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Br. Leomar Palacios
• El nombre enzyme-liked immunosorbent assay,
  luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los
  investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann,
  los cuales describieron el procedimiento, publicado
  en 1971.
• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el
  campo de la microbiología y parasitología.
Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.

• Se considera ligado a enzima porque una enzima
  se une químicamente a un anticuerpo en las dos
  versiones de la prueba (indirecta y directa)
• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que
  los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un
  plástico.

ELISA puede investigar la presencia de un antígeno
               o de un anticuerpo.
DEFINICIÓN
   • El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos
    marcados con una enzima, de forma que los conjugados
    resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
                          enzimática.

• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo)
  marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
    (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
  quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
        mediante la adición de un substrato especifico

• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a
       simple vista o cuantificable mediante el uso de un
               espectrofotómetro o un colorímetro.
• Los antígenos son, por definición, generadores de
  anticuerpos.
• Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas
  pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.
• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen
  como <no propias> o extrañas, para el organismo.
• Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de
  identificación
•   Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente
    infeccioso.
•   Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los
    plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos
    correspondientes.
•   Anticuerpos se caracterizan por:
           – Ser Defensa natural
           – Tener Utilidad terapéutica
           – Tener Utilidad Diagnóstica
                      Marcador de Infección o exposición.
                      Detección de antígenos
•   Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen
    monoclonal o policlonal.
• Anticuerpos Policlonales
     Heterogéneos
     Reconocen epítopes diferentes del Ag
     Producidos por numerosos clones de
     Linfocitos B
• Anticuerpos Monoclonales
     Homogéneos
     Especificidad única
     Producidos por un único clon de
     Linfocitos B
Se utilizan para asegurar que la prueba
esta funcionando correctamente

• Control POSITIVO
       Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando
así, un patrón sobre el cual basar los
resultados.

• Control NEGATIVO
       Incluyen sustancias que no deben
reaccionar .
Ag o Ac    Ag o Ac   Conjugado:
fijado a   en la     Ac unido a   SUSTRATO
una fase   Muestra   ENZIMA
Sólida

                                    CAMBIO
                                      DE
                                    COLOR
•   FASE SÓLIDA
•   Antígeno o Anticuerpo
•   Conjugado: ENZIMA
•   SUBSTRATO
SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas
  electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs:
  poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
  silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos:
  acrilamida, celulosa y isoticianato
• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y
  el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades
  adsortivas.
La enzima escogida como marcador debe:

          • Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
       • Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
•   Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de
                           fácil preparación.




                                        Las enzimas más utilizadas
                                           son fosfatas alcalina,
                                        peroxidasa de rábano y ß-
                                               galactosidas
La elección del substrato es de gran importancia para
la estandarización del método ELISA y hay que tener
         varios factores en cuenta, como son
 sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así
           como estabilidad después de la
                       reacción.


                        Requerimientos del sustrato

                        •   Solubles en agua
                        •   Fácil de manipular
                        •   No tóxicos, no mutagénicos
                        •   Bajo costo
Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimática se dividen en dos tipos:

•   Competitivos
•   No competitivos

•   ELISA COMPETITIVO:

          En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir
con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del
antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a
que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
• ELISA NO COMPETITIVO:

      Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o
    anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es
    positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
      agregar el conjugado reaccionará con el respectivo
                   sustrato desarrollando color

           Dentro de los no competitivos tenemos:

•     Los directos que detectan antígenos
•     Los indirectos que detectan anticuerpos
• Si la prueba se diseña para
  detectar un antígeno, es un ELISA
  DIRECTO porque esta buscando
  directamente, como su nombre lo
  dice, la sustancia extraña.
• En       cambio,      un     ELISA
  INDIRECTO, por su parte, se
  diseña      para    detectar    los
  anticuerpos que el paciente ha
  creado contra el antígeno
El sistema de detección emplea dos
 anticuerpos: uno primario contra el
 antígeno y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene
mayor sensibilidad por presentar una
  amplificación de señal debida a la
   unión de dos o más anticuerpos
    secundarios por cada primario.
Materiales Orgánicos

•   Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)
•   Antígenos
•   Anticuerpos
•   Enzimas

         Materiales No Orgánicos

• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo
  ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
  anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los
  antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
  reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al
  soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que
  no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los
  cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en
  el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos.
  Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
  hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la
  enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
Prueba ELISA Indirecta




Leyenda
                       Anticuerpo
  Antígeno
                    Ligado a Enzima
  Anticuerpo
                       Sustrato
   Primario
• Detección de antígenos o anticuerpos:

       Virus
       Hongos
       Parásitos
       Bacterias.

• Detección de autoanticuerpos:

       IgG(Factor reumatoideo)
       DNA
       Proteína del núcleo
• Medición de Hormonas:

Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testoster
ona, gonadotropina coriónica humana, TSH.

• Detección de antígenos tumorales:

        Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína
        Antígeno del ovario
        Antígeno carcinoembrionario
• En estudios serológicos, hematológicos,
  endocrinológicos, oncológicos, en los
  transplantes, la medicina forense y la
  antropología.
• Con propósitos médicos se han aplicado en
  la determinación de hormonas y proteínas
  plasmáticas, antígenos tumorales, drogas,
  Ag y Ac de microorganismos (parásitos,
  hongos, bacterias, virus)
• Los     resultados     aportan elementos
  diagnósticos,     información  de     una
  enfermedad y coadyudan en la planificación
  del tratamiento

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  • 2. • El nombre enzyme-liked immunosorbent assay, luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann, los cuales describieron el procedimiento, publicado en 1971. • Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el campo de la microbiología y parasitología.
  • 3. Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas. • Se considera ligado a enzima porque una enzima se une químicamente a un anticuerpo en las dos versiones de la prueba (indirecta y directa) • El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un plástico. ELISA puede investigar la presencia de un antígeno o de un anticuerpo.
  • 4. DEFINICIÓN • El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. • Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico • El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
  • 5. • Los antígenos son, por definición, generadores de anticuerpos. • Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos. • Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen como <no propias> o extrañas, para el organismo. • Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de identificación
  • 6. Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente infeccioso. • Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes. • Anticuerpos se caracterizan por: – Ser Defensa natural – Tener Utilidad terapéutica – Tener Utilidad Diagnóstica Marcador de Infección o exposición. Detección de antígenos • Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal.
  • 7. • Anticuerpos Policlonales Heterogéneos Reconocen epítopes diferentes del Ag Producidos por numerosos clones de Linfocitos B • Anticuerpos Monoclonales Homogéneos Especificidad única Producidos por un único clon de Linfocitos B
  • 8. Se utilizan para asegurar que la prueba esta funcionando correctamente • Control POSITIVO Incluyen una sustancia que se sabe que reaccionara positivamente, proporcionando así, un patrón sobre el cual basar los resultados. • Control NEGATIVO Incluyen sustancias que no deben reaccionar .
  • 9. Ag o Ac Ag o Ac Conjugado: fijado a en la Ac unido a SUSTRATO una fase Muestra ENZIMA Sólida CAMBIO DE COLOR
  • 10. FASE SÓLIDA • Antígeno o Anticuerpo • Conjugado: ENZIMA • SUBSTRATO
  • 11. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS • Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs: poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y silicona. • Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato • Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades adsortivas.
  • 12. La enzima escogida como marcador debe: • Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, • Encontrarse en estado puro a un precio razonable y • Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina, peroxidasa de rábano y ß- galactosidas
  • 13.
  • 14. La elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así como estabilidad después de la reacción. Requerimientos del sustrato • Solubles en agua • Fácil de manipular • No tóxicos, no mutagénicos • Bajo costo
  • 15. Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimática se dividen en dos tipos: • Competitivos • No competitivos • ELISA COMPETITIVO: En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
  • 16. • ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color Dentro de los no competitivos tenemos: • Los directos que detectan antígenos • Los indirectos que detectan anticuerpos
  • 17. • Si la prueba se diseña para detectar un antígeno, es un ELISA DIRECTO porque esta buscando directamente, como su nombre lo dice, la sustancia extraña. • En cambio, un ELISA INDIRECTO, por su parte, se diseña para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antígeno
  • 18. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.
  • 19. Materiales Orgánicos • Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.) • Antígenos • Anticuerpos • Enzimas Materiales No Orgánicos • Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ. • Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
  • 20. • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. • Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
  • 21. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
  • 22. Prueba ELISA Indirecta Leyenda Anticuerpo Antígeno Ligado a Enzima Anticuerpo Sustrato Primario
  • 23. • Detección de antígenos o anticuerpos: Virus Hongos Parásitos Bacterias. • Detección de autoanticuerpos: IgG(Factor reumatoideo) DNA Proteína del núcleo
  • 24. • Medición de Hormonas: Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testoster ona, gonadotropina coriónica humana, TSH. • Detección de antígenos tumorales: Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario
  • 25. • En estudios serológicos, hematológicos, endocrinológicos, oncológicos, en los transplantes, la medicina forense y la antropología. • Con propósitos médicos se han aplicado en la determinación de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parásitos, hongos, bacterias, virus) • Los resultados aportan elementos diagnósticos, información de una enfermedad y coadyudan en la planificación del tratamiento