Extracción de ADN a partir de sangre total mediante el método de Salting Out. Trucos y procedimiento completo

1. 3mL de sangre + 7mL de solución de glóbulos
rojos ▶ invertir para homogenizar ▶ congelar a -
20ºC por 10 min y centrifugar 10 min. a 3.500
r.p.m. ▶ Repetir el proceso (1,2,3), pero en el paso
1 sólo con 3mL de solución de glóbulos rojos.
Adicionar 2.5 mL de solución de glóbulos blancos, y
pipetear hasta disolver el pellet ▶ añadir 10µL de
proteinasa K e invertir para homogenizar ▶ incubar a
57ºC durante 4 horas.
Añadir 800µL de solución precipitante de
proteínas ▶ Invertir para homogenizar ▶
congelar a -20ºC por 10 min. ▶ centrifugar
20 min. a 4.500 r.p.m.
Transferir el sobrenadante a 2.5mL de
isopropanol frío e invertir un par de veces
el tubo. Coger el ADN precipitado con una
pipeta pasteur y transferirlo a un
eppendorff con TE1X (~1ml) ▶ vórtex ▶
incubación a 37ºC por 2h (o toda la noche
a 4ºC) ▶ cuantificación
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3
4
2
Basado en: Miller SA, et al., Nucleic Acids
Research. 1988;16(3):1215
Mayely Sánchez. Biol, PhD

2. Para 1 L: 8.3g de Cloruro de Amonio + 1g de
Bicarbonato de Potasio + 2 mL de EDTA 0.5M
pH8 + 800 ml de agua destilada ▶ mezclar hasta
homogenizar ▶ llevar a 1L con H2O destilada ▶
Almacenar a 4º.
Para 1L: 50 ml de EDTA 0.5M pH8 + 200 mL
de SDS 10% + 600ml de agua destilada ▶
mezclar cuidadosamente hasta homogenización
▶ completar a 1L con H2O ▶ almacenar a
temperatura ambiente (TA).
Para 500ml: 385.4g de Acetato de Amonio +
100 ml de H2O destilada ▶ mezclar usando
magneto y calentamiento (150º) ▶ Almacenar a
TA.
Para 500ml: 93.05g EDTA + 350 mL de H2O
destilada + Llevar a pH.8 con lentejas de NaOH
+ Ajustar a 500mL con H2O + Conservar a 4ºC.
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3
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Preparación de soluciones
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Mayely Sánchez. Biol, PhD

3. Toma de muestra: En tubos con EDTA, nunca con
heparina.
Procesamiento: Almacenando la sangre a 4ºC, la
extracción de ADN puede esperar varias semanas.
+Cantidad de ADN: la mejor opción
es centrifugar la sangre total (A) 5 min a
3.500 r.m.p., y luego tomar la capa
leucocitaria (B) y completar el volumen de
los 3ml con plasma (C) y eritrocitos (D).
A
B
C
D
Lisis de glóbulos blancos: fundamental que el pellet
se disuelva completamente, usar una pipeta pasteur y
hacerlo con vigorosidad.
Proteinasa K: puedes prescindir de ella, es probable
que sólo se afecte un poco la pureza de tu ADN.
Incubación de 4 horas: puedes disminuir el tiempo
incluso a 2h si corre demasiada prisa. Es probable que
sólo disminuya la cantidad de ADN esperado.
Precipitación de ADN: si no obtienes ADN visible a
tus ojos para capturarlo con la pipeta pasteur, centrifuga el
tubo a 4.500 r.p.m por 20 min. Descarta el isopropanol,
dejar secar el tubo a TA y pon 100 μL de TE1X, déjalo toda
la noche a 4ºC, luego vórtex.
Almacenamiento: siempre en alícuotas de 100-200
μL a -80ºC. Mantener la alícuota de trabajo a -20ºC.
Trucos de laboratorio
Mayely Sánchez. Biol, PhD