Practica No. 3 Pruebas Bioquímicas

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO, INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NÚMERO 128.
Práctica No.3: Pruebas bioquímicas.
Submódulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.
Integrantes: Quistián García Hylary Estefanía, Ramírez Arellanos Génesis, Ramírez Hernández
Jessica, Ramos Franco Michelle Valeria, Ramos Juárez Mario Antonio, Rangel Osorio Hugo Cesar,
RascónCastrejón Lizeth Guadalupe, Reyes Marcial Luis Diego, Ríos Palacios Selene.
Facilitadora: Ing. Jessica Alicia Acosta Bezada.
Fecha: Se inició el día lunes 13 de octubre del año en curso y se finalizó el día 16 de octubre del año en curso.
Introducción
Con frecuencia, la identidad de una especie
requiere que se conozca de una manera detallada
su actividad bioquímica, porque otras
características no son lo suficientemente distintivas
o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas
técnicas para la caracterización bioquímica de una
especie.
Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis
que sirven como apoyo para la identificación de
especies bacterianas.Consisten en distintos test
químicos aplicados a medios biológicos, los cuales,
conocida su reacción, nos permiten identificar
distintos microorganismos presentes. Su sistema de
funcionamiento generalmente consiste en
determinar la actividad de una vía metabólica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio
de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.
Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone
de múltiples medios, los cuales debemos conocer
cuál de los test que componen las pruebas
bioquímicas es o son los adecuados de acuerdo a
la circunstancia que necesitemos estudiar. De igual
manera debemos entender los principios
bioquímicos de las pruebas. Y además ser capaces
de interpretar adecuadamente los resultados
entregados por las pruebas bioquímicasy aplicarlas
de acuerdo a las exigencias del microorganismo en
estudio.
Con ello la práctica se desarrolla de una manera en
la cual, el centro de atención asía el aprendizaje, lo
son las pruebas bioquímicas.
Resumen
En esta práctica se realizaron cuatro series de
pruebas bioquímicas para la identificación y
diferenciación de unas bacterias con otras.
Estas pruebas fueron: MIO (movilidad, indol y
ornitina), LIA (Agar medio Lisina), KLIGGER, VP
(Vogues Proskauer) y SIM (Sulfuro, Indol y
Motilidad).
En un agar Nutritivo, Agar bilis y verde brillante
(VBB) y McConkey se inocularon bacterias
contenidas en agua de baño sanitario y tierra
húmeda contaminada respectivamente para los
últimos dos agares. Se incubó por 24 horas a 37º
C.
Primeramente se realizó la tinción de Gram para
identificar las bacterias Gram negativas que fueron
las que se necesitaron para inocular las pruebas
bioquímicas.
Una vez identificadas e inoculadas se incubaron
nuevamente por 24 horas, se realizaron las lecturas
bioquímicas correspondientes a cada serie
mediante el análisis morfológico Identificando así el
tipo de bacteria presente en cada una de estas.
Abstract
In this practice were performedfour series of
biochemical testsfor the identification and
differentiation of bacteria with other.
These tests were: MIO (Motility Indole Ornithine),
LIA (Lysine iron agar), KLIGGER, VP (Vogues
Proskauer) y SIM (Sulfide indole motility).
In Nutrient Agar, Brilliant Green Bile Agar and Mc
Conkey inoculated bacteria contained in sanitary
water bath and moist soil contaminated respectively
for the last two agars. We incubated for 24 hours at
98º F.
First, Gram staining was performed to identify the
Gram negative bacteria that were needed to
inoculate biochemical tests.
Once identified and inoculated were incubated
again for 24 hours, corresponding biochemical

2 | P á g i n a
readings were performed on each series by
morphological analysis identifying the type of
bacteria present in each of these.
Materiales y métodos
Etapa 1 Preparación de agares
Material y reactivos
Matraz Erlenmeyer
Mecheros Bunsen
Agar Bilis verde brillante
Agua destilada o potable
Espátula
Cajas Petri
Procedimiento
1) A cada equipo se le asignó un agar para
preparar. En este caso se preparó el agar
Bilis Verde Brillante.
2) Para esto se disolvió 8.9 gramos del agar
en 400 mililitros de agua destilada o
potable.
3) Esta preparación se calentó hasta el punto
de disolución, y de ahí se dejó hervir
durante 1 minuto, posteriormente se dejó
enfriar.
4) Mientras esto se llevaba a cabo se procedió
a envolver las cajas Petri para que fueran
esterilizadas, de igual forma la solución
antes preparada se esterilizo.
5) Por último se procedió a vaciar el agar en
las cajas Petri. Esto se llevó a cabo dentro
de un triángulo de seguridad formado con
mecheros Bunsen para evitar la posible
contaminación del agar.
Etapa 2 Preparación de pruebas bioquímicas e
inoculación
Material y Reactivos
24 tubos de ensaye
Matraz Erlenmeyer
Gradilla
Espátula
Asas de inoculación
Prueba VP (Voges Proskaver)
Agua de baño
Tierra húmeda contaminada
Procedimiento
1) Cada equipo preparó 4 series de pruebas
bioquímicas para cada mesa. Cada tubo
de ensaye necesito un aproximado de 10
mililitros de prueba. Por lo que cada equipo
preparó 260 mililitros de la prueba
bioquímica tomando en cuenta que debería
vaciar el contenido en 24 tubos de ensaye y
teniendo en cuenta el posible margen de
error.
2) La prueba VP se preparó disolviendo 4.4
gramos de la prueba en 260 mililitros de
agua destilada o potable. Esto se calentó
hasta disolución y se dejó enfriar.
3) Esta solución se vacío en los 24 tubos de
ensaye (10 ml por tubo aproximadamente),
se cubrió los tubos para su esterilización y
se procedió a llevarse a cabo.
4) A cada equipo se le proporcionó 3
diferentes tipos de agar: nutritivo, bilis
verde brillante y McConkey. La inoculación
se llevó a cabo dentro de un triángulo de
seguridad formado con mecheros Bunsen.
En el primero se procedió a inocular una
muestra de agua de baño. En el segundo
una solución de agua con tierra húmeda
contaminada, y el tercero con agua de
baño. Se procedió a su incubación.
Etapa 3 Lectura de colonias, tinción, morfología
bacteria e inoculación de pruebas bioquímicas.
Cristal violeta
Yodo-lugol
Alcohol-acetona
Safranina
Aceite de inmersión
Portaobjetos y cubreobjetos
Mecheros Bunsen
Microscopios
Procedimiento
1) Primero se llevó a cabo la lectura de las
distintas colonias obtenidas en los
diferentes tipos de agares. Dado que el
agar bilis verde brillante y el McConkey son
medios inhibidores crecieron muy pocas
colonias siendo Gram negativas.

3 | P á g i n a
2) Se llevó a cabo la tinción de Gram y
tomando en cuenta lo que antes se
mencionó de los agares Bilis verde Brillante
y McConkey, las muestras solo fueron
tomadas de los agares nutritivos.
Primero se tomó una muestra de una
colonia y se esparció en un portaobjetos
con una gota de agua. Se dejó secar y se
fijó pasándose rápidamente por la flama de
un mechero.
Se le agregó una gota de cristal violeta y se
dejó actuar por un minuto. Posteriormente
se le agregó una gota de yodo-lugol y se
dejó actuar por un minuto. Se le agregó
una gota de alcohol-acetona y esta vez se
dejó actuar por 30 segundos, por último se
le agregó una gota de Safranina y se dejó
por 30 segundos. No hay que olvidar que
entre cada colorante la muestra se debe
estar lavando con agua.
Se le agregó una gota de aceite de
inmersión y se le puso un cubreobjetos.
3) Se procedió a su observación a través del
microscopio y se anotó su morfología.
(Véanse los resultados). Los que resultaron
Gram negativos, tomados de un agar
nutritivo procedieron a ser inoculados en
las pruebas bioquímicas.
4) Con las pruebas bioquímicas sólidas que
no contaban con un espacio para estriado
(MÍO y SIM) se procedió de la siguiente
forma: con un asa de punta se tomó una
muestra de la colonia, y se insertó dentro
de la prueba lo más profundo que resultara
posible, y se sacó por el mismo lugar por el
que entro.
Con las pruebas que presentaban un lugar
para el estriado (Kligler y LÍA), se procedió
de la siguiente forma: se tomó una muestra
de la colonia con un asa de punta y esta se
insertó en la prueba lo más profundo que
fuera posible, cuando se retiró el asa, y se
llegó al lugar de estriado con el asa se hizo
una pequeña “S”.
Con las pruebas líquidas (VP) se procedió
de la siguiente forma: se tomó una muestra
de la colonia con un asa de punta y esta se
colocó en la prueba, se revolvió con la
misma asa hasta que la muestra estuvo
bien disuelta.
5) Se procedió a la incubación de las pruebas
bioquímicas y a la esterilización de los
cultivos.
Etapa 4 Lectura de pruebas bioquímicas
Pruebas bioquímicas inoculadas e
incubadas
Tabla de lectura de pruebas bioquímicas
(Mirar Anexo)
Procedimiento
1) Se observó el cambio que sucedió en cada
una de las pruebas bioquímicas.
2) Se analizó de serie en serie, y de acuerdo a
la tabla se marcó los aspectos con los que
cumplía esa serie. Se sumó estos aspectos
y la especie con que más números de
aspectos contara era la especie más
probable de bacterias que fue inoculada en
la prueba. (Véanse los resultados)
Resultados
En los resultados presentes de esta práctica se
rescatan las observaciones de la morfología tanto
bacteriana como colonial, además de las lecturas
bioquímicas. Estos resultados se muestran en las
siguientes tablas.
Medio de
cultivo
Número de
caja petri
Inoculado con:
Agar nutritivo
Caja petri 1
Muestra de agua
del sanitario
Caja petri 2
Caja petri 3
Caja petri 4
Caja petri 5
Caja petri 6
Caja petri 7
Caja petri 10
Agar Mc
Conkey
Caja petri 9
Muestra de agua
del sanitario
Caja petri 8
Caja petri 11
Agar de bilis
verde
brillante
Caja petri 12
Muestra de tierra
contaminada
Caja petri 13
Caja Petri 14

Caja petri Colonia Morfología de la colonia
4 | P á g i n a
Caja petri 1 1
Forma puntiforme, borde entero,
superficie plana, color blanco.
Caja petri 2
1
Forma rizoide, borde filamentoso,
superficie plana, color blanco
opaco.
2
Forma circular, borde entero,
superficie plana.
3
superficie plana, con transparencia.
Caja petri 3
1
Borde lobulado, superficie plana,
forma circular color amarillo.
2
Borde entero, superficie plano
convexa, forma puntiforme, color
blanco.
3
Borde lobulado, superficie convexo,
forma irregular, color blanco opaco.
Caja petri 4 1
superficie convexa, color blanco.
Caja petri 5
1
2
Caja petri 6
1
Borde filamentoso, superficie
plana, color amarilla con
transparencia.
2
Borde entero, superficie plana,
color blanco.
3
Borde ovalado, superficie plana,
color blanco
5
Borde entero, superficie plana, con
transparencia.
7
Borde entero, superficie rugosa,
color amarillo claro.
8
Borde entero, forma circular,
Caja petri 7 1
Caja petri 8
1
Borde entero, forma circular, con
transparencia y centro café.
2
Forma lobulada, superficie plana,
color morado.
Caja petri 9 1
superficie convexa, con
transparencia.
Caja petri 10 1
Borde lobulado, superficie plano
convexa, forma irregular.

5 | P á g i n a
2
forma circular.
Caja petri 11 1
forma circular, color morado.
Caja petri 12 1
superficie convexa, color
morado/fucsia brillante, con
hemolisis.
Caja petri 13 1
hemolisis.
Caja petri 14 1
hemolisis.
Caja petri Colonia Morfología bacteriana
Caja petri 1
1 Bacilos Gram positivos.
2 Cocos Gram negativos.
Caja petri 3
1 Estreptococos Gram positivos.
Caja petri 5
1 Cocobacilos Gram positivos.
2 Cocobacilos Gram positivos.
Caja petri 9 2 Cocos Gram negativos.
Caja petri 6 7 Bacilos Gram negativos.
Caja petri 2
1 Bacilos Gram negativos.
4 Bacilos Gram negativos.
Serie
Caja
petri
Colonia
Pruebas bioquímicas
Kliger LIA H2S
MIO
Móvil
Indol Gas MIO VP RM
1 2 1 K/A + K/A + - - - - + - -
2 9 2 K/A + K/K+++ - - - - + - -
3 6 7 A/A - K/K+++ + - - + + + -
4 2 4 K/A + K/K+++ - + - - + - -
Serie Especie encontrada
1 Shigella (aerobia)
2 Shigella (aerobia estricta)
3 Enterobacter (facultativa)
4 Enterobacter (anaerobia)

6 | P á g i n a
En estas tablas se muestran todo lo acontecido en
la identificación indispensable de las colonias que
crecieron antes y después de los primeros días de
incubación, así como la morfología bacteriana
principal que trataba de encontrar solo bacterias
Gram negativas. Los resultados también muestran
y enmarcan dos tipos de bacterias, bacterias
llamadas Shigella y también enterobacterias.
Conclusiones
Quistián García Hylary: Es muy importante conocer
las distintas propiedades que poseen los distintos
medios de cultivos, por ejemplo los inhibidores
como el Mc Conkey con el que se trabajó en esta
práctica y que por ser inhibidor solo permite el
crecimiento de bacterias Gram Negativas.
Para poder realizar una morfología bacteriana y que
los resultados obtenidos sean satisfactorios es
necesario e indispensable realizar una correcta
tinción, y esto se lleva a cabo respetando los
tiempos de cada colorante, así como un lavado
adecuado entre cada colorante y por supuesto
seguir el orden correcto del procedimiento.
Las pruebas bioquímicas son utilizadas para
analizar las bacterias presentes en una colonia.
Esto se lleva a cabo con distintas pruebas
bioquímicas que tienen distintos parámetros y con
las que se obtienen distintos resultados. En base a
los resultados de una serie de pruebas bioquímicas
se puede “deducir” la bacteria de la que se
conforma una cierta colonia.
Para que las pruebas den resultados satisfactorios
se debe inocular en ellas de una manera adecuada,
y se debe buscar que la posible contaminación de
las pruebas sea lo más mínima posible. Otro
aspecto de las bacterias inoculas en las pruebas
bioquímicas que se puede deducir en base a su
crecimiento en ellas es que tipo de respiración
presentan, por ejemplo si crecen en el fondo del
tubo, son sin lugar a dudas anaerobias estrictas.
Ramírez Arellanos Génesis: Los lactobacilo son
producto del desdoblamiento de las grandes
moléculas; se difunden y penetran a las células
cercanas, también son muestra de presencia de
hemólisis.Ciertas especies de bacterias hidrolizan o
licuan la gelatina en forma muy característica.
El agar aluminio es agar nutriente al cual se ha
añadido un poso de almidón como única fuente de
carbohidratos, formando una especie de nutriente
para microorganismo.
Algunos cristaloides llamados así porque cristalizan
al acercarse, tales como sal de una azúcar y
amoniaco, todas transmiten la luz en un medio de
placa de leche.
El T.S.I. ha dado resultados satisfactorios con
organismos que fermentan la sacarosa, mientras
que el papel indicado (acetato de plomo) es el
método más sensible a los medios de cloruro
ferroso el método más sensible.
Muchas bacterias liberan ex enzimas que hidrolizan
la gelatina, si uno de estos organismos se inocula
en un tubo de gelatina nutritiva, las gelatinas
cercanas a las bacterias serán hidrolificadas y
pasarán del estado coloidal al estado cristaloide
(aminoácido).
La levadura realizan una fermentación alcohólica
casi puro alcohol que proviene de la
descarboxilación del ácido pirúvico.
La fermentación se refiere a la degradación
anaeróbica del carbohidrato y que almacena gran
cantidad de energía, esta capacidad desprende a
las enzimas de microorganismos.

7 | P á g i n a
Ramírez Hernández Jessica: Se llegó a la
conclusión de que para observar y diferenciar con
más precisión las bacterias presentes en un medio
agar, es decir, no solo descriptivamente (morfología
y tinción) sino también por sus características
metabólicas son necesarias las pruebas
bioquímicas que nos brindan el medio específico
para que estas desarrollen los aspectos necesarios
que nos ayudan a saber qué tipo de bacteria se
encuentra presente en cada una de las series
realizadas.
En la tinción de Gram podemos identificar si las
bacterias inoculadas en un medio agar son
negativas o positivas así como también su forma:
cocos, bacilos o espirilos con sus diversas
variaciones.
Sin embargo, aunque esta tinción está relacionada
con las pruebas bioquímicas ya que es uno de los
pasos principales para la realización de estas, no
es exactamente la que se requirió para identificar la
presencia de Shigella y enterobacterias Aerogeros
en las cuatros series realizadas.
Para lograr la identificación de estas bacterias fue
necesario realizar la interpretación correcta de lo
que se observó en cada tubo de cada serie y el
medio en el que se encontraban: líquido y sólido;
así como la realización adecuada del procedimiento
del método de siembra en tubos.
Fue a su vez necesario también conocer el tipo de
respiración que la bacteria resultante tiene en un
tubo. Dependiendo de su ubicación podíamos
identificar a las: aerobias estrictas, anaerobias
estrictas, facultativas, microaerofilos y
aerotolerantes (anaerobias).
Así con esta práctica podemos comprender, desde
cierto punto de vista, como personas
especializadas en la materia identifican
microorganismos patógenos para la salud humana
y su respectiva prevención o cura sea el caso.
Ramos Franco Michelle: En conclusión para mí en
esta práctica observamos los mismo que en la
anterior sobre contar las colonias que se
encontraban en cada agar y cuáles eran los tipos,
en esta práctica utilizamos el agua del baño
contaminada y la tierra contaminada que cada una
tenia diferentes baterías y algo nuevo que aprendí
fue de cómo identificar colonias en tubos de ensaye
y como identificar cada unos de los tubos y de sus
bacterias, en una parte no entiendo porque nos
sirve en la vida cotidiana pero es algo nuevo que
aprender y saber identificar cada una de ellas.
Ramos Juárez Mario: Es importante saber
identificar las bacterias en un agar o cultivo, como
para también saber si es catión o anión, el método
es muy entretenido y gustoso por los colores que
presentan, para saber cómo identificarlos tuvimos
también que investigar lo ya presente, en
conclusión es muy necesario conocer con qué y
cómo se va a trabajar con la forma de identificación
de bacterias.
Rangel Osorio Hugo Cesar: Al finalizar esta prueba
podemos concluir que en las pruebas bioquímicas
nos son de gran ayuda cuando queremos
identificara una bacteria con su género especifico y
características mejor definidas al finalizar las 4 seria
de pruebas bioquímicas encontramos 2 diversas
bacterias de distintos agares las cuales con
Shigella y Enterobacter aerogeros y como ya dije
cada una de estas tienen características especiales
las cuales nos dan cabida para poder identificar a
las bacterias. Gracias a esto en los distintos análisis
de laboratorio podemos saber que bacterias son y
si son beneficiarias o dañinas para nuestra salud

8 | P á g i n a
Rascón Castrejón Lizeth Guadalupe: Los medios de
cultivo en un laboratorio de microbiología son de
suma importancia ya que, son instrumentos de
dignosticación de bacterias patógenas dentro de los
individuos. Los medios de cultivo son un método
fundamental para estudiar las bacterias es
cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de
un medio En microbiología se emplea medios de
cultivos por la simple razón que los organismos a
estudiar necesitan una fuente de energía, para vivir
y así desarrollarse, por tal motivo, la preparación de
los medios de cultivos varían ya que deben de
prepararse según las necesidades nutricionales del
organismo, esto es fundamental para su estudios.
Esto consta en disponibilidad de nutrientes,
presencia (o ausencia) de oxígeno y distintos
gases, condiciones adecuadas de humedad, luz
ambiental, pH, temperatura, adecuados para el
microorganismo. Una vez cultivados dichos
microorganismos no podemos dejar de lado las
técnicas de tinción que muy importantes para el
estudio de microorganismos inertes.
Para las técnicas de tinción se aplica un colorante
simple (un solo colorante) o diferencial (dos o más
colorantes). Esto nos servirá para una mejor
visualización y con ellos un mejor análisis de los
microorganismos deseados.
Las pruebas bioquímicas se utilizan Con frecuencia
en el laboratorio de microbiología, ya que la
identidad de una especie requiere que se conozca
de manera detallada su actividad bioquímica,
porque otras características no son suficientemente
distintivas o diferenciales.
En el laboratorio disponemos de numerosas
técnicas para la caracterización bioquímica de una
especie. Además de los productos finales de los
procesos metabólicos, también se necesita conocer
con detalle cómo se producen estos cambios de las
bacterias cultivadas. En general el microorganismo
se cultiva en medios que contienen una sustancia
nutritiva específica o sustrato y después de la
incubación del cultivo se examina para ver los
cambios químicos que hayan ocurrido.
Reyes Marcial Luis Diego: Como parte de la
formación de todo microbiólogo es importante
conocer algo muy importante, “los
microorganismos”. Pero en lo principal, y tal vez en
lo general, es importante conocer las bacterias.
Estos microorganismos tan sencillos son un objeto
de estudio muy importante dentro de la
microbiología. Y en esta práctica de microbiología
no estuvo exento este estudio, en la práctica se
denota las identificaciones y morfologías tanto
bacterianas como por colonias, además de las
pruebas bioquímicas.
Hablando de esta última, es importante reconocer
que es una parte fundamental y necesaria, si se
requiere conocer con qué tipo de bacteria se está
trabajando, o de igual manera sirve como un
proceso de identificación.
En general esta práctica requirió de toda la
concentración posible, además de tener que
realizar apuntes totalmente explícitos y certeros,
porque cualquier error podía provocar una falla en
toda la práctica.
Con esto concluyo, en que es algo muy importante
en la microbiología, ya que es el pilar de esta
ciencia y con ello se formo la misma.
Ríos Palacios Selene: Obtuvimos una grata
productividad de cada Agar. Considerando que la

9 | P á g i n a
clara finalidad era diferenciar el producto de cada
uno para así evidenciar cada tipo de bacteria
originada en ellos.
El medio de enriquecimiento selectivo (Verde
Brillante) favoreció por su diseño el crecimiento
específico de un microorganismo particular o grupo
de microorganismos. Fue de gran utilidad para el
aislamiento de microorganismos ya que era una
población microbiana mixta.
El medio diferencial (Mc Conkey) facilito la
discriminación de microorganismos de la mezcla
por sus propiedades diferenciales de crecimiento en
dichos medios. (Gram-)
Con esto se concluye que los 3 tipos distintos de
Agares formaron distintas colonias por sus
propiedades específicas y función de desarrollo en
cada Medio de Cultivo.
Discusión
De acuerdo a los experimentos realizados, pudimos
notar claras diferencias en los microorganismos
vistos, comenzando en el caso del agar nutritivo,
vimos que sus microorganismos son más distintos y
variados, que en comparación con los agares Mc
Conkey y Verde Brillante,
El uso del Agar nutritivo es utilizado para propósitos
generales, para aislamiento y recuento de
microorganismos con escasos requerimientos
nutricionales. Medio rico para el cultivo de
microorganismos en general, crece una gran
mayoría, excepto algunos muy exigentes. Por esta
razón fue un crecimiento con más abundancia en
bacterias.
Con respecto al Agar Mc Conkey es un medio que
se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram
negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios
facultativos. Permite diferenciar bacterias que
utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua
y alimentos.
Todas las especies de la familia Enterobacteria
Ceaese desarrollan en el mismo. Con este motivo
solo germino un tipo de bacteria.
El Agar Verde Brillante es un Inhibidor: colorante
verde brillante (inhibe Gram positivas). Incluye
lactosa y sacarosa. Rojo fenol como indicador por
lo que las colonias se apreciaron rosas/blancas y
evidentemente solo se originó una sola clase de
bacterias.
Con base en lo anterior, se puede decir que la
finalidad fue observar distintos tipos de
microorganismos, desarrollados en un medio
distinto para así notar las diferencias bastantes
perceptibles en estas.
Bibliografía
Junta de Andalucia. (s.f.). Recuperado el 17 de
Octubre de 2014, de
http://www.juntadeandalucia.es/.../depart/biolog/
pdf/p21.pdf
Libros Laboratorio. (s.f.). Recuperado el 17 de
Octubre de 2014, de
http://libroslaboratorio.files.wordpress.com/.../me
dios...
Anexos
Medios de cultivos.
Para realizar el estudio de los microorganismos, se
han diseñado diversos métodos que permiten
cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que
es posible cultivarlos bajo condiciones

10 | P á g i n a
experimentales y manejar un solo tipo de
microorganismo. Una de las técnicas más usadas
en el laboratorio de microbiología consiste en
transferir una muestra microbiológica de un
ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que
nos permite obtener cultivos microbianos.
Al realizar este procedimiento, es necesario tomar
en cuenta que en el área de trabajo, existen
muchos otros microorganismos; y es necesario
tomar precauciones para impedir que éstos
contaminen los cultivos con los que estamos
trabajando. Por otra parte, para considerar no sólo
el aspecto nutricional, sino también las condiciones
ambientales de su hábitat natural, por lo que en el
medio de cultivo se debe ajustar el pH y
concentración de sales y durante la incubación
condiciones tales como la temperatura, aireación la
luminosidad. La aplicación de estos procedimientos
ha permitido propagar a los microorganismos en
cultivos mixtos, así como su aislamiento y la
obtención de cultivos puros, facilitando de este
modo, el estudio, caracterización, aplicación y
control de los mismos. La forma de sembrarlos y
cultivarlos depende del tipo de microorganismo y
propósito específico del estudio.
En general el microorganismo se cultiva en medios
que contienen una sustancia nutritiva específica o
sustrato y después de la incubación del cultivo se
examina para ver los cambios químicos que hayan
ocurrido.
Observación bacteriana.
Son las técnicas que permiten observar
microorganismos en función de la capacidad de los
mismos para retener o no determinar sustancias
colorantes, lo que depende de la carga de célula y
colorante.
Los colorantes pueden ser de distintos tipos:
Catiónicos. Son sustancias que tienen carga
positiva. Penetran el interior de las células y las
tiñen. Ejemplo: azul de metileno, cristal violeta,
safranina.
Aniónicos: con carga negativa no penetran en el
interior de la célula, sino el entorno. En este caso
se habla de tinción negativa. Ejemplo: eosina,
nigrosina.
Liposolubles: se mezclan con los lípidos celulares y
los tiñen. Ejemplo: negro sudan.
Las tinciones pueden ser:
Simple: utilizan un solo colorante.
Diferencial: se basan en el hecho de que distintos
tipos de células tienen distintas composición
química, y por lo tanto reaccionan de forma
diferente a una tinción.
Selectiva: se basan en el hecho de que distintas
estructuras celulares tienen distintas composición
química, de modo que se tiñen selectiva mente.
Azul de metileno, (tinción positiva): Permite teñir el
interior celular.
Nigrosina, (tinción negativa): trata de un colorante
aniónico, que no penetra en el interior
celular.
Medios de cultiv o
comunes
Tienen como objetiv o
producir el cresimiento
de bacterias
Son los mas utilizados
del grupo de medios
de cultiv o Lo
conforman los agares
nutritiv os
Lo conforman el agar
nutritiv o

11 | P á g i n a
Bacteria del yogurt:
El yogur es un producto lácteo producido por la
fermentación natural de la leche, en él se
encuentran: estreptococos termophilus y el
lactobacilos
bulgaricus.
Bacterias del
vinagre:
El vinagre es una
solución acuosa
rica en ácido acético resultante de la fermentación
espontanea del vino o de bebidas alcohólicas de
baja graduación, en él se encuentran bacterias
aeróbicas del ácido acético, principalmente:
Acetobacter aceti, aunque también, gluconobacter.
Bacterias del sarro dental:
El sarro dental es un depósito consistente y
adherente localizado sobre el esmalte de los
dientes, en él se encuentran bacterias saprofitas,
pudiendo observar gran variedad de morfologías:
espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.
Utilización bioquímica.
Las pruebas bioquímicas nos muestran reacciones
que son la base de la identificación de los
diferentes agentes bacterianos. Para la
identificación de las bacterias, el laboratorio de
diagnóstico necesita conocer las características
físicas y metabólicas de las mismas. Una vez
conocidas las características físicas del
microorganismo, se analizan sus reacciones
metabólicas tales como la producción de enzimas,
meta bolitos intermedios, oxidación y fermentación
entre otras. A través de los años se han
desarrollado pruebas aprovechando estos
conocimientos y ya se tiene pruebas
estandarizadas que se elaboran a partir de
preparados comerciales que son medios de cultivo
conteniendo el compuesto sobre el cual las
enzimas bacterianas actúan complementado con
indicadores que ponen de manifiesto la reacción
que se llevó a cabo.
En el laboratorio se llevan a cabo diversos tipos de
análisis bioquímicos:
Pruebas en Tubo de ensayo: En este caso
requieren patrones de inoculación específicos
para los tubos con agar inclinado, con medio
sólido horizontal o con medio semisólidos. En
el caso del tubo con agar inclinado, la
inoculación se realiza a partir de una colonia
aislada tomada de una placa petri. Con el asa
se traslada el inoculo a la superficie del medio
que se siembra por estrías, a veces es
necesario practicar una incisión en la superficie
del agar, la cual no debe llegar hasta el fondo.
La inoculación de algún medio sólido
presentado en tubo de ensayo con superficie
horizontal, se realiza utilizando un alambre
recto. El método de sembrado consiste en
inocular por picadura evitando llegar hasta el
fondo del medio.
Los medios semisólidos se emplean para los
estudios de movilidad (Medio SIM); se inocula
utilizando un alambre recto tratando que la
incisión no llegue al fondo del tubo.
El laboratorio dentro del protocolo de
aislamiento de Salmonellas. Maneja tres
pruebas bioquímicas para discriminar entre
cepas:

12 | P á g i n a
Prueba de descarboxilación de la Lisina
(LIA): Esta prueba mide la capacidad
enzimática de un organismo para descarboxilar
un aminoácido formando una amina, con la
consiguiente alcalinidad. El LIA es un medio
diferencial empleado para caracterizar las
Entero bacterias. Es muy útil para diferenciar
tempranamente cepas
de Salmonella y Arizona de Citrobacter.
Urea: Esta prueba determina la capacidad de
un organismo para desdoblar, la Urea,
formando dos moléculas de amoniaco por
acción de la enzima ureasa. Esta prueba se
utiliza para diferenciar los organismos del
género Proteus rápidamente ureasas positivas
de otros miembros de las Entero bacterias.
Prueba del medio Triple Sugar Iron (TSI): Esta
prueba determina la capacidad de un
organismo de atacar un hidrato de carbono
específico en un medio de crecimiento básico,
con la producción o no de gases, junto con la
determinación de posible producción de ácido
sulfhídrico.
Las Técnicas de API, son un recurso rápido para el
diagnóstico bacteriano, consiste en tiras que
contiene micro tubos para evaluar las reacciones
específicas de las bacterias. Este método da un
patrón de reacción que difiere entre especies y
subespecies; este recurso es utilizado en etapas
finales de la identificación bacteriana. El Laboratorio
de Bacteriología de alimentos cuenta con:
API 20 E: EL sistema de API 20 E facilita en 24
horas la identificación de Entero bacterias. También
puede identificar otras bacterias Gram negativas en
24 a 48 horas. Esta prueba posee los substratos
deshidratados para la demostración de la actividad
enzimática y fermentación de carbohidratos. Los
substratos se reconstituyen por la adición de una
suspensión bacteriana. Después de la incubación
los productos metabólicos se detectan por sistemas
indicadores o por la adición de reactivos.
API Listeria: El API Listeria contiene 10 pruebas
para obtener en 24 horas la identificación
bioquímica de aislamientos de Listeria. Esta prueba
abarca el 85% de las cepas de Listeria, también se
puede diferenciar entre Listeria monocytogenes y L.
innocua en base a la ausencia de arilamidas.
Identificación bioquímica.
La forma de identificar las pruebas bioquímicas son
las siguientes:
Catalasa: es una enzima presente en la
mayoría de los microorganismos presentes que
poseen cito cromas. Las bacterias que
sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de
hidrogeno en agua y oxigeno gaseosa que
libera de forma de burbujas el principal objetivo
de esta prueba es separar micrococacceace (+)
de Streptococcus spp y Esterococcus spp (-).
Oxidasa: sirve para determinar la presencia de
enzimas oxidasas. La reacción de la Oxidasa
se debe a la presencia de un sistema
atrocomoxidosa que activa la oxidación de
autocroma el cual es residuo para el oxigeno
molecular produciendo agua.
Indol: se detecta la liberación de indol de un
cultivo bacteriana. Dicha liberación de debe a la
degradación del aminoácido triptófano
mediante la enzima triptofonaga.

Practica No. 3 Pruebas Bioquímicas

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