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Enzimas (mecanismo, cinética y regulación).
- 1. 2011 Enrique Castro 1 Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original 2011 Enrique Castro 2 Propiedades de los enzimasPropiedades de los enzimas ➢Proteínas • Ribozimas son excepción ➢Catalizadores • No alteran la posición del equilibrio (Keq , ΔG) ➢Especificidad • Una única reacción • Sin reacciones colaterales • No absoluta: varios sustratos ➢Eficacia • Aceleran enormemente la velocidad de reacción ➢Estereoselectivas • Complementariedad 3D Papaína: inespecífica Tripsina: muy específica (R,K) Trombina: absolutamente específica (R en secuencia definida) DHAP Dihidroxiacetona-fosfato GA3P L-gliceraldehído-3-fosfato
- 2. 2011 Enrique Castro 3 Nomenclatura y clasificación de enzimasNomenclatura y clasificación de enzimas ➢Clases • ➢Subclases • 1: Oxidoreductasas • H: Deshidrogenasas • O2 : Oxigenasas (mono-, di-) 2: Transferasas • P: quinasas • NH2 : aminotransferasas (transaminasas) • Ac: acetil-transferasas D-Glucosa + ATP D-Glucosa-6-P + ADP Hexoquinasa ATP:glucosa fosfotransferasa EC 2.7.1.1 2: Transferasa 7: Fosfotransferasa 1: grupo aceptor -OH 1: compuesto aceptor 2011 Enrique Castro 4 Componentes adicionales: CofactoresComponentes adicionales: Cofactores ➢Cofactor • No proteico, termoestable, bajo Mrr • Unido permentemente • Ión metálico esencial para catálisis ➢Coenzima • Molécula orgánica esencial para catálisis • Unión transitoria: co-sustrato Covalente: grupo prostético Holo-enzima = apo-enzima + cofactor Cofactores aportan reactividad química especial Xantina oxidasa
- 3. 2011 Enrique Castro 5 Curvas de progreso de reacciónCurvas de progreso de reacción A P k1 k-1 Keq v = − d [ A] dt = d [P] dt = k1⋅[ A] − k−1⋅[P] veq = k1⋅[ A]eq − k−1⋅[ P]eq =0 ; Keq= k1 k−1 = [P]eq [ A]eq En el equilibrio no hay más reacción neta: vA→P = vP→A ➢Velocidad inicial • Elimina dependencia de [P] v0 =− d [ A]0 dt = d [P]0 dt = k1⋅[ A]0 − k−1⋅[P]0 v0 = k1⋅[ A]0 [P]0 =0 Constante de velocidad Ecuación de velocidad Curva exponencial [ A]=[ A]0⋅e−kt v0 v0 2011 Enrique Castro 6 Velocidad y orden de reacciónVelocidad y orden de reacción ➢Reacciones de orden 0 • No depende de [A] ➢Reacciones de 1er orden (orden 1) • Dependencia lineal de [A] ➢Reacciones de 2º orden (orden 2) • Reacciones bimoleculares reales A P k v0= d [ P] dt = k v0= −d [ A] dt =k⋅[ A] ln [ A] [ A]0 =−kt ; [ A]=[ A]0⋅e−kt [k] = M·s-1 A P k [k] = s-1 A + B P k 2 A P k v0= d [ P] dt = k⋅[ A][ B] v0= d [P] dt = k⋅[ A]2 [k] = M-1 ·s-1 Pseudo 1er orden • [B] constante (ej. Agua) • Etapa limitante monomolecular v0= d [ P] dt =k [ B]⋅[ A]=k '⋅[ A] k '=k [B] A + A A + A* k A* P k' k>>k'
- 4. 2011 Enrique Castro 7 Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas 2011 Enrique Castro 8 Energía de activación y catálisisEnergía de activación y catálisis GS P= G 0 RT ln [P] [S ] G0 =−RT⋅lnK eq k = kB T h ⋅e G ‡ RT Catalizador reduce ΔG‡ sin afectar a ΔGO N i N = gi Z ⋅e Ei k B T Ecuación de Eyring Distribución de Boltzmann Keq , ΔGº indican dirección de la reacción NO indican si ocurre rápidamente ΔG‡ indica velocidad de la reacción
- 5. 2011 Enrique Castro 9 Centro activoCentro activo ➢Región catalítica especializada • Hendidura 3D superficial (unión S) • Volumen reducido ➢Microentorno único • Agua excluída (salvo reactiva) • pKa especiales ➢Multiplicidad de enlaces débiles • Energía de unión alta (15-50 kJ·mol-1 ) • Kd baja (10-2 -10-9 M) ➢Especificidad=complementariedad • Forma 3D complementaria E-S • Enlace direccionales • Llave en cerradura / Ajuste inducido Centro activo de Lisozima Proteína = andamiaje para centro activo en posición Unión de sustrato a RNasa 2011 Enrique Castro 10 Mecanismos generales de catálisis (1)Mecanismos generales de catálisis (1) ➢Estabilización del estado de transición • Desolvatación del sustrato (sustituye por unión ES) • Distorsión del sustrato (“tensión” similar a TS) • Alineamiento de grupos catalíticos • Reducción de entropía de reactivos Estado de transición Energía de unión: ΔH: Múltiples enlaces débiles E-S ΔS: Alineamiento adecuado La energía de unión ΔGB reduce la energía de activación ΔG‡
- 6. 2011 Enrique Castro 11 Catálisis: unión al estado de transiciónCatálisis: unión al estado de transición 2011 Enrique Castro 12 Efectos entrópicos: alienamiento de gruposEfectos entrópicos: alienamiento de grupos ΔG=ΔH – TΔS Reducción de ΔS requiere inversión en ΔH ΔH: Red de enlaces débiles E-S
- 7. 2011 Enrique Castro 13 Mecanismos generales de catálisis (2)Mecanismos generales de catálisis (2) ➢Catálisis ácido-base general • Aporte/secuestro de H+ o pares e- • Ionización de grupos • Ataques nucleofílicos a >C=O ➢Catálisis redox • Cofactores redox: grupos oxidantes/reductores Sustrato (péptido) Estado de transición ➢Catálisis covalente • Intermediario unido al enzima • Ruta alternativa ➢Catálisis por iones metálicos • Reactividad especial de orbitales d A—B + X: A—X + B:A—B A + B H2 O A—X A + X: H2 O lento rápido rápido Enlaces de coordinación Actividad redox X: grupo del enzima Mg:complejo de coordinación octaédrico (6 O) 2011 Enrique Castro 14 Unión ES: especificidad y estereoselectividadUnión ES: especificidad y estereoselectividad ➢Ajuste inducido • Complementario al unirse (Koshland) • Energía de unión : cambio conformacional ➢Complementariedad enzima-sustrato • Llave en cerradura (Fischer) • Estereoselectividad: unión a 3 sitios lisozima Hexasacárido substrato Encaje inducido en la hexoquinasa Inactiva aa catalíticos descolocados Activa aa catalíticos en posición
- 8. 2011 Enrique Castro 15 Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónicaMecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica CO2 + HO— HCO3 2— pKa(H2 O) = 14 A pH 7 [HO— ]= 10-7 M [HO— ]/[H2 O] = 10-7 /55.5 ≈ 2·10-9 pKa = 7 Estabilización por par iónico Dramático aumento de acidez de H2 O B: BH+ Transfiere H+ a superficie de proteína (y al medio) 2011 Enrique Castro 16 Mecanismos catalíticos: serínproteasasMecanismos catalíticos: serínproteasas
- 9. 2011 Enrique Castro 17 Mecanismos catalíticos: serínproteasasMecanismos catalíticos: serínproteasas 2011 Enrique Castro 18 Coenzimas de nicotinamidaCoenzimas de nicotinamida Nicotinamidaadeninadinucleótido,NAD+ AMP adenina 2'P en NADP Nicotinamida oxidada Nicotinamida reducida Pliege de Rossmann en la ADH de hígado NAD+ NADH H+ Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+ • Coenzimas difusibles • Unión transitoria al enzima • Co-sustratos
- 10. 2011 Enrique Castro 19 Vitaminas B3Vitaminas B3 2011 Enrique Castro 20 Coenzimas de flavinaCoenzimas de flavina Riboflavina vit. B2 • Coenzimas no difusibles • Unión firme al enzima • Grupo prostético (covalente) Ac. Succínico Ac. Fumárico FAD FADH2
- 11. 2011 Enrique Castro 21 Actividad enzimática: Dependencia de T y pHActividad enzimática: Dependencia de T y pH ➢Dependencia de T • Energía cinética molecular • Q10 • Estabilidad de la proteína ➢Dependencia del pH • Titulación de grupos ionizables esenciales (Henderson-Hasselbalch) • pKa aa catalíticos • Estabilidad de la proteína 20 40 60 80 100 T, ºC Ecuación de Arrhenius Q10 = V T 10 V T Curva bifásica asimétrica Desnaturalización térmica Curva acampanada simétrica Grupo desprotonado catalítico Grupo protonado catalítico k = A⋅e E a RT 2011 Enrique Castro 22 Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas
- 12. 2011 Enrique Castro 23 Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturaciónCinética enzimática: curva hiperbólica y saturación Saturación implica unión enzima-sustrato v ≠ k⋅[ A]n v = k⋅[S ] k '[S ] Curva de velocidad no canónica Saturación: Vmax v no aumenta al [S] E + S E·S P + E Etapa rápida cuasi-equilibrio Etapa lenta limitante, acúmulo ES 2011 Enrique Castro 24 Cinética de MichaelisMentenCinética de MichaelisMenten [S] << KM Orden 1 [S] >> KM Orden 0 E + S ES P + E k1 k2 k-1 1ª simplificación: v0 A t=0, [P]=0 y k-2 no afecta d [P] dt = v0 = k2⋅[ES ] 2ª simplificación: Estado estacionario [ES] no varía (k1 >>k2 ) Permite calcular [ES] d [ES ] dt =k1 [ E]T −[ES ][S ] − k−1⋅[ES ] − k2⋅[ ES ]=0 [ES ]= k1[E ]T [S ] k1 [S ]k2k−1 ; [ ES ]= [E ]T [S] [S ] k2k−1 k1 v0=k2⋅[ ES ]= k2[ E]T [S ] [S ] k2k−1 k1 v0= V max⋅[S ] K M [S ] K M = k2k−1 k1 V max=k2⋅[ E]T Ecuación de Michaelis-Menten KM : [S] a la que V=½Vmax VMax : V cuando [S]∞
- 13. 2011 Enrique Castro 25 Parámetros cinéticos: KM , Vmax y kcat Parámetros cinéticos: KM , Vmax y kcat ➢Constante de Michaelis, KM • Afinidad E-S • Kd de ES ➢Velocidad máxima, Vmax • Saturación. • Actividad enzimática: [E]T ➢Constante catalítica, kcat • k de paso limitante P • 1er orden: Nº de recambio V max=k2⋅[ E]T KM = k2k−1 k1 ≃ k−1 k1 =KdSi k2 << k-1 Alta KM , baja afinidad Baja KM , alta afinidad Vmax mide actividad enzimática, [E]T Kcat : nº de molécula S convertidas por segundo kcat= Vmax [ E]T unidades • Usuales: μmol/min = UI • SI: catal = mol/s 2011 Enrique Castro 26 Límite de velocidad: Eficiencia catalíticaLímite de velocidad: Eficiencia catalítica E + S ES P + E k1 k2 k-1 v0= kcat⋅[E ]T [S ] K M [S ] v0= kcat KM ⋅[E]T [S]Si [S] << KM Velocidad máxima bimolecular: Límite de difusión (nº choques) vdifusion =108 -109 M-1 ·s-1 . Constante bimolecular de 2º orden kcat K M vdiffusion kcat elevada • KM no puede ser bajo • Afinidad ES limitada KM alta • Baja afinidad, disociación rápida • kcat rápida kcat baja • KM debe ser bajo • Alta afinidad ES KM baja • alta afinidad, disociación lenta • kcat lenta
- 14. 2011 Enrique Castro 27 Gráfico de LineweaverBurkeGráfico de LineweaverBurke v0= V max⋅[S ] KM [S ] ; 1 v0 = K M [S ] V max⋅[S ] 1 v0 = K M V max⋅[S ] [S ] V max⋅[S ] 1 v0 = KM V max ⋅ 1 [S ] 1 V max Y = K M V max ⋅X 1 V max 1/[S], mM-1 1/Vmax 1/v0 ,(μmol/min)-1 -1/KM p=KM /Vmax 2011 Enrique Castro 28 Gráfico de EadieHofsteeGráfico de EadieHofstee v0= V max⋅[S ] KM [S ] v0⋅KM v0⋅[S ]=V max⋅[S ] v0⋅ KM [S ] v0=V max v0=−KM⋅ v0 [S ] V max v0=−KM⋅ v0 [S ] V max Y =−K M⋅X V max v0 /[S], (μmol/min)/mM Vmax v0 ,(μmol/min) Vmax /KM p= -KM
- 15. 2011 Enrique Castro 29 Mecanismo de reacciones bisustratoMecanismo de reacciones bisustrato ➢Mecanismo secuencial ordenado • ➢Mecanismo secuencial al azar • ➢Mecanismo ping-pong • 2011 Enrique Castro 30 Cinética de reacciones bisustratoCinética de reacciones bisustrato ➢Reacciones secuenciales • Ordenadas / al azar • Complejo ternario EAB ➢Reacciones ping-pong • Ordenadas • Sin complejo ternario EAB • Intermediario enzima modificada 1/[A] 1/v0 1/[A] 1/v0
- 16. 2011 Enrique Castro 31 Mecanismos de inhibiciónMecanismos de inhibición ➢ Inhibición reversible • Competitivos • Acompetitivos • No-competitivos: puros/mixtos Eliminación del inhibidor restaura actividad enzimática ➢ Inhibición irreversible • Agentes desnaturalizantes • Reactivos de centro activo • Inhibidores suicidas Inactivación enzimática permanente Recuperación requiere biosíntesis Fármacos inhibidores irreversibles • Penicilina / transpeptidasa bacteriana • Aspirina / COX • Disulfiram / AlDH (alcohol) Venenos inhibidores irreversibles • Inhibidores AchE (organofosforados) • Amanitina / RNApol Inhibidores suicidas • Alopurinol / Xantina oxidasa • 5-Fluorouracilo / Timidilato sintasa • Deprenil / MAO H2 O +O2 H2 O2 Efectos cinéticos • Vmax (kcat o [E]T ) • KM K I = [E]⋅[ I ] [EI ] =1 [I ] K I Análogos del estado de transición • Muy baja KM (KI ) • Competitivos E+I EI KI Inhibidor en equilbrio con E KI : constante de disociación de EI 2011 Enrique Castro 32 Inhibición irreversible: bloqueo aa activoInhibición irreversible: bloqueo aa activo ➢Cisteín-enzimas • Agentes S-alquilantes (iodoacetato, pCl-Hg-benzoato) ➢Serín-enzimas • Organofosfatos Reactivación por pralidoxima I2 antiséptico Intoxicación por pesticidas
- 17. 2011 Enrique Castro 33 Inhibición irreversible dirigidaInhibición irreversible dirigida 2011 Enrique Castro 34 Inhibición competitivaInhibición competitiva 1/[S], mM-1 1/Vmax constante 1/v0 ,(μmol/min)-1 -1/KM p=KM /Vmax I=0 +I v0 /[S], (μmol/min)/mM Vmax constante v0 ,(μmol/min) Vmax /KM p= -KM I=0 +I I se une a E: EI Excluye unión S E+S ES P+E + I EI KI v0= V max⋅[S] ⋅K M [S] 1 v0 = ⋅K M V max ⋅ 1 [S ] 1 V max v0=−⋅KM⋅ v0 [S ] V max KM ap Vmax ap = KM ap =K M⋅1 [I ] K I V max ap =V max K I = [E]⋅[ I ] [EI ] =1 [I ] K I Fármacos inhibidores competitivos • Metotrexato / DHF reductasa • Ibuprofeno / COX • Sildenafilo / PDE V • Estatinas /β-HMGCoA reductasa Inhibición superable por aumento de S
- 18. 2011 Enrique Castro 35 Inhibidores enzimáticos análogos de sustratoInhibidores enzimáticos análogos de sustrato Análogo del sustrato de la DHF reductasa humana Análogo del sustrato de la DHPS bacteriana 2011 Enrique Castro 36 Inhibición acompetitivaInhibición acompetitiva 1/[S], mM-1 /Vmax 1/v0 ,(μmol/min)-1 -/KM p=KM /Vmax I=0 +I v0 /[S], (μmol/min)/mM Vmax / v0 ,(μmol/min) Vmax /KM p= -KM / I=0+I I se une sólo a ES: ESI E+S ES P+E + I ESI KI v0= V max ⋅[S] K M [S ] 1 v0 = KM V max ⋅ 1 [S ] V max v0=− K M ⋅ v0 [S ] V max KI = [E]⋅[ I ] EI =1 [I ] K I K M ap = K M 1 [ I ] KI V max ap = V max 1 [ I ] K I KM ap Vmax ap Fármacos inhibidores acompetitivos • Camptotecina / Topo I; etopósido / Topo II • Análogos 2º sustrato secuencial/ping-pong
- 19. 2011 Enrique Castro 37 Inhibición no competitiva puraInhibición no competitiva pura 1/[S], mM-1 /Vmax 1/v0 ,(μmol/min)-1 -1/KM constante p=KM /Vmax I=0 +I v0 /[S], (μmol/min)/mM Vmax / v0 ,(μmol/min) Vmax /KM p= -KM constante I=0 +I I se une a E y ES E+S ES P+E + I EI KI + I ESI KI +S v0= V max ⋅[S] K M [S ] 1 v0 = ⋅K M V max ⋅ 1 [S ] V max v0=−KM⋅ v0 [S ] V max K M ap =K M V max ap = V max 1 [ I ] K I KM ap = Vmax ap K I = [E]⋅[ I ] [EI ] =1 [I ] K I Fármacos inhibidores no-competitivos • Digoxina / Na+ /K+ -ATPasa •Tacrina / AchE • Análogos alostéricos Inhibición insuperable por aumento de S 2011 Enrique Castro 38 Inhibición no competitiva mixtaInhibición no competitiva mixta 1/[S], mM-1 '/Vmax 1/v0 ,(μmol/min)-1 -'/KM p=KM /Vmax I=0 +I I se une a E y ES E+S ES P+E + I EI KI + I ESI K'I +S P+E k2 k'2 v0= V max ' ⋅[S ] K M ' [S]1 v0 = ⋅K M V max ⋅ 1 [S ] ' V max K I = [E]⋅[ I ] [EI ] =1 [I ] K I KM ap =K M⋅ 1 [ I ] KI 1 [ I ] K ' I V max ap = V max 1 [I ] K ' I K ' I = [ES ]⋅[I ] [ ESI ] '=1 [ I ] K 'I KM ap Vmax ap Inhibición insuperable por aumento de S
- 20. 2011 Enrique Castro 39 Enzimas: mecanismo, cinética y regulaciónEnzimas: mecanismo, cinética y regulación ➢ Concepto y clasificación Propiedades y características Clasificación de enzimas Velocidad y orden de reacción ➢ Mecanismo de acción de las enzimas Energía de activación y velocidad de reacción Sitio activo y energía de unión Mecanismos de catálisis Coenzimas y cofactores ➢ Cinética enzimática Modelo de Michaelis-Menten Cinética mutisustrato Mecanismos de inhibición ➢ Regulación de la actividad enzimática Mecanismos generales de regulación Regulación alostérica y cooperatividad Regulación de rutas metabólicas 2011 Enrique Castro 40 Mecanismos genéricos de regulación enzimáticaMecanismos genéricos de regulación enzimática ➢Regulación alostérica • Modulador se une a otro sitio • Regula KM o kcat ➢Regulación de la Expresión • Inducción/represión • Ubiquitinación: degradación • Expresión diferencial de isoenzimas [Proteína] aagen biosíntesis degradación Expresión es un estado estacionario ➢Regulación covalente • Mod. Reversible • Proteolisis (irreversible) Efectos homotrópicos • Sustrato actuando en otro sitio • Usualmente ⊕ Efectos heterotrópicos • Efector <> Sustrato • Tanto ⊕⊖ Activador heterotrópico: aumenta unión de sustrato Inhibidor heterotrópico: dificulta unión de sustratoZimógenos pancreáticos Coagulación Caspasas apoptóticas Quinasas Señalización
- 21. 2011 Enrique Castro 41 Regulación alostérica: cooperatividadRegulación alostérica: cooperatividad 2011 Enrique Castro 42 Cooperatividad cinéticaCooperatividad cinética Cinética no michaeliana (sigmoidal) Análisis de cooperatividad: representación de Hill ½Vmax Vmax K0.5
- 22. 2011 Enrique Castro 43 Cinética cooperativaCinética cooperativa ➢ K enzimas • Efector modula KM ➢ V enzimas • Efector modula Vmax Cinética sigmoidal: activación/inactivación como interruptor (switch-like) 2011 Enrique Castro 44 Modelos de cooperatividadModelos de cooperatividad Equilibrio R-T L = T/R Stryer p. 282 fig. 10,15 ➢Modelo concertado • Dos estados conformacionales • Efector cambia equilibrio T-R • Inhibidor T, activador R ➢Modelo secuencial • Subunidades cambian separadamente • Múltiples formas en equilibrio
- 23. 2011 Enrique Castro 45 Reg. por modificación covalente reversibleReg. por modificación covalente reversible ➢Uso regulador • Reversible • Modula actividad ➢Uso no regulador • Activación constitutiva • Anclaje Acilación Farnesilación -carboxilación sulfatación Funciones específicas no reguladoras 2011 Enrique Castro 46 Fosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo reguladorFosforilación como mecanismo regulador Forma desfosforilada Forma fosforilada Proteína quinasa Proteína fosfatasa terminación de la señal • Actividad enzimática • Capacidad de unión •Reclutamiento •Translocación ➢Enzimas modificadoras de proteínas • Quinasas / fosfatasas • Actividad / unión ➢Dianas fosforilables • Múltiples sitios de fosforilación • Cambio estado conformacional • Actividad / unión ➢Organización en cascada • Activación secuencial • Amplificación Fosforilación ≠ activación A A* ⊕ B B* ⊕ C C* ⊕10 100 1000 x10 señal amplificación MKKK MKK MAPK ΔG≈-25 kJ/mol Δratio P/D x104 Pi: • 2 cargas, 3 pdh, tetraédrico (capacidad enlazante, reorganización) • Reacción rápida • ATP ubicuo
- 24. 2011 Enrique Castro 47 Secuencias diana de fosforilaciónSecuencias diana de fosforilación Cada quinasa fosforila -OH en secuencias específicas Cada proteína puede contener múltiples dianas para varias quinasas • S/T: quinasas efectoras • Y: transducción • H: quinasas efectoras ➢ Múltiples efectos • P constitutiva • Localización secuestro • Activación/inactivación • Magnitud variable 2011 Enrique Castro 48 PKA: ejemplo de enzima reguladoraPKA: ejemplo de enzima reguladora PKA • Heterotetrámero R2 C2 • 4 sitios cAMP, cooperativos • S/T-quinasa • Diana RRpS/T [cAMP]i 100%- 50%- Actividadquinasa ≈10 µM Activación cooperativa sigmoidal Umbral de activación -RRpS/T- OH proteína -RRpS/T- O- proteína PiATP ADP Fosforilación de proteínas diana (secuencia específica) Subunidades C Fosforilan dianas Subunidades R ligan 4 cAMP (cooperativo) Subunidades R Inhiben a sub. C AKAP localiza R Centro catalítico libre, activo Secuencia —RRGAI— pseudosustrato
- 25. 2011 Enrique Castro 49 Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticosReg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos Zimógenos inactivos (Gránulos de almacenamiento) Activación proteolítica (extracelular) Proteolisis re-posiciona el centro activo Activación por proteolisis en cascada Feedback ⊕ explosivo 2011 Enrique Castro 50 Activación por proteolisis: coagulaciónActivación por proteolisis: coagulación Fibrinopéptidos A y B Polimerización fibrina • Unión - GHR • Unión - GPR Monómero de fibrina Fibrinógeno GHR GPR Dom. Dom. Proteolisis por trombinaActivación por proteolisis en cascada Proteasa inactiva Proteasa activa
- 26. 2011 Enrique Castro 51 Isoenzimas como mecanismo reguladorIsoenzimas como mecanismo regulador ➢Isoenzimas • Igual reacción • Diferente cinética • Diferente localización • Diferente expresión Ajuste fino del metabolismo en cada tejido o compartimento LDH H4 • KM Lac baja (alta afinidad) • Inhibición alostérica Pyr LDH M4 • KM Lac alta (baja afinidad) • No efecto alostérico Pyr Lac Pyr NAD+ NADH Pyr Lac NADH NAD+ Adaptado producción aerobia Pyr Adaptado producción anaerobia Lac Recambio de isoenzimas LDH en corazón (adaptación a aerobio) Hexoquinasas I-III • KM Gluc baja (0.1 mM, alta afinidad) • Inhibición por producto Hexoquinas IV (glucoquinasa) • KM Gluc alta (10 mM, alta afinidad) • SIN inhibición por producto 2011 Enrique Castro 52 Regulación de rutas metabólicasRegulación de rutas metabólicas ➢Enzimas reguladas/reguladoras • Reacciones más lentas (paso limitante) • Inicio/ramificación/fin de rutas (etapa de compromiso) ➢Retroalimentación (feedback) • Usualmente negativo • Precursores ⊕ / Productos finales ⊖ Paso limitante g g' Etapa de compromiso retroalimentación retroalimentación ➢Compartimentación • Separar tras membranas • Regulación independiente en zonas • Transporte regulado •Regular actividad •Regular expresión
- 27. 2011 Enrique Castro 53 Enzimas como marcadoresEnzimas como marcadores CPK3 CPK2 ➢Ensayos enzimáticos • Medida Vmax (conocer KM ) • Identificació de isoenzimas (selectividad tisular)