Este estudio evaluó el impacto de la prueba de producción de gas en la confirmación confiable de E. coli. Se evaluaron 547 cultivos ambientales aislados en varios medios de cultivo a 44 y 44.5°C. Los resultados mostraron que la confirmación de E. coli puede dar falsos positivos si la producción de gas no se evalúa y la confirmación se basa solo en la prueba de indol. Es importante incluir la prueba de producción de gas para evitar resultados erróneos en el análisis rutinario de E. coli.

1. Confirmación de Escherichia coli y su distinción
de especies de Klebsiella por
formación de gas e indol a 44 y 44.5° C
Carlos Alberto Orozco
Julián Andrés Dorado
Luís Felipe Arcos
William Andrés Aponte

2. RESUMEN
El objetivo de este estudio fue investigar el impacto del test de producción de gas en la
confiabilidad para la confirmación de E. coli
Métodos y Resultados
-El impacto de muchos medios de cultivo en el crecimiento, formación de gas y/o indol
fue evaluado a 44 y 44.5 ° C usando 547 cultivos medioambientales aislados.
-Se usaron principalmente E. coli, K. pneumoninae, K. oxytoca y E. cloacae.
Conclusiones
-La confirmación de E. coli falso – positivo es posible si la producción de gas no es
evaluada y para la confirmación esta basada solo en el test de Indol.
Importancia e Impacto del Estudio
Los resultados positivos erróneos en el análisis rutinario para E. coli pueden ocurrir

3. Introducción
-Recientemente, el test de producción de gas ha sido borrado en le
método Standard internacional (ISO 9308-1 2000).
-En este estudio se comparan 7 diferentes medios líquidos incubados a
44 y 44.5° C para producir crecimiento, gas o formación de indol
cuando se inocularon con más de 500 especies medioambientales
aisladas de E. coli y Klebsiella.
- Otras 250 sepas de Klebsiella de diferentes medioambientes y fuentes
fecales fueron identificadas y probadas para su máxima temperatura de
crecimiento, todas esas sepas fueron adicionalmente probadas para
producción de gas en caldo E. coli a 44.5° C.

4. Materiales y Métodos
-547 sepas de bacterias coliformes fueron estudiadas, dominantemente
especies de E. coli y Klebsiella, 24 Enterobacter, 3 Pantoea y 2 sepas
de Citrobacter.
-Para estudios de Tmax un nuevo set de 250 sepas de Klebsiella fue
aislado de diferentes fuentes:
- 209 especimenes de recibidos de NPHIH cultivadas en agar
conteniendo inositol y carbenicilina.
-Muestras de agua fueron colectadas en botellas estériles 1-1
borosilicato y transportadas enfriadas al laboratorio.
- Las sepas para el método de identificación fueron identificadas con
API 20E o con enterotube II

5. Diseño experimental
- las medidas se llevaron a cabo en dos laboratorios
- Usaron químicos del mismo fabricante y en algunos casos reactivos
de la misma botella.
- termómetros fueron calibrados contra el mismo termómetro certificado.
Medios para el Método de Comparación
Los medio usados fueron:
Caldo lactosa peptona (LP), caldo lactosa peptona con sal (LPS), caldo
bromocresol púrpura lactosa (BPL), Caldo lauril triptosa manitol con
triptófano (LTM), caldo triptona manitol ricinoleate (TMR), caldo triptona
triptófano sal (TTS); formaci{on de indol fue registrado en EC, LTM,
TMR, y TTS.

6. Preparación de Cultivos
-Los medios fueron mantenidos toda la noche a 44° C para mirar la
contaminación y falsa producción de gas.
-Crecimiento y producción de gas fueron leídos luego de 22 +- 2 h y 44
+- 4 h de incubación.
-La producción de gas fue medida en escala semicuantitativa -, +, ++ y
+++.
-Reactivo indol fue agregado solo dos días después de la incubación
cuando el experimento fue terminado.
- La reacción fue medida -, +, ++.
Tmax Estudios
- fue medida con la ayuda de un incubador gradiente-
temperatura en mCF agar.

7. DISCUSIONES
 El impacto de la composición del medio en el crecimiento fue especifico para las
especies, donde E. coli y K. pneumoniae crecieron bien todos los medios y Ent.
cloacae mostro mayor crecimiento en LTM.
 Ent. Cloacae fue sensible a la temperatura de incubación y al tiempo en medios
como LP, LPS, BLP y TMR.
 La temperatura influyo en la separación de las especies de Klebsiella.
 Los resultados que se presentaron en el trabajo mostraron lo sensitivo que es este
test a los medios utilizados.
 El mejor de los medios utilizados fue LTM: 95% de E. coli y 85% de K. pneumoniae
dieron una respuesta positiva en el test de gas con este medio
 De todas las cepas Pantoea agglomerans es la mas problemática debido a que se
encuentra en mucho residuo industrial y sus cepas son indol-positivo

8.  El indol positivo K. oxytoca no pudo crecer en un medio sólido mFC a 44°C o a
temperaturas mas altas de incubación sin embargo creció en medio liquido lo cual
demuestra la sensibilidad de este al medio de cultivo y a la temperatura de
incubación.
 La determinación de E. coli no fue totalmente eficiente con la prueba de indol a alta
temperatura por los falsos positivos de K. oxytoca.
 Para separar E. coli de las especies de Klebsiella, es necesario excluir K.
pneumoniae con la prueba del indol y K. oxytoca usando la prueba de producción de
gas.
 Todas las K. pneumoniae se excluyeron por el test negativo de la producción de
indol, al mismo tiempo pruebas de producción de gas a altas temperaturas fueron
utilizadas para la eliminación de falsos positivos.
 El método Standard internacional presente para coliformes y E. coli en el cual la
producción de gas se descarta como un criterio para la confirmación de E. coli, y
detección de falsos positivos de E. coli.

9.  Es posible basar la diferenciación de E. coli en un test totalmente diferente
como el de la β-glucuronidasa y el de los marcadores moleculares.
 Según trabajos de Shadix y Rice (1991) el medio EC a 44.5° C en un día
produjo un porcentaje de 11.7% de falsos negativos en la producción de
gas la cual esta cerca del 9.1% de este estudio en las mismas condiciones
pero alta con respecto al 4.5% en condiciones optimas.
 En su estudio 4.8% de las cepas de E. coli eran anaerogénicas e incapaces
de producir gas en el medio de fermentación de lactosa convencional a 35 y
44.5° C. la tasa correspondiente que se observo en este estudio fue del
3.6% en condiciones optimas.
 Es evidente que tanto las condiciones de incubación como la composición
del medio afectan la prueba de β-glucuronidasa, por eso es necesaria la
utilización de elementos traza en su dilución.

10. CONCLUSION
 La identificación de E. coli por pruebas fisiológicas no
esta exenta de incertidumbre. Cada una de las pruebas
de identificación y de confirmación para estas especies
no es absolutamente reproducible. Los resultados de
este estudio muestran como pequeñas diferencias en
las condiciones de la prueba afectan significativamente
los resultados de la misma. Bajo optimas condiciones, la
confirmación de E. coli produjo 6 % de falsos negativos
simultáneamente permitiendo un 7% de K. oxytoca dar
resultados falsos positivos. Esto es comparable a la tasa
de falsos negativos del 4.6% para las pruebas de β-
galactosidasa y β-glucuronidasa. Shadix y Rice (1991)