réplica al molde de la superficie fracturada depositando una capa de
carbono.
4º. Depositar una capa de metal pesado sobre la superficie de carbono para dar un
aspecto sombreado.
5º. Llevar la muestra a presión atmosférica normal y destruir el tejido por una
sustancia que no ataque el molde (ácido fuerte, hipoclorito sódico).
6º. Colocar la réplica en una rejilla de cobre y llevarla al ME.

RADIOAUTOGRAFIA
Se basa en el efecto de las radiaciones sobre las emulsiones fotográficas que contienen
bromuro de plata (microdetectores de radiactividad). Los cationes de plata que son
alcanzados por la radiación se transforman en plata metálica que aparece negra al
microscopio óptico (MO).
Fases:
1º. Inyectar el isótopo radiactivo al órgano en estudio.
2º. Poner un corte de órgano en contacto con la película de emulsión fotográfica.
3º. Dejar un período de exposición y revelar la película. Los puntos negros que
aparecen corresponden a los sitios del órgano que contienen el isótopo.

La cantidad de gránulos de plata es proporcional a la radiactividad presente y así
permite también la medida de la cantidad relativa de dicha sustancia.

a) Técnica de emulsión liquida:
- Se sumergen las preparaciones biológicas en la emulsión calentada y fundida.
- Retirar las láminas y queda sobre su superficie una fina película de emulsión.
- Secar y guardar al abrigo de la luz, generalmente a baja temperatura.
- Proceso de revelado semejante al usado para placas fotográficas en una cámara
oscura.
- Llevar al microscopio (ME ó MO).
b) Aplicaciones: con el uso de isótopos radiactivos de C, H, N, S, P, es posible marcar
las moléculas de numerosos compuestos que intervienen en el metabolismo. De esta
forma se localiza el proceso metabólico y su velocidad, como la secreción de gránulos
de zimógeno.

5. CITOMETRÍA DE FLUJO.

5.1. FUNDAMENTO
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente
células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El
impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a
diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos
convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán
digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma
célula.
En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden
estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula
única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo
continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como
consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que
típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:
1. Dispersión frontal de la luz a 2º (forward scatter), valor proporcional al tamaño
celular.
2. Dispersión de la luz ortogonal (sidescatter), proporcional a la cantidad de
estructuras granulares o complejidad de la célula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

5.2. ESTRUCTURA BÁSICA DE UN CITÓMETRO DE FLUJO
Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas:
A) El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta
conseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los separadores celulares o
“cellsorters”, se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para
conseguir la separación de células individuales.

B) Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido
para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente.

Este sistema se compone de dos tipos de ópticas:

- La óptica de excitación, compuesta de el láser y las
lentes apra enfocar y dirigir el haz de luz;
- La óptica de lectura, compuesta por las lentes de recolección de luz emitida luego de
la interacción entre el haz del láser y las partículas y el sistema de espejos y filtros
para direccionar longitudes de onda específicas hacia los detectores correspondientes.
Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que deja
pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
- DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);
- DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De éstos hay tres tipos:
- Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620 – 640
nm)
- Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda determinada (
Porej: < 575 nm)
- Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda determinada (Por
ej: > 520 nm)

C) El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de
fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue la
carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para poder
someterlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin, o sobre pocillos
de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por
cada muestra, y representar los resultados gráficamente.

5.3. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO
Básicamente podemos obtener los siguientes datos:
- El tamaño celular relativo ( ForwardScatter o FSC)
- La complejidad interna o granularidad relativa (SideScatter o SSC)
- Intensidades relativas de emisión de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3 ,FL4…..etc..)

A través de dos tipos de señales:
A) Señales de dispersión.
La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un
cambio de dirección (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del espacio.
Las características morfológicas que determinan la dispersión de la luz son
fundamentalmente el tamaño celular, la membrana, el núcleo y el material granular
del interior de la célula, llamado complejidad. En los Citómetros de Flujo se miden dos
fracciones de dispersión:
-La luz dispersada en ángulo cónico pequeño (0-10º) que casi coincide con la dirección
de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida proporcional al
tamaño de la partícula que produce la dispersión.
-La luz dispersada en ángulo recto llamada SSC (SideScatter). Es proporcional a la
complejidad de la estructura interna de la partícula.
(WWW.CITOMETRIADEFLUJO.COM)

B) Señales de Fluorescencia.
Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de
complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula,
siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la
cantidad de componentes fluorescentes de la partícula.
5.4. ANÁLISIS DE DATOS
En general todos los citómetros presentan los datos en algunos formatos standard.
- Histograma: según un parámetro.

- Gráficos de puntos: Cualquier combinación de dos parámetros de los datos obtenidos
para la población de células.

5.5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Debido a la necesidad de utilizar una suspensión de partículas (células, núcleos,
cromosomas, etc), para ser leídos de una en una hace que se pierda información sobre
la arquitectura de los tejidos que componen las células o de las propias células, así
como la ineracción entre estas y el medio que las rodea (patrones nodulares o difusos
de los linfomas). Frente a este inconveniente la CMF presenta múltiples ventajas frente
al microscópio de fluorescencia y las técnicas citoquímicas, como:
- Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoquímica y la
microscopia de fluorescencia.
- Posibilidad de analizar un elevado número de partículas en un corto período de
tiempo (5000 partículas/segundo).
- Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de fluorescencia.
- Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad mínima
residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en condiciones normales
como los basófilos.
- Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares.
- Permite almacenar informáticamente la información del análisis para poderla utilizar
en cualquier momento y reanalizar análisis hechos con anterioridad.
- Posibilidad de cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un grupo celular.
5.6. QUÉ DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CÉLULAS UTILIZANDO UN
CITÓMETRO DE FLUJO? A QUÉ VELOCIDAD?
La iluminación de las células con luz LASER nos permite conocer el tamaño y la
complejidad de los diferentes tipos de células. Si agregamos el uso de moléculas
fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. ácido desoxirribonucleico o
ADN, ácido ribonucleico o ARN, antígenos, etc.) se amplía enormemente sus
posibilidades de detección. Dichas sustancias fluorescentes, al ser iluminadas por la luz
LASER, emiten señales lumínicas en diferentes longitudes de onda (que son captadas
por diferentes detectores) con lo cual podemos obtener valiosa información de las
propiedades de una población celular. En un citómetro convencional logramos
información sobre al menos 5 parámetros (por ejemplo tamaño, complejidad,
contenido de ADN, viabilidad celular y presencia o ausencia de antígenos). Lo
interesante de esta metodología es que no sólo aporta muchos datos en forma
simultánea, sino que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz
de analizar al menos 1000 células en solamente un segundo!
Los citómetros de flujo de mayor complejidad son también capaces de clasificar a las
células que resulten de interés para el investigador. Entendemos por clasificar la

posibilidad de separar del resto a un conjunto de
células que comparten una o varias propiedades y recolectarlas
en un tubo, placa de cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios más
sofisticados de una población de células similares, iniciar cultivos de un mismo tipo
celular, etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separación de los
citómetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos tipos de
cromosomas de la especie humana u otras especies. La obtención de suspensiones
cromosómicas de elevada pureza mediante citometría de flujo ha permitido
formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la obtención de
sondas moleculares aplicables a diagnóstico citogenético de diversas patologías.
Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes tipos de
células o cromosomas excede los objetivos de esta introducción. Basta mencionar que
para lograrlo se fragmenta la columna líquida en pequeñas gotitas haciendo vibrar la
boquilla a más de 20.000 veces por segundo!. Luego de ajustes apropiados, se logra
que cada gotita contenga una célula o cromosoma. Cuando el citómetro detecta una
célula o cromosoma de interés para clasificar, el aparato carga eléctricamente la
columna liquida de forma tal que sólo la gota que contiene el evento de interés (célula)
queda cargada. Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la célula hacia un
tubo recolector al ser desviada por un intenso campo eléctrico.
5.7. QUÉ APLICACIONES TIENEN LOS CITÓMETROS DE FLUJO EN LA
INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA?
El campo de aplicación de este tipo de instrumentos crece rápidamente día a día ya
que son numerosas las áreas de la biología y medicina que se benefician de su uso.
Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificación de las leucemias y los linfomas
que permite alcanzar un diagnóstico preciso, permitiendo un tratamiento y
seguimiento más adecuado y eficaz. Otra aplicación muy importante es el estudio de
las poblaciones linfocitarias afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH) causante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite
conocer en los individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capital
importancia para el seguimiento de la evolución de la infección y el tratamiento
adecuado para el paciente.
El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas aplicaciones.
En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios genéticos en poblaciones de
células tumorales. La presencia de estos cambios tiene importancia en el prónostico de
la enfermedad maligna. Dado el elevado número de células a analizar para realizar
estos diagnósticos, el citómetro de flujo es la herramienta indicada para este tipo de
estudios. También es posible estimar si las células han sufrido cambios relevantes en
el ADN, así como evaluar su nivel de proliferación ya que con frecuencia las células
malignas crecen con mayor rapidez que las normales. El citómetro es capaz de
cuantificar el grado de proliferación celular, es decir la tasa con que las células se
multiplican. En el campo de la biología, la citometría de flujo se ha tornado el método
más empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada especie, lo cuál es
de suma importancia para estudios genéticos, evolutivos y biotecnológicos. A su vez,
se pueden realizar estudios del nivel de ploidia, análisis cromosómicos y estudios del
daño del ADN.

6. REACCIONES INMUNOENZIMÁTICAS.

Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una
reacción Ag-Ac específica, en la que el complejo inmune formado se mide por una
reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los
reactivos, en presencia del sustrato adecuado.

El ELISA se basa en dos supuestos:

- El Ag o el Ac se pueden unir a un soporte en fase sólida reteniendo su actividad
inmunológica.

- Tanto el Ag como el Ac pueden unirse a una enzima, y el conjugado mantiene tanto
su actividad inmunológica como enzimática.

Los métodos inmunoenzimáticos (ELISA) se han desarrollado en tres direcciones:

- Localizar los constituyentes celulares.

- Medición de pequeñas cantidades de componentes en los líquidos biológicos.

- Detección de precipitados inmunes inmovilizados sobre papeles de nitrocelulosa.

6.1. ENZIMOINMUNOANÁLISIS

El ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay) se basa en la reacción de un Ac o
de un Ag acoplado de forma covalente a una enzima, con un Ag o un Ac inmovilizado
(fijado sobre un soporte), para detectar finalmente la actividad enzimática con ayuda
de sustratos específicos. Tipos de ELISAs:

A) HOMOGÉNEOS: son en medio líquido y no se requiere la separación de los reactivos
. La reacción sigue la ley de acción de las masas.

A1) Ventajas:

Más precisos

En general automatizados, se llevan a cabo sin entrenamiento especial

A2) Desventajas:

Son más costosos en reactivos

En general sólo sirven para fármacos

B) HETEROGÉNEOS: se requiere separación entre el reactivo libre y el unido. Para ello,
el Ag o el Ac están inmovilizados. El reactivo complementario difunde hacia él y se le
une específicamente.

B1) Ventajas :

Menos interferencias, más específicos y sensibles

Instrumentación menos costosa

Admiten mayor tamaño de muestra, así disminuye el
límite de detección.

Más versátiles en cuanto a tipo de analito

B2) Desventajas :

Más difíciles de automatizar

Mayor tiempo de análisis

Los métodos de ELISA HETEROGÉNEOS dependiendo de la actividad enzimática se
dividen en dos tipos:

- – Competitivos: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el
conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de
color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima
porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

- – No competitivos: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que
está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-
anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato
desarrollando color.

Dentro de los no competitivos tenemos:

- – Los directos que detectan antígenos

- – Los indirectos que detectan anticuerpos.

6.2. PASOS GENERALES DE UN ELISA

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo

2. Todas las placas son sometidas a un tapizado con gelatina o albúmina sérica bovina,
que recubre las zonas en las que no se ha fijado el primer componente de la reacción
(Ag o Ac).

3. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos

4. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
posillo.

5. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido

6. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima

7. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo

8. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

9. Adición del sustrato

10. Unión del sustrato a la enzima

11. Generación de la señal. La última parte de un inmunoensayo en que la marca es
enzimática es la cuantificación de la enzima. Métodos de detección:

a) Espectrofotométrico o colorimétrico. Se mide la aparición de un cromóforo.

b) Fluorométrico- Se mide la aparición de un producto fluorescente

c) Quimioluminiscente- Se mide la aparición de un producto luminiscente.

12. Lectura del color en un lector de placas.

13. Cuantificación en ELISA: curvas standard

6.2.1. REACTIVOS QUE GENERAN COLOR.

Los reactivos utilizados suelen ser los mismos (peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-
glucosidasa, glucosa oxidasa) para todos los ELIASAs, con la diferencia del sustrato de
la enzima utilizada:

d) Puede generar productos coloreados y solubles que se miden por
espectrofotometría.

- En presencia de agua oxigenada, los cromógenos usados para la peroxidasa se
reducen y dan productos solubles y coloreados. Los sustratos son la o-dianazina, o-
fenilenodiamina (OPD), tetrametilbencidina (TMB), ácido- 2,2-acino-di-(3-
etil)benzatiazolina-6- sulfónico (ABTS).

- Cuando queremos un precipitado, se usa para revelar la reacción a la peroxidasa y
diaminobenzidina, que generan un precipitado de color café.

- La glucosa oxidasa reacciona con la glucosa y libera agua oxigenada que se detecta
por una mezcla de peroxidasa y un cromógeno. Sí queremos un precipitado, podemos
usar una sal de tetrazolio.

- La fosfatasa alcalina y la beta-glucosidasa utilizan como sustrato a
elparanitrofenilfosfato y el ortonitrofenil-beta–D-galactopiranosido, los cuales son
hidrolizados por la enzima y se libera el nitrofenol soluble.

- Puede generar precipitados coloreados insolubles y estables en el mismo lugar de la
enzima (ELISA-DOT y Western-blot sobre papel de nitrocelulosa) y localizar
constituyentes celulares (inmunohitoquímica).

6.3. TIPOS DE ELISAS

6.3.1. ELISA DIRECTO

Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos
que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina, …) pero en las
que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen

controles positivos (soluciones donde se encuentra el
antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

Consta de las siguientes etapas:

• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para
eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos
reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar
los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se
puede parar la reacción si se desea.

• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

6.3.2. ELISA INDIRECTO

Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles
positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos
: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La
detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la
unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más
popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario
marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de
antígenos.


• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de
estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición del suero problema, de tal forma que sus
anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a
los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.



6.3.3. ELISA SANDWICH

Ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de
un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-
antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en
la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el
primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido
se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues
cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad
y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

A) ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).


• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de
tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),
reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con
una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema
y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.



B) ELISA Sándwich “HADAS”.


• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de
tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),
reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.

• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se encuentran
fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan
reaccionado.

• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el
paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.



7. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN: Electroforesis.

7.1. ELECTROFORESIS.
Separación de proteínas del suero en función de su comportamiento en el campo
eléctrico.

La velocidad de las particulas depende de:

La carga de las mismas
La intensidad del campo eléctrico y
Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio

TIPOS DE ELECTROFORESIS

EQUIPO DE ELECTROFORESIS

Fuente de alimentación

Soporte para las tiras de acetato de celulosa

o Aplicador

o Cubeta y puente

o Las tiras de acetato de celulosa

o Reactivos

Se hace correr una alicuota de suero en un gel de agarosa y con tampón barbital (pH
8.4), en el que las Ig (con carga positiva) se desplazan hacia el cátodo. Después de
correr el gel, éste es fijado en una solución ácido-alcohol y se tiñe con un colorante de
proteínas, y por ultimo se hace un densitometrado. Es una técnica CUALITATIVA.

Sirve para:
- Detectar hipergammaglobulinemias.
- Calcular la fracción gamma.
- Detectar paraproteínas (componentes monoclonales) en el suero..
7.2. INMUNOELECTROFORESIS (IEF).

Prueba CUALITATIVA.
Método combinado de precipitación.

Precipitación por difusión.
Electroforesis de los antígenos de acuerdo a su carga.

Útil para determinar mezclas complejas de Ag o Ac (Ac´s monoclonales clásicas
en mieloma, linfomas).

En esta técnica, hay 5 fases:

1. Se prepara un gel de agarosa sobre un porta y se
hace un pocillo para el suero y un canalillo para el anticuerpo
específico.
2. Migración de antígenos por carga (Separación). Los Ag del suero se separan primero
en base a su carga eléctrica. El pH se elige de modo que unos Ags se carguen
positivamente y migren hacia el cátodo, y otros Agsse carguen negativamente y
migren hacia el ánodo.
3. Difusión. El canalillo se llena con el Ac específico y se deja reposar para conseguir la
difusión.
4. Formación del precipitado. Ag y Ac reaccionan y precipitan, formando arcos de
precipitación.
5. Interpretación de las bandas.

7.3. RADIOINMUNOELECTROFORESIS.
- Se marca radiactivamente los Ag y se hace una IEF; después se hace una
autorradiografía de las bandas obtenidas (se visualizan mejor).
- Es una prueba CUALITATIVA y/o semicuantitativa.
7.4. ELECTROINMUNODIFUSIÓN.
Consiste en acelerar la formación de la banda de precipitación por la acción de un
campo eléctrico. Con estas técnicas se detectan [Ag] de 20 mgr/ml y [Ac] de 20
mgr/ml. Estas técnicas se basan en que el Ag y el Ac tienen cargas diferentes al pH
seleccionado; puesto que la mayoría de los Ag tienen un pI bajo y los Ac alto. Si las
cargas sobre el Ag y Ag apenas difieren, se puede modificar la molécula químicamente.

7.4.1. ELECTROFORESIS DE CONTRACORRIENTE.

Es una IDD acelerada por el paso de una corriente
eléctrica. Es muy importante que la carga neta del Ag sea (-) y
Ac sea (+) y que sean colocados en el lugar adecuado en el campo eléctrico (que
viajen uno al encuentro del otro). Es una técnica CUALITATIVA.
La sensibilidad es de 10-20 veces mas que en el Mancini.
7.4.2. ELECTROINMUNODIFUSIÓN CUANTITATIVA O ELECTROFORESIS
ROCKET.
Es un Mancini acelerado por un campo eléctrico. El pH del gel se elige para que el Ac
tenga carga neutra y permanezca inmóvil, y el Ag tenga carga negativa y se desplace
hacia el ánodo.
En un extremo del gel se perforan los pocillos donde se pone el Ag a distintas
concentraciones. El Ag debe estar cargado negativamente para que se desplace hacia
el ánodo. El Ag difunde y se forman bandas de precipitación con forma de cohete
(cuanto menor es la concentración del Ag, menor es el tamaño del rocket). Es una
técnica CUANTITATIVA en la que se puede construir una curva estándar representando
altura frente a concentración de Ag.
7.4.3. ELECTROFORESIS CRUZADA DE LAUREL.
- Primero se hace una electroforesis para que los Ag se separen (como en la IEF).
- Después se corta una tira con el Ag separado y se aplica sobre otro gel que contiene
Ac específicos.
- Se hace una electroforesis cruzada como en la IEF.
- Se forman bandas de precipitación.
- Es una técnica CUALITATIVA con la que podemos reconocer Ag.
7.5. INMUNOFIJACIÓN.
7.5.1. CARACTERÍSTICAS
La inmunofijación es una técnica de laboratorio que permite el estudio de proteínas en
sangre y orina, específicamente la identificación de componentes monoclonales u
oligoclonales .
Las bandas anormales en las corridas electroforéticas de proteínas de sueros u orinas,
principalmente aquellas situadas en las fracciones de beta globulinas y de gamma
globulinas son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales, y por lo tanto son
un indicio de gammapatías monoclonales.

- La electroforesis seguida de inmunofijación es una técnica sencilla que permite que
una proteína sea retenida después de la electroforesis, in situ, mediante la formación
de un complejo insoluble con su anticuerpo. Es fácil de realizar (provee resultados en 2
o 3 horas) y permite lograr mayor sensibilidad que una inmunoelectroforesis, así como
una interpretación mas sencilla.
7.5.2. ESQUEMA DE LA TÉCNICA
La inmunofijación es una electroforesis de proteínas seguida de una inmovilización de
las mismas al enfrentarse a un antisuero específico formando un complejo insoluble
que luego se revela por coloración.
Se realiza en cuatro etapas:
1-Separación de proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa. Se separan las
proteínas plasmáticas en un gel de agarosa que tiene 5 calles, como en una
electroforesis normal.
2-Inmunofijación (inmunoprecipitación) de las proteínas separadas. Se hace una
incubación del gel con antisueros específico (IgM, IgG, IgA, cadenas kappa, cadenas
lambda) en cada calle del gel, durante 30 minutos a 30-40 ºC. Los carriles de
migración electroforética apropiados son recubiertos con los antisueros individuales,
los cuales difunden dentro del gel y precipitan los antígenos correspondientes cuando
estan presentes. Las proteínas del carril de referencia son fijadas con una solución
fijadora.
3-Prensado y lavado. Las proteínas solubles no precipitadas se eliminan del gel
mediante un blotting y un lavado. La precipitación del complejo antígeno-anticuerpo
queda fijada en la matriz del gel.
7.5.3. GAMMAPATÍAS MONOCLONALES
El componente monoclonal, llamado también paraproteína o disglobulinemia o
gammapatía monoclonal, se refiere a una producción excesiva de un tipo de
inmunoglobulina. El aumento en la proliferación de un clon específico de linfocitos B
hiperestimulados o malignos genera una población homogénea de inmunoglobulina
monoclonal.
Tipos de gammapatías monoclonales:
I.- MALIGNAS:

1. Mieloma Múltiple
2. Variantes de Mieloma:
- Mieloma Quiescente
- Mieloma No Secretor
- Leucemia de Células Plasmáticas
- POEMS
3. Plasmocitomas localizados
- Plasmocitoma Óseo Solitario
- PlasmocitomaExtramedular
4. Macroglobulinemia de Waldenström
5. Amiloidosis Primaria
II.- NO MALIGNAS:
1. Gammapatía Monoclonal de Significado Indeterminado
2. Gammapatías secundarias
7.5.4. TIPOS DE COMPONENTES MONOCLONALES
- Hiperproducción selectiva de inmunoglobulina monoclonal ( G,A,M y en menor
frecuencia D y E), componente monoclonal que puede ser benigno o maligno.
- Hiperproducción de cadenas livianas libres monoclonales (aproximadamente el 5% de
los casos).Esto es el incremento excesivo en la biosíntesis de cadenas livianas Kappa o
Lambda libres. Dicha anormalidad es encontrada exclusivamente en mieloma de
cadenas livianas maligno, generalmente asociado a hipogammaglobulinemia (GAM).
- Hiperproducción de cadenas pesadas libres o llamada también enfermedad de
cadenas pesadas

8. ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO Y LA CLÍNICA.

8.1. USOS DIAGNÓSTICOS Y TERAPÉUTICOS DE LOS ANTICUERPOS
Técnicas analíticas/diagnósticas: miden generalmente fuera del organismo por técnicas
“in vitro” algún parámetro

ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad
WESTERN inmunoelectroforesis de proteínas, inmunodetección
IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias, anatomía patológica
NEFELOMETRIA turbidometría, determinación Ig séricas
CITOMETRIA DE FLUJO Diagnóstico de leucemias

Técnicas terapéuticas: diseñadas para curar.

Tratamiento antineoplásico destrucción células tumorales
Tratamientos antiinflamatorios. Neutralización de mediadores proinflamatorios
Inmunoestimulación con citocinas o vacunación con antígenos

8.2. USO DE ANTICUERPOS EN EL LABORATORIO

Fundamento: Pueden ser utilizados como nanoherramientas capaces de
reconocer específicamente y a las que nosotros podemos sujetar, localizar o
medir.
Especificidad en el reconocimiento aportada por la región Fab del anticuerpo.
Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico, fluorescente, con puente
biotina-avidina. Detección y medida.
Unión a soportes (magnéticos o de plástico) por región Fc. Separación y
purificación molecular y celular.

8.3. TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES
1.- ANTITUMORAL.
a) CONJUGADOS:
- RADIOCONJUGADOS (Fósforo, Estroncio, Yodo, Ytrio)
I-antiCD45 leucemias mieloides agudas
Zevalin antiCD20 de ratón vida corta Itrio 90
Bexxar antiCD20 de ratón Iodo131

- QUIMIOCONJUGADOS.

AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicina (CMA-676) produce especies
altamente reactivas que dañan el DNA e inducen apoptosis. El antígeno CD33 se
endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33. Se emplea en leucemias
mieloides agudas.
AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.

b) NO CONJUGADOS:
- ACCIÓN ANTITUMORAL

AntiCD20 (Rituximab) para linfomas y Leucemias de células B.
AntiCD52 (Campath 1H) tumores de células B, enfermedad mínima residual,
rechazo de órganos e injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes.
AntiCD40 induce AICD en linfomas.

- SELECTIVA. Conjugados con partículas magnéticas.

AntiCD34 para purificación de células madre hematopoiéticas (CD34+) por
selección inmunomagnética.
Permite purificar células madre a partir de sangre periférica.

- ELIMINACIÓN DE CÉLULAS.

2.- TERAPIA ANTI-INFLAMATORIA.
- Anticuerpos anticitocina Anti-TNFaInfliximab

Neutralizan mediadores proinflamatorios
Tienen un efecto drástico efecto antiinflamatorio
Se usan en Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

- Receptores solubles de TNF Etanercep

También neutralizan TNF pero tienen vida más corta.

- Quimeras con región Fc. IgG. alargan vida media del receptor soluble

9. IDENTIFICACIÓN, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CÉLULAS

9.1. FACS (FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)
• Anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son reconocidos en la superficie de
cada célula.
• Células de los fenotipos seleccionados son reconocidas una a una y separadas en
función de las combinaciones de parámetros seleccionados.
• Aplica un campo eléctrico que desvía trayectoria de caída de la célula hacia el
contenedor de fracción deseado.
• Se pueden clonar células de características específicas:
• Características Metabólicas de las Células: Nivel de pH, estado redox, nivel de calcio
• Separación de células que expresan un gen reporter (proteínas fluorescentes)

• Separación de poblaciones celulares en función de
expresión de diferentes antígenos (intra o extracelulares) a los
que se unen anticuerpos con marcaje fluorescente.
• Separación de poblaciones celulares en función de su tamaño y complejidad interna
Contenido de ADN: Estudio de la fase de ciclo celular en la que se encuentra la célula
• Separación de células que han iniciado el proceso de muerte por apoptosis, de
células viables y células necróticas

9.2. MÉTODOS DE FASE SÓLIDA
Fijación de anticuerpos por su región Fc a una fase sólida.
Panning: Se realiza la fijación de los Ab a plástico. Las células portadoras del antígeno
se unen al soporte, después se realiza un lavado y por último la separación mecánica o
química.

9.3. MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)
- El sistema autoMACS (MiltenyiBiotec) permite la separación automatizada de células
mediante bolas paramagnéticas adheridas a la superfície celular mediante anticuerpos
monoclonales.
- Anticuerpos unidos a micropartículas magnéticas son retenidos en una matriz
ferromagnética (fase sólida) cuando se aplica un campo magnético. Lavado y elución
por eliminación del campo magnético.
- Tiene capacidad para separar hasta 4 x 109 células en 5 minutos y realizar diferentes
procesos de separación secuencialmente, con un enriquecimiento de la subpoblación
inicial de hasta 10.000 veces.

9.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ANTICUERPOS.
- Este método está basado en la especificidad de la interacción de los anticuerpos
monoclonales que se unen a antígenos de la superficie celular.
- Posteriormente, se adiciona un suero sin descomplementar. El compelemto se activa
y hay eliminación de una subpoblación que lleva un antígeno de membrana específico.

10. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.

10.1. TÍTULO DE ANTICUERPOS.
El título de Ac es la mayor dilución que da una respuesta POSITIVA. El método de
evaluación puede ser midiendo la absorbancia a través de la densidad óptica (DO), o
sea una DO mayor a la línea de corte.

10.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIÓN.

Prueba utilizada para detectar inmunidad frente a virus.
La neutralización (Nt) mide actividad biológica del virus por lo tanto requiere de
virus vivos para poder realizarse. Igualmente, se realiza en un sistema vivo.
El principio básico de la prueba de Nt es la inhibición (neutralización) de la
infección viral a la célula (cultivo o animal) por medio de los Acs específicos, por
lo tanto se neutraliza la acción del virus sobre el hospedero.

Lectura de la placa

10.3. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.
Hay precipitación de Ag y Ac cuando se combinan en proporciones de equivalencia o
cercanas a ella. Estos métodos se utilizan para examinar la relación entre diferentes Ag
y/o Ac.

La precipitación se efectúa sobre geles de agarosa.

10.1. INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID) O TÉCNICA DE MANCINI.
- Método de cuantificación de antígenos.
- Útil en inmunología clínica para cuantificar fracciones plasmáticas humanas como
ASH, Inmunoglobulinas, C3 y C4, factores de coagulación.
Esquema de la técnica:
- Placa de gel de agar con suero específico en la matriz. Se incorpora el Ac específico
en el gel de agarosa.
- Se hacen pocillos en el gel de agarosa y en ellos se depositan volúmenes estándar de
suero con el Ag que se quiere detectar (Ig o proteínas plasmáticas).

- Fenómeno de difusión. Se deja en reposo 24 horas para que difunda y reaccionen Ag
y Ac (punto de equivalencia), formando un anillo de precipitación.

- Cuantificar. Se mide el diámetro del anillo. Halo
proporcional a la conc. de antígeno. Es una prueba
CUANTITATIVA.
- Para el calculo de resultados hay que construir una curva patrón a partir de unos
estándares que se ponen en el gel junto con las muestras problemas. Se representa
gráficamente el cuadrado del diámetro del anillo frente a la concentración de Ag.
- Se interpola en la curva el valor de cada muestra.

10.3.2. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO I (IDD-I).

- Prueba CUALITATIVA.
- Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-
8.5).
- Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.
- Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y sí las concentraciones son
adecuadas, se produce una banda de precipitación.
- Si en la solución existen dos Ag reconocidos por el Ac, habrá dos bandas.
- Se puede usar azul cromassie para teñir las bandas.

10.3.3. INMUNODIFUSIÓN DOBLE TIPO II (IDD-
II) U OUCHTERLONY.
También es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).

Se puede utilizar para determinar la relación Ag/Ac (prueba CUALITATIVA). Se
enfrenta a un suero con dos o más Ag, y nos podemos encontrar con tres patrones
básicos:
a) Identidad (los dos Ag tienen los mismo epitopos reconocidos por el suero): se forma
una banda de precipitación con forma de arco continuo.

b) No identidad (se trata de Ag distintos): se forman bandas de precipitación
independientes y no dan un arco continuo. Aparece una figura con forma de aspa.

c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo, pero uno de ellos tiene un
epitopo extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitación al que
le sale un espolón.

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