Ef gel

1. Electroforesis en gel
de agarosa

2. Agarosa
► La agarosa se extrae de algas marinas y se presenta como un polímero lineal.
► Comercialmente no se encuentra pura, por lo que resulta común encontrar
trazas de polisacáridos, sales y proteínas.
► Es utilizado ampliamente en el laboratorio como soporte para la separación
de ADN y ARN.
► El polímero lineal agarosa forma cadenas, que crean fibras flexibles y dan
lugar a una red de canales con diámetros comprendidos entre 50 nm y 200
nm, dependiendo de la cantidad de agarosa utilizada.

3. El ADN total extraído de la célula, puede utilizarse en una gran variedad de técnicas
moleculares, en las cuales mediante el uso de enzimas de restricción se generan cortes
en sitios específicos del ADN y se generan pequeños fragmentos de ADN. Posteriormente
estos fragmentos pueden ser visualizados y separados de acuerdo a su tamaño debido
a la carga negativa del ADN.
Los ácidos nucleicos migran hacia el ánodo (polo positivo) a través del gel al aplicarse a
este una diferencia de voltaje.
Otra aplicación de la EF es que luego de la realización de la técnica de PCR, se evalúa la
presencia del material amplificado mediante una EF en gel de agarosa.

4. ¿De qué depende la movilidad de un ácido
nucleico en el gel de agarosa?
Tamaño de la molécula: Las moléculas más grandes son retenidas (más cerca del punto de
siembra) y las de menor tamaño molecular pasan con mayor facilidad a través de los poros
del gel y se van alejando del punto inicial de corrida.

5. Porosidad del gel: Existe una relación inversa entre la concentración utilizada y el poro del
gel obtenido. Es decir, que a mayor concentración de agarosa, resulta menor el tamaño del
poro, lo cual ayuda a discriminar un amplio rango de moléculas de ADN.
Conformación del ácido nucleico: El ADN puede presentar conformaciones diferentes:
circular superenrollada, lineal, circular con rupturas en sus cadenas. Cada una de estas
formas presenta diferentes tasas de migración a través del gel.

6. Voltaje aplicado: la tasa de migración de los fragmentos de ADN es proporcional al voltaje
aplicado. El voltaje típico para correr un gel de agarosa para ADN está en el intervalo de
80-120V.
● Un voltaje más alto hará que las muestras corran más rápido.
● Un voltaje más bajo hará que las muestras corran más lentamente (lo que puede ser
conveniente si quieres que termine en un momento determinado, digamos, después de
regresar de comer).
Sin embargo, cuando el voltaje aumenta, la movilidad de los fragmentos de gran tamaño
molecular se incrementa. Así, la resolución decrece cuando se aumenta el voltaje.
Temperatura: En geles de agarosa corridos a una temperatura entre 4° y 30° la movilidad
relativa de diferentes tamaños de fragmentos no cambia. En forma general estos se corren
a temperatura ambiente.
Sin embargo, geles por debajo de 0,5% (poco concentrados) se recomienda correrlos a 4°C.

7. Las soluciones buffer usadas
para la preparación del gel y
la corrida se realizan a partir
de soluciones concentradas y
almacenadas a T° ambiente.
Composición del Buffer de corrida: La movilidad electroforética del ADN resulta afectada
por la composición y fuerza iónica del buffer de corrida.
Los iones permiten que el buffer tenga conductividad
En ausencia de iones, la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra muy
lentamente.
En buffers con muy baja fuerza iónica la conductividad eléctrica es muy deficiente
(logrando generar una gran cantidad de calor). En algunos casos el gel se funde y el ADN se
desnaturaliza.

8. Aparatos usados para una electroforesis
en gel de Agarosa
► Un equipo de corrida que incluye una fuente de poder (para generar corriente
eléctrica)
► La muestra (ADN, ARN o Proteína)
► El medio de soporte (gel)
► El buffer de corrida (medio líquido con buena conductividad eléctrica)
► Un sistema de detección (tinción)

9. Revelado – Detección
► En un laboratorio de investigación convencional donde se realizan
electroforesis de ADN, este se visualiza mediante el uso del Bromuro de
Etidio, el cual tiene la capacidad de incorporarse dentro de la doble cadena
de ADN (puede adicionarse durante la preparación del gel o una vez finalizada
la corrida) y luz UV.
► Sin embargo, tanto el BrEt como la luz UV son altamente peligrosos para la
salud humana.
SYBR SAFE

10. Con Bromuro de Etidio
Con SYBR Safe