El documento describe un método para determinar manualmente la hemoglobina en sangre. El método implica la oxidación de la hemoglobina a cianmetahemoglobina usando ferricianuro de potasio, lo que produce un compuesto estable de color rojo que puede medirse fotométricamente. El procedimiento incluye la preparación de la muestra y el reactivo, la mezcla y reposo de la muestra en el reactivo, y la medición espectrofotométrica a 540 nm para cuantificar la hemoglobina en la muestra.

1. DETERMINACIÓN MANUAL DEDETERMINACIÓN MANUAL DE
HEMOGLOBINAHEMOGLOBINA
((CianmetahemoglobinaCianmetahemoglobina))

2. • El Fe(II) de la hemoglobina, oxihemoglobina yEl Fe(II) de la hemoglobina, oxihemoglobina y
carboxihemoglobina es oxidado a Fe(III) por elcarboxihemoglobina es oxidado a Fe(III) por el
ferricianuro, dando lugar a la metahemoglobina queferricianuro, dando lugar a la metahemoglobina que
en la presencia de ión cianuro, origina laen la presencia de ión cianuro, origina la
cianmetahemoglobina compuesto de color rojo ycianmetahemoglobina compuesto de color rojo y
estable, que se puede determinar fotométricamente.estable, que se puede determinar fotométricamente.
FUNDAMENTOFUNDAMENTO

3. MATERIALMATERIAL
Muestra:Muestra:
Sangre anticoagulada conSangre anticoagulada con
EDTA (Tapón morado)EDTA (Tapón morado)
MaterialesMateriales::
•Reactivo de Drabkin.Reactivo de Drabkin.
• Patrón de 15g/dl dePatrón de 15g/dl de
hemoglobina.hemoglobina.
• Material de laboratorio:Material de laboratorio:
Pipetas automáticas, tubosPipetas automáticas, tubos
desechables, puntas de pipeta,desechables, puntas de pipeta,
gradillas, cubetasgradillas, cubetas
espectrofotometro, etc.espectrofotometro, etc.
• Espectrofotómetro.Espectrofotómetro.

4. TÉCNICATÉCNICA
1.- Preparar el reactivo de trabajo a partir del reactivo de Drabkin1.- Preparar el reactivo de trabajo a partir del reactivo de Drabkin
concentrado, la dilución depende de la marca utilizada. Una vezconcentrado, la dilución depende de la marca utilizada. Una vez
preparada debe preservarse de la luz.preparada debe preservarse de la luz.

5. TÉCNICATÉCNICA
2.- Prepara en una gradilla tubo desechables (por ejemplo de capacidad 10ml), uno2.- Prepara en una gradilla tubo desechables (por ejemplo de capacidad 10ml), uno
por cada muestra más uno para el patrón, ya que lo tratarás como una muestrapor cada muestra más uno para el patrón, ya que lo tratarás como una muestra
más, y uno para el blanco (este puede ser opcional). No olvides identificar todosmás, y uno para el blanco (este puede ser opcional). No olvides identificar todos
los tubos.los tubos.
3.- Distribuye en cada tubo la cantidad de reactivo que marque el protocolo del3.- Distribuye en cada tubo la cantidad de reactivo que marque el protocolo del
fabricante que estés utilizando.fabricante que estés utilizando.

6. TÉCNICATÉCNICA
4.- Tras homogeneizar la sangre (ojo, no olvides nunca esta maniobra), toma la4.- Tras homogeneizar la sangre (ojo, no olvides nunca esta maniobra), toma la
cantidad que marque el protocolo (generalmente entre 10 y 20 μl de muestra).cantidad que marque el protocolo (generalmente entre 10 y 20 μl de muestra).

7. 5.- Mézclala con el reactivo de Drabkin. Repite esta operación para cada muestra5.- Mézclala con el reactivo de Drabkin. Repite esta operación para cada muestra
y para el patrón. Deja reposar entre 5 y 10 minutos.y para el patrón. Deja reposar entre 5 y 10 minutos.
TÉCNICATÉCNICA

8. 5.-Ha llegado el momento de realizar las medidas espectrofométricas:5.-Ha llegado el momento de realizar las medidas espectrofométricas:
• Ajusta la longitud de onda a 540 nm.Ajusta la longitud de onda a 540 nm.
• Haz un blanco utilizando reactivo de Drabkin.Haz un blanco utilizando reactivo de Drabkin.
• A continuación y utilizando distintas cubetas para cada muestra y para el patrónA continuación y utilizando distintas cubetas para cada muestra y para el patrón
ve tomando las lecturas de cada una de ellas.ve tomando las lecturas de cada una de ellas.
TÉCNICATÉCNICA

9. CONSIDERACIONESCONSIDERACIONES
1.1. Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.
2.2. Prepara todo el equipo y material previamente.Prepara todo el equipo y material previamente.
3.3. Comprueba las condiciones de la muestra: Identificación, ausencia deComprueba las condiciones de la muestra: Identificación, ausencia de
hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo), ausencia de burbujas,hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo), ausencia de burbujas,
condiciones de conservación, etc.condiciones de conservación, etc.
4.4. Los valores de hemoglobina de las distintas muestras se obtienenLos valores de hemoglobina de las distintas muestras se obtienen
relacionando la absorbancia del patrón, cuya concentración conocemos,relacionando la absorbancia del patrón, cuya concentración conocemos,
con las absorbancias de las distintas muestras sabiendo que en lascon las absorbancias de las distintas muestras sabiendo que en las
condiciones de trabajo existe una proporcionalidad directa entrecondiciones de trabajo existe una proporcionalidad directa entre
absorbancia y concentración.absorbancia y concentración.
Ejemplo:Ejemplo:
•Absorbancia patrón de 15 g/dl de hemoglobina es igual 0,420.Absorbancia patrón de 15 g/dl de hemoglobina es igual 0,420.
•Absorbancia de muestra de concentración de hemoglobina desconocida esAbsorbancia de muestra de concentración de hemoglobina desconocida es
igual a 0,390.igual a 0,390.
[Hb muestra] = (15 g/dl · 0,390) / 0,420 = 13,90 g/dl de hemoglobina[Hb muestra] = (15 g/dl · 0,390) / 0,420 = 13,90 g/dl de hemoglobina

10. CONSIDERACIONESCONSIDERACIONES
1.1. Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.
2.2. Prepara todo el equipo y material previamente.Prepara todo el equipo y material previamente.
3.3. Comprueba las condiciones de la muestra: Identificación, ausencia deComprueba las condiciones de la muestra: Identificación, ausencia de
hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo), ausencia de burbujas,hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo), ausencia de burbujas,
condiciones de conservación, etc.condiciones de conservación, etc.
4.4. Los valores de hemoglobina de las distintas muestras se obtienenLos valores de hemoglobina de las distintas muestras se obtienen
relacionando la absorbancia del patrón, cuya concentración conocemos,relacionando la absorbancia del patrón, cuya concentración conocemos,
con las absorbancias de las distintas muestras sabiendo que en lascon las absorbancias de las distintas muestras sabiendo que en las
condiciones de trabajo existe una proporcionalidad directa entrecondiciones de trabajo existe una proporcionalidad directa entre
absorbancia y concentración.absorbancia y concentración.
Ejemplo:Ejemplo:
•Absorbancia patrón de 15 g/dl de hemoglobina es igual 0,420.Absorbancia patrón de 15 g/dl de hemoglobina es igual 0,420.
•Absorbancia de muestra de concentración de hemoglobina desconocida esAbsorbancia de muestra de concentración de hemoglobina desconocida es
igual a 0,390.igual a 0,390.
[Hb muestra] = (15 g/dl · 0,390) / 0,420 = 13,90 g/dl de hemoglobina[Hb muestra] = (15 g/dl · 0,390) / 0,420 = 13,90 g/dl de hemoglobina