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Huiza Lorenzo Paola Aracelli
Huayllani Huanca, Kassandra del Carmen
Mamani Alavarez, Olenka Fiorella
CURSO:
Biotecnología
DOCENTE:
Soto Gonzales, Hebert Hernan
ELABORADO POR:
Informe de
Práctica de
Laboratorio
de Sistema de
Electroforesis
2023
“AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO.”
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA
AMBIENTAL
BIOTECNOLOGÍA
“INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO DE SISTEMA DE
ELECTROFORESIS”
DOCENTE:
BLGO. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN
INTEGRANTES:
AROCUTIPA TICONA, MIRIAM ELIZABETH
CALLACONDO GUILLEN, YOSELYN
FLORIAN OPE, ALANNA SASHA
HUAYLLANI HUANCA, KASSANDRA DEL CARMEN
HUIZA LORENZO, PAOLA ARACELLI
MAMANI ALVAREZ, OLENKA FIORELLA
ILO, 14 DE JULIO DEL 2023
1
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ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................3
2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 4
2.1. Objetivo General........................................................................................................... 4
2.2. Objetivos Específicos....................................................................................................4
3. MARCO TEÓRICO............................................................................................................ 4
¿Qué es el ADN?..................................................................................................................4
¿Qué es el Gel de Agarosa?..................................................................................................5
Sistema de Electroforesis..................................................................................................... 7
4. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO......................................................................8
MATERIALES.....................................................................................................................8
EQUIPOS.............................................................................................................................9
REACTIVOS..................................................................................................................... 10
5. METODOLOGÍA...............................................................................................................11
Preparación del Gel de Agarosa......................................................................................... 11
Electroforesis......................................................................................................................14
6. RESULTADOS................................................................................................................... 18
7. DISCUSIÓN........................................................................................................................18
8. CONCLUSIONES..............................................................................................................19
9. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................19
10. ANEXOS........................................................................................................................... 20
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1. INTRODUCCIÓN
El acelerado desarrollo de las técnicas de laboratorio conlleva consigo una cantidad de
metodologías, las cuales una o más metodologías llevarían a un mismo fin, solo si el
caso lo permite.
En este caso el sistema de electroforesis en geles de agarosa es una de las
metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo
con ácidos nucleicos. Así mismo, mediante la electroforesis se puede separar
fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una
sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de los ácidos nucleicos de
una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza.
Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para
posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.
La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar
muestras de ADN corresponde a Vin Thorne (bioquímico del Instituto de Virología de
Glasgow). Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de
fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología
en diferentes moléculas de ADN, este era el principio en que se basaba la
electroforesis de ácidos nucleicos.
En el presente informe describiremos la práctica desarrollada en el laboratorio de
biotecnología, el cual nos mostró el desarrollo del sistema de electroforesis usando el
gel de agarosa, veremos el principio, el procedimiento, los materiales como también
el resultado de esta práctica. Cabe resaltar que la electroforesis de ADN fue, y sigue
siendo, una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del
ADN recombinante o ingeniería genética, además, su conocimiento y desarrollo es
útil para futuras investigaciones que requieran este procedimiento.
3
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
- Conocer el desarrollo del sistema de electroforesis de ADN.
2.2. Objetivos Específicos
- Hacer una descripción de todas las etapas de la técnica del sistema de
electroforesis, para llevar a un buen y mejor entendimiento.
- Conocer el resultado de la técnica con las cuatro muestras utilizadas en el
desarrollo de la práctica.
3. MARCO TEÓRICO
¿Qué es el ADN?
El ADN es la base de los organismos vivos y a su vez contiene el código o
instrucciones que lo componen. El ADN consta de dos cadenas, cada una de las cuales
está formada por nucleótidos. Cada nucleótido a su vez consta de un azúcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Hay cuatro bases
nitrogenadas: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G), y A siempre es
opuesta a T y C en la doble cadena. Podría decirse que las causas opuestas son
complementarias. El ADN tiene la forma de una doble hélice, cuyos lados son
cadenas de azúcares y fosfatos unidos a bases nitrogenadas. Una molécula de ADN
está unida a proteínas llamadas histonas, que están fuertemente enrolladas y
compactadas para formar un cromosoma.
4
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Una prioridad importante del ADN es que puede replicarse o hacer de sí mismo, cada
cadena de ADN en la doble hélice puede servir como patrón para duplicar la
secuencia de bases, copia exacta de ADN presente en la célula antigua.
Las macromoléculas base de la herencia (ADN), el nucleico que contiene la
información de las características, en segmentos denominados genes o empaquetada
en cromosomas.
Figura 1: Estructura del ADN.
¿Qué es el Gel de Agarosa?
La agarosa es un polímero lineal de galactosa y el gel se obtiene disolviendo agarosa
en tampón TAE o TBE y fundiéndose en un horno de microondas hasta obtener una
solución homogénea y transparente. Se vierte la solución en un molde y se coloca un
peine (el peine forma los pozos en los que se colocan las muestras). Esto se deja
enfriar para polimerizar para formar una matriz porosa, donde el tamaño de los poros
varía según la concentración de agarosa en la solución. Además, la migración de los
5
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fragmentos de ADN varía según el tamaño, la forma de la molécula (lineal, circular,
superenrollada), la concentración de agarosa en el gel, el voltaje, la dirección del
campo eléctrico, la presencia de colorantes añadidos . que se intercalan en el gel.
ADN (como bromuro de etidio y verde SYBR) y composición del tampón en el gel.
El gel contiene capilares microscópicos que actúan como "tamices" moleculares, las
propiedades del gel determinan la velocidad de migración de las moléculas: las
pequeñas moléculas migran más rápidamente que las grandes, además, las moléculas
de misma masa y carga pueden tener formas distintas: las de forma más compacta (las
formas redondeadas son más compactas que las formas alargadas) migran más
rápidamente.
Figura 2: Procedimiento para Gel de Agarosa.
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Sistema de Electroforesis
La electroforesis es una técnica de separación muy usada en las investigaciones de
proteínas y ácidos nucleicos, que se basa en la movilización de las moléculas
disueltas en una solución de electrolitos a través de un gel por la acción de la corriente
eléctrica. Esta técnica fue desarrollada basándose en investigaciones adelantadas por
varios investigadores interesados en explicar por qué los iones disueltos en agua se
mueven bajo la influencia de una corriente eléctrica, dichas investigaciones
describieron la migración de los iones y el orden en que lo hacían, pero no lograron
separar moléculas o partículas.
La carga de las moléculas es influenciada por el pH de la solución(medida de la
acidez o alcalinidad) y ésta es controlada en la electroforesis con
soluciones amortiguadoras como el que se utiliza para cargar la muestra, el que
se utiliza en el gel y el de corrida de la electroforesis. Una solución
amortiguadora es definida como un sistema químico que previene cambios de pH
cuando iones de hidrógeno son removidos o añadidos en la solución que mantienen
el pH aproximadamente a 8.3.
Las técnicas de electroforesis revolucionaron los métodos de análisis de biomoléculas
y la caracterización de microorganismos en diversos campos de las ciencias
biológicas como las microciencias (genómica, transcriptómica, proteómica,
metagenómica) porque estas técnicas se combinaban con otras plataformas como la
PCR, técnicas de secuenciación de nueva generación. y espectroscopia de masas
combinada con, entre otras cosas, cromatografía líquida, que permitió una mejor
resolución y precisión de los resultados de las pruebas. Sin embargo, las limitaciones
asociadas con esta tecnología deben abordarse para mejorar la composición,
funcionamiento y cambios en el tiempo de los sistemas biológicos.
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4. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
MATERIALES
Papel aluminio Guantes de látex
Para film Probetas
Tijeras Micropipetas y puntas desechables para las
mismas
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Bolsa ziploc Tubos eppendorf de 1,5 mL
EQUIPOS
Balanza analítica Microondas o placa calefactora
Equipo de tratamiento de imagen y
fotografía térmica
Equipo de electroforesis (cubeta, soporte,
peine, fuente de alimentación)
9
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Powerpac Básico Bio-Rad Foto documentador de geles
REACTIVOS
Agarosa de Macroalgas 1kb DNA (1 μl)
Tris-Acetate-EDTA (TAE) (20 ml) ADN 3 de cangrejo (4 μl)
10
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Agua destilada ADN 4 de cangrejo (4 μl)
Tampón de carga de las muestras. Bromuro de Etidio (BrEt)
5. METODOLOGÍA
Preparación del Gel de Agarosa
Paso 1:
Prepararemos el gel de agarosa al 1%, para ello en un pedazo de papel aluminio,
pesamos 1 gramo de agarosa.
11
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Figura 3: Pesar la Agarosa de Macroalgas.
Paso 2:
Ahora tomaremos el Tris-Acetate-EDTA (TAE), tomaremos 20 ml de TAE y lo
colocaremos en una probeta, en donde también se colocará 980 ml de agua destilada
para aforar hasta 1000 ml de la probeta.
Figura 4: Preparación de solución de 1xt.
Paso 3:
Después de haber aforado la probeta, lo tapamos con Parafilm y removemos para
mezclarlo. Esta solución será nuestra 1xt y lo vaciamos en una botella de vidrio.
12
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Figura 5: Preservar la solución de 1xt.
Paso 4:
En un frasco de pyrex, vertemos la agarosa que pesamos anteriormente y añadiremos
100 ml de la muestra de 1xt. Moveremos el frasco con la solución.
Figura 6: Preparación del Gel de Agarosa.
Paso 5:
Colocamos el frasco con la solución en el microondas por 1 minuto y medio para
homogeneizar la muestra. Luego esperamos un tiempo para que baje su temperatura y
poder manipularlo.
13
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Figura 7: Llevar al microondas la solución y enfriar.
Electroforesis
Paso 6:
Armaremos la cubeta de electroforesis, colocaremos las placas a los costados, y
también el peine.
Figura 8: Armado de la cubeta.
Paso 7:
Una vez armado la cubeta vertemos la solución preparada y esperamos un tiempo para
que se solidifique.
14
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Figura 9: Verter el gel de agarosa.
Paso 8:
Una vez solidificado, quitamos el peine y las placas, y vertemos en la cubeta la
solución 1xt TAE.
Figura 10: Vertemos la solución 1xt TAE.
Paso 9:
En un pedazo de Parafilm colocaremos 4 muestras las cuales contendrán 4 microlitros
de colorante.
● En la primera muestra se colocará 1 microlitro de 1kb DNA.
● En la segunda muestra se colocará 4 microlitros de ADN 3 de cangrejo
● En la tercera muestra se colocará 4 microlitros de ADN 4 de cangrejo.
● En la cuarta muestra no se colocará nada, y será nuestro blanco.
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Figura 11: Preparación de las muestras.
Paso 10:
Con ayuda de una micropipeta, colocaremos nuestras muestras en los orificios dejados
por el peine, en el mismo orden por el cual fueron elaborados.
Figura 12: Colocación de las muestras en el gel de agarosa.
Paso 11:
Taparemos la cubeta y la conectaremos con el Powerpac Básico Bio-Rad.
Encendemos el aparato y esperamos alrededor de 1 hora.
16
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Figura 13: Funcionamiento del Powerpac Básico.
Paso 12:
Luego de haber pasado la hora, lo que haremos es colocar el de agarosa con nuestras
muestras y colocarlas en un recipiente cubierto con papel aluminio el cual contendrá
bromuro de etidio, dejamos reposar por 10 minutos.
Figura 14: Reposo del gel de agarosa en el bromuro de etidio.
20Paso 13:
Lo sacamos y lo colocamos en una bolsa ziploc y luego lo colocamos en el
fotodocumentador de geles y esperamos nos arrojen los resultados.
17
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6. RESULTADOS
La electroforesis permite a los científicos separar las hebras de ADN, permitiendo así
facilitar la identificación y examinación de sus componentes. A medida que el ADN
se mueve a través del gel, ayuda a separar las secciones mayores y menores entre sí.
Para ya finalizar , una vez colocado en el fotodocumentador de geles , se esperó 1
hora y se fue a ver los resultados , los cuales fueron los siguientes que se muestran en
la figura 15.
Figura 15: Lectura de los resultados.
Podemos observar las bandas de los geles posteriores a la electroforesis realizada.
7. DISCUSIÓN
Según los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio realizada, podemos
afirmar que el sistema de electroforesis es capaz de separar cualquier tipo de muestra
ADN según el tamaño que presente. Las muestras de ADN se cargan en pozos que
vienen a ser las ranuras, aplicadas en un extremo del gel a la cual se le aplica una
corriente eléctrica para ser arrastradas a través del gel.
18
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Uno de los fragmentos presenta carga negativa debido a esto se mueven hacia el
electrodo positivo, y todo gracias al grupo fosfato, y esto uno ves expuesto a un
campo y a un buffer, hacia el lado positivo es donde se realiza la electroforesis, y de
tal manera es como se presentan los resultados observándose mediante la
fluorescencia.
8. CONCLUSIONES
En conclusión, el sistema de electroforesis implementado demostró ser una
herramienta eficaz para el análisis de muestras de ADN. El proceso de preparación del
gel de agarosa, la carga de las muestras y la aplicación de corriente eléctrica
permitieron la separación y visualización de los fragmentos de ADN. Estos resultados
contribuyen al conocimiento y comprensión de la estructura y composición genética
de las muestras analizadas.
9. BIBLIOGRAFÍA
● Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares
aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos, 27.
● Pérez de Castro, A. M. (2010). Electroforesis en gel de agarosa.
● Pérez Cardona, A., & Gómez Piñerez, L. M. (2018). Electroforesis de ácido
desoxirribonucleico (ADN) en gel de agarosa.
● Porath, J., Aspberg, K., Drevin, H., & Axen, R. (1973). Preparation of
cyanogen bromide-activated agarose gels. Journal of Chromatography A, 86,
53-56.
● Miguel-Morales, M., Díaz-Barroso, M., Garrote-Santana, H., Uley-del
Rosario, G., Pérez-Diez de los Ríos, G., & Estrada-del Cueto, M. (2012).
19
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Cuantificación de hemoglobina A2 por electroforesis en gel de agarosa.
Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 28(4),
423-427.
● Andrés Colás, N., & Yenush, L. P. (2021). Electroforesis en gel de
poliacrilamida.
10. ANEXOS
Anexo N° 01 Gel de agarosa solidificado
Anexo N° 02 Muestra de gel de agarosa en microondas
20

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Informe de Práctica de Laboratorio de Sistema de Electroforesis.pdf

  • 1. Arocutipa Ticona, Miriam Elizabeth Callacondo Guillen, Yoselyn Florian Ope, Alanna Sasha Huiza Lorenzo Paola Aracelli Huayllani Huanca, Kassandra del Carmen Mamani Alavarez, Olenka Fiorella CURSO: Biotecnología DOCENTE: Soto Gonzales, Hebert Hernan ELABORADO POR: Informe de Práctica de Laboratorio de Sistema de Electroforesis 2023
  • 2. “AÑO DE LA UNIDAD, LA PAZ Y EL DESARROLLO.” UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL BIOTECNOLOGÍA “INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO DE SISTEMA DE ELECTROFORESIS” DOCENTE: BLGO. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN INTEGRANTES: AROCUTIPA TICONA, MIRIAM ELIZABETH CALLACONDO GUILLEN, YOSELYN FLORIAN OPE, ALANNA SASHA HUAYLLANI HUANCA, KASSANDRA DEL CARMEN HUIZA LORENZO, PAOLA ARACELLI MAMANI ALVAREZ, OLENKA FIORELLA ILO, 14 DE JULIO DEL 2023 1
  • 3. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN................................................................................................................3 2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 4 2.1. Objetivo General........................................................................................................... 4 2.2. Objetivos Específicos....................................................................................................4 3. MARCO TEÓRICO............................................................................................................ 4 ¿Qué es el ADN?..................................................................................................................4 ¿Qué es el Gel de Agarosa?..................................................................................................5 Sistema de Electroforesis..................................................................................................... 7 4. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO......................................................................8 MATERIALES.....................................................................................................................8 EQUIPOS.............................................................................................................................9 REACTIVOS..................................................................................................................... 10 5. METODOLOGÍA...............................................................................................................11 Preparación del Gel de Agarosa......................................................................................... 11 Electroforesis......................................................................................................................14 6. RESULTADOS................................................................................................................... 18 7. DISCUSIÓN........................................................................................................................18 8. CONCLUSIONES..............................................................................................................19 9. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................19 10. ANEXOS........................................................................................................................... 20 2
  • 4. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 1. INTRODUCCIÓN El acelerado desarrollo de las técnicas de laboratorio conlleva consigo una cantidad de metodologías, las cuales una o más metodologías llevarían a un mismo fin, solo si el caso lo permite. En este caso el sistema de electroforesis en geles de agarosa es una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo con ácidos nucleicos. Así mismo, mediante la electroforesis se puede separar fragmentos de ADN y ARN en función de su tamaño, visualizarlos mediante una sencilla tinción, y de esta forma determinar el contenido de los ácidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimación de su concentración y grado de entereza. Podemos además extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de interés, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones. La idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de ADN corresponde a Vin Thorne (bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow). Su razonamiento era que una combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permitiría el desplazamiento y separación en función del tamaño o topología en diferentes moléculas de ADN, este era el principio en que se basaba la electroforesis de ácidos nucleicos. En el presente informe describiremos la práctica desarrollada en el laboratorio de biotecnología, el cual nos mostró el desarrollo del sistema de electroforesis usando el gel de agarosa, veremos el principio, el procedimiento, los materiales como también el resultado de esta práctica. Cabe resaltar que la electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética, además, su conocimiento y desarrollo es útil para futuras investigaciones que requieran este procedimiento. 3
  • 5. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo General - Conocer el desarrollo del sistema de electroforesis de ADN. 2.2. Objetivos Específicos - Hacer una descripción de todas las etapas de la técnica del sistema de electroforesis, para llevar a un buen y mejor entendimiento. - Conocer el resultado de la técnica con las cuatro muestras utilizadas en el desarrollo de la práctica. 3. MARCO TEÓRICO ¿Qué es el ADN? El ADN es la base de los organismos vivos y a su vez contiene el código o instrucciones que lo componen. El ADN consta de dos cadenas, cada una de las cuales está formada por nucleótidos. Cada nucleótido a su vez consta de un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Hay cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G), y A siempre es opuesta a T y C en la doble cadena. Podría decirse que las causas opuestas son complementarias. El ADN tiene la forma de una doble hélice, cuyos lados son cadenas de azúcares y fosfatos unidos a bases nitrogenadas. Una molécula de ADN está unida a proteínas llamadas histonas, que están fuertemente enrolladas y compactadas para formar un cromosoma. 4
  • 6. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Una prioridad importante del ADN es que puede replicarse o hacer de sí mismo, cada cadena de ADN en la doble hélice puede servir como patrón para duplicar la secuencia de bases, copia exacta de ADN presente en la célula antigua. Las macromoléculas base de la herencia (ADN), el nucleico que contiene la información de las características, en segmentos denominados genes o empaquetada en cromosomas. Figura 1: Estructura del ADN. ¿Qué es el Gel de Agarosa? La agarosa es un polímero lineal de galactosa y el gel se obtiene disolviendo agarosa en tampón TAE o TBE y fundiéndose en un horno de microondas hasta obtener una solución homogénea y transparente. Se vierte la solución en un molde y se coloca un peine (el peine forma los pozos en los que se colocan las muestras). Esto se deja enfriar para polimerizar para formar una matriz porosa, donde el tamaño de los poros varía según la concentración de agarosa en la solución. Además, la migración de los 5
  • 7. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL fragmentos de ADN varía según el tamaño, la forma de la molécula (lineal, circular, superenrollada), la concentración de agarosa en el gel, el voltaje, la dirección del campo eléctrico, la presencia de colorantes añadidos . que se intercalan en el gel. ADN (como bromuro de etidio y verde SYBR) y composición del tampón en el gel. El gel contiene capilares microscópicos que actúan como "tamices" moleculares, las propiedades del gel determinan la velocidad de migración de las moléculas: las pequeñas moléculas migran más rápidamente que las grandes, además, las moléculas de misma masa y carga pueden tener formas distintas: las de forma más compacta (las formas redondeadas son más compactas que las formas alargadas) migran más rápidamente. Figura 2: Procedimiento para Gel de Agarosa. 6
  • 8. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Sistema de Electroforesis La electroforesis es una técnica de separación muy usada en las investigaciones de proteínas y ácidos nucleicos, que se basa en la movilización de las moléculas disueltas en una solución de electrolitos a través de un gel por la acción de la corriente eléctrica. Esta técnica fue desarrollada basándose en investigaciones adelantadas por varios investigadores interesados en explicar por qué los iones disueltos en agua se mueven bajo la influencia de una corriente eléctrica, dichas investigaciones describieron la migración de los iones y el orden en que lo hacían, pero no lograron separar moléculas o partículas. La carga de las moléculas es influenciada por el pH de la solución(medida de la acidez o alcalinidad) y ésta es controlada en la electroforesis con soluciones amortiguadoras como el que se utiliza para cargar la muestra, el que se utiliza en el gel y el de corrida de la electroforesis. Una solución amortiguadora es definida como un sistema químico que previene cambios de pH cuando iones de hidrógeno son removidos o añadidos en la solución que mantienen el pH aproximadamente a 8.3. Las técnicas de electroforesis revolucionaron los métodos de análisis de biomoléculas y la caracterización de microorganismos en diversos campos de las ciencias biológicas como las microciencias (genómica, transcriptómica, proteómica, metagenómica) porque estas técnicas se combinaban con otras plataformas como la PCR, técnicas de secuenciación de nueva generación. y espectroscopia de masas combinada con, entre otras cosas, cromatografía líquida, que permitió una mejor resolución y precisión de los resultados de las pruebas. Sin embargo, las limitaciones asociadas con esta tecnología deben abordarse para mejorar la composición, funcionamiento y cambios en el tiempo de los sistemas biológicos. 7
  • 9. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 4. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO MATERIALES Papel aluminio Guantes de látex Para film Probetas Tijeras Micropipetas y puntas desechables para las mismas 8
  • 10. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Bolsa ziploc Tubos eppendorf de 1,5 mL EQUIPOS Balanza analítica Microondas o placa calefactora Equipo de tratamiento de imagen y fotografía térmica Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentación) 9
  • 11. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Powerpac Básico Bio-Rad Foto documentador de geles REACTIVOS Agarosa de Macroalgas 1kb DNA (1 μl) Tris-Acetate-EDTA (TAE) (20 ml) ADN 3 de cangrejo (4 μl) 10
  • 12. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Agua destilada ADN 4 de cangrejo (4 μl) Tampón de carga de las muestras. Bromuro de Etidio (BrEt) 5. METODOLOGÍA Preparación del Gel de Agarosa Paso 1: Prepararemos el gel de agarosa al 1%, para ello en un pedazo de papel aluminio, pesamos 1 gramo de agarosa. 11
  • 13. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 3: Pesar la Agarosa de Macroalgas. Paso 2: Ahora tomaremos el Tris-Acetate-EDTA (TAE), tomaremos 20 ml de TAE y lo colocaremos en una probeta, en donde también se colocará 980 ml de agua destilada para aforar hasta 1000 ml de la probeta. Figura 4: Preparación de solución de 1xt. Paso 3: Después de haber aforado la probeta, lo tapamos con Parafilm y removemos para mezclarlo. Esta solución será nuestra 1xt y lo vaciamos en una botella de vidrio. 12
  • 14. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 5: Preservar la solución de 1xt. Paso 4: En un frasco de pyrex, vertemos la agarosa que pesamos anteriormente y añadiremos 100 ml de la muestra de 1xt. Moveremos el frasco con la solución. Figura 6: Preparación del Gel de Agarosa. Paso 5: Colocamos el frasco con la solución en el microondas por 1 minuto y medio para homogeneizar la muestra. Luego esperamos un tiempo para que baje su temperatura y poder manipularlo. 13
  • 15. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 7: Llevar al microondas la solución y enfriar. Electroforesis Paso 6: Armaremos la cubeta de electroforesis, colocaremos las placas a los costados, y también el peine. Figura 8: Armado de la cubeta. Paso 7: Una vez armado la cubeta vertemos la solución preparada y esperamos un tiempo para que se solidifique. 14
  • 16. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 9: Verter el gel de agarosa. Paso 8: Una vez solidificado, quitamos el peine y las placas, y vertemos en la cubeta la solución 1xt TAE. Figura 10: Vertemos la solución 1xt TAE. Paso 9: En un pedazo de Parafilm colocaremos 4 muestras las cuales contendrán 4 microlitros de colorante. ● En la primera muestra se colocará 1 microlitro de 1kb DNA. ● En la segunda muestra se colocará 4 microlitros de ADN 3 de cangrejo ● En la tercera muestra se colocará 4 microlitros de ADN 4 de cangrejo. ● En la cuarta muestra no se colocará nada, y será nuestro blanco. 15
  • 17. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 11: Preparación de las muestras. Paso 10: Con ayuda de una micropipeta, colocaremos nuestras muestras en los orificios dejados por el peine, en el mismo orden por el cual fueron elaborados. Figura 12: Colocación de las muestras en el gel de agarosa. Paso 11: Taparemos la cubeta y la conectaremos con el Powerpac Básico Bio-Rad. Encendemos el aparato y esperamos alrededor de 1 hora. 16
  • 18. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Figura 13: Funcionamiento del Powerpac Básico. Paso 12: Luego de haber pasado la hora, lo que haremos es colocar el de agarosa con nuestras muestras y colocarlas en un recipiente cubierto con papel aluminio el cual contendrá bromuro de etidio, dejamos reposar por 10 minutos. Figura 14: Reposo del gel de agarosa en el bromuro de etidio. 20Paso 13: Lo sacamos y lo colocamos en una bolsa ziploc y luego lo colocamos en el fotodocumentador de geles y esperamos nos arrojen los resultados. 17
  • 19. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL 6. RESULTADOS La electroforesis permite a los científicos separar las hebras de ADN, permitiendo así facilitar la identificación y examinación de sus componentes. A medida que el ADN se mueve a través del gel, ayuda a separar las secciones mayores y menores entre sí. Para ya finalizar , una vez colocado en el fotodocumentador de geles , se esperó 1 hora y se fue a ver los resultados , los cuales fueron los siguientes que se muestran en la figura 15. Figura 15: Lectura de los resultados. Podemos observar las bandas de los geles posteriores a la electroforesis realizada. 7. DISCUSIÓN Según los resultados obtenidos en la práctica de laboratorio realizada, podemos afirmar que el sistema de electroforesis es capaz de separar cualquier tipo de muestra ADN según el tamaño que presente. Las muestras de ADN se cargan en pozos que vienen a ser las ranuras, aplicadas en un extremo del gel a la cual se le aplica una corriente eléctrica para ser arrastradas a través del gel. 18
  • 20. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Uno de los fragmentos presenta carga negativa debido a esto se mueven hacia el electrodo positivo, y todo gracias al grupo fosfato, y esto uno ves expuesto a un campo y a un buffer, hacia el lado positivo es donde se realiza la electroforesis, y de tal manera es como se presentan los resultados observándose mediante la fluorescencia. 8. CONCLUSIONES En conclusión, el sistema de electroforesis implementado demostró ser una herramienta eficaz para el análisis de muestras de ADN. El proceso de preparación del gel de agarosa, la carga de las muestras y la aplicación de corriente eléctrica permitieron la separación y visualización de los fragmentos de ADN. Estos resultados contribuyen al conocimiento y comprensión de la estructura y composición genética de las muestras analizadas. 9. BIBLIOGRAFÍA ● Fierro, F. F. (2014). Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología: aspectos teóricos y prácticos, 27. ● Pérez de Castro, A. M. (2010). Electroforesis en gel de agarosa. ● Pérez Cardona, A., & Gómez Piñerez, L. M. (2018). Electroforesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) en gel de agarosa. ● Porath, J., Aspberg, K., Drevin, H., & Axen, R. (1973). Preparation of cyanogen bromide-activated agarose gels. Journal of Chromatography A, 86, 53-56. ● Miguel-Morales, M., Díaz-Barroso, M., Garrote-Santana, H., Uley-del Rosario, G., Pérez-Diez de los Ríos, G., & Estrada-del Cueto, M. (2012). 19
  • 21. UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL Cuantificación de hemoglobina A2 por electroforesis en gel de agarosa. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 28(4), 423-427. ● Andrés Colás, N., & Yenush, L. P. (2021). Electroforesis en gel de poliacrilamida. 10. ANEXOS Anexo N° 01 Gel de agarosa solidificado Anexo N° 02 Muestra de gel de agarosa en microondas 20