Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
Radioinmunoensayo, ELISA y Western BlotBryan Priego
A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte.
El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich.
En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo.
En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno.
En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno.
En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección.
El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección.
El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia.
Twitter.com/@bryanpriegop
Parte 01 del Módulo IV del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Dr. Carlos Esquerre Aguirre
Fecha: 13 de Setiembre de 2015. Trujillo - Perú.
Parte 3.2 del Módulo VI del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Mblgo. José Chafloque Chafloque
Fecha: 25 de Octubre de 2015. Trujillo - Perú.
Parte 01 del Módulo IV del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Dr. Carlos Esquerre Aguirre
Fecha: 13 de Setiembre de 2015. Trujillo - Perú.
Parte 3.2 del Módulo VI del Diplomado en Hematología y Banco de Sangre.
Ponente: Mblgo. José Chafloque Chafloque
Fecha: 25 de Octubre de 2015. Trujillo - Perú.
La prueba ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica utilizada para detectar la presencia de anticuerpos o antígenos en una muestra biológica. Se basa en la unión de un anticuerpo específico a un antígeno, seguido de la unión de una enzima a dicho anticuerpo. La reacción enzimática produce un cambio de color que indica la presencia del anticuerpo o antígeno de interés.
Es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algún otro tipo.
2. • El nombre enzyme-liked immunosorbent assay,
luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los
investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann,
los cuales describieron el procedimiento, publicado
en 1971.
• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el
campo de la microbiología y parasitología.
3. Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.
• Se considera ligado a enzima porque una enzima
se une químicamente a un anticuerpo en las dos
versiones de la prueba (indirecta y directa)
• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que
los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un
plástico.
ELISA puede investigar la presencia de un antígeno
o de un anticuerpo.
4. DEFINICIÓN
• El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima, de forma que los conjugados
resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática.
• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo)
marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico
• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.
5. • Los antígenos son, por definición, generadores de
anticuerpos.
• Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas
pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.
• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen
como <no propias> o extrañas, para el organismo.
• Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de
identificación
6. • Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente
infeccioso.
• Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los
plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos
correspondientes.
• Anticuerpos se caracterizan por:
– Ser Defensa natural
– Tener Utilidad terapéutica
– Tener Utilidad Diagnóstica
Marcador de Infección o exposición.
Detección de antígenos
• Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen
monoclonal o policlonal.
7. • Anticuerpos Policlonales
Heterogéneos
Reconocen epítopes diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de
Linfocitos B
• Anticuerpos Monoclonales
Homogéneos
Especificidad única
Producidos por un único clon de
Linfocitos B
8. Se utilizan para asegurar que la prueba
esta funcionando correctamente
• Control POSITIVO
Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando
así, un patrón sobre el cual basar los
resultados.
• Control NEGATIVO
Incluyen sustancias que no deben
reaccionar .
9. Ag o Ac Ag o Ac Conjugado:
fijado a en la Ac unido a SUSTRATO
una fase Muestra ENZIMA
Sólida
CAMBIO
DE
COLOR
10. • FASE SÓLIDA
• Antígeno o Anticuerpo
• Conjugado: ENZIMA
• SUBSTRATO
11. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas
electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos:
acrilamida, celulosa y isoticianato
• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y
el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades
adsortivas.
12. La enzima escogida como marcador debe:
• Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
• Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de
fácil preparación.
Las enzimas más utilizadas
son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rábano y ß-
galactosidas
13.
14. La elección del substrato es de gran importancia para
la estandarización del método ELISA y hay que tener
varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así
como estabilidad después de la
reacción.
Requerimientos del sustrato
• Solubles en agua
• Fácil de manipular
• No tóxicos, no mutagénicos
• Bajo costo
15. Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimática se dividen en dos tipos:
• Competitivos
• No competitivos
• ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir
con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del
antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a
que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
16. • ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o
anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es
positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará con el respectivo
sustrato desarrollando color
Dentro de los no competitivos tenemos:
• Los directos que detectan antígenos
• Los indirectos que detectan anticuerpos
17. • Si la prueba se diseña para
detectar un antígeno, es un ELISA
DIRECTO porque esta buscando
directamente, como su nombre lo
dice, la sustancia extraña.
• En cambio, un ELISA
INDIRECTO, por su parte, se
diseña para detectar los
anticuerpos que el paciente ha
creado contra el antígeno
18. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el
antígeno y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene
mayor sensibilidad por presentar una
amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos
secundarios por cada primario.
19. Materiales Orgánicos
• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)
• Antígenos
• Anticuerpos
• Enzimas
Materiales No Orgánicos
• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo
ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
20. • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los
antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al
soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que
no hayan reaccionado.
21. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los
cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en
el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos.
Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la
enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
23. • Detección de antígenos o anticuerpos:
Virus
Hongos
Parásitos
Bacterias.
• Detección de autoanticuerpos:
IgG(Factor reumatoideo)
DNA
Proteína del núcleo
24. • Medición de Hormonas:
Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testoster
ona, gonadotropina coriónica humana, TSH.
• Detección de antígenos tumorales:
Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína
Antígeno del ovario
Antígeno carcinoembrionario
25. • En estudios serológicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, en los
transplantes, la medicina forense y la
antropología.
• Con propósitos médicos se han aplicado en
la determinación de hormonas y proteínas
plasmáticas, antígenos tumorales, drogas,
Ag y Ac de microorganismos (parásitos,
hongos, bacterias, virus)
• Los resultados aportan elementos
diagnósticos, información de una
enfermedad y coadyudan en la planificación
del tratamiento