Ensayo

1. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA
Lic.: QUÍMICA CLÍNICA
“WESTERN BLOT”
ASIGNATURA: LABORATORIO DE VIROLOGIA
DC. MAGDALENA GUADALUPE RODRIGUEZ SANTIAGO
ELABORADO POR:
06. COYOLT ZAHUANTITLA KEVIN
12. GALINDO RODRÍGUEZ ARIANA ELIZABETH
24. MÉNDEZ GUTIÉRREZ ALONDRA ALINE
25. MENDEZ GUTIERREZ GRACIELA ADRIANA
31. ROJAS AGUILAR GUADALUPE
FECHA:
29 DE AGOSTO 2022

2. Proteínas
PROTEÍNAS
▪ Las proteínas son biomoléculas formadas básicamente por
carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno.
▪ Son cadenas de aminoácidos que se pliegan adquiriendo
una estructura tridimensional que les permite llevar a
cabo miles de funciones.
AMINOÁCIDOS
▪ Son las unidades básicas que forman las proteínas
Bioquímica médica. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. Edit. Elsevier España (2007).

3. Definición y utilidad
Las proteínas se transfieren a una membrana de
nitrocelulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF),
donde se inmovilizan.(transferencia)
Uso de electroforesis en gel de
poliacrilamida, con el fin de separar las proteínas
antes de su identificación.
Proceso de separar proteínas e identificarlas en
una muestra biológica compleja
J.M. Casey, Y. Kim, P.R. Andersen. Human T-cell lymhotropic virus type III: immunologic characterization and primary
structure analysis of the major internal protein p24. J Virology., 55 (1985), pp. 417-423

4. Western Blot
Preparación de la muestra
Electroforesis en gel
Transferencia de proteínas
Inmunodetección
J.M. Casey, Y. Kim, P.R. Andersen. Human T-cell lymhotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure
analysis of the major internal protein p24. J Virology., 55 (1985), pp. 417-423

5. FUNDAMENTO
▪ La técnica del Western Blot fue descrita, por primera vez,
a finales de los setenta
▪ . Permite la inmunodetección de proteínas específicas de
interés en muestras y extractos proteicos complejos.
CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28
de agosto de 2022, de https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

6. GENERALIDADES
Principalmente
es una prueba de
identificación de
antígenos contra
VIH
Esta prueba
puede ser eficaz
en la detección
de
cisticercorosis,
hidatidosis.
Estas pruebas
son un poco
tardadas ya que
demoran entre 2
y 8 semanas
CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28
de agosto de 2022, de https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

7. TECNICAS
▪ Es una técnica de laboratorio que permite la
separación de las proteínas de acuerdo a
sus características físicas y al método
utilizado.
▪ Nos permite detectar antígenos contra el
VIH en la sangre , así como en la sangre y
cavidades bucales u orina
Técnicas
CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28
de agosto de 2022, de https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

8. ELECTROFORESIS
Técnica de
laboratorios
consiste en la
separación de las
moléculas de
ADN y ARN por
tamaño mediante
corriente
eléctrica.
Fundamento
⮚ Migración de solutos
⮚ Se mueven las partículas en base a:
⮚ Su carga neta
⮚ Peso molecular
⮚ Estructura tridimensional
CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28
de agosto de 2022, de https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

9. Ventajas
• Son inmunoensayos
• Sensibilidad de 0.1
nanogramos
• Detecta biomoléculas
(proteínas,enzimas y
hormanas)
Desventajas
• Tiene alto costo
• Requiere de varios
reactivos
• Alto consumo de
tiempo
• Solo se analiza un
numero muy limitado
de muestras
CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28
de agosto de 2022, de https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

10. CASO
CLÍNICO

11. Masculino de 70 años, con antecedentes personales de hipertensión, no fumador y bebedor moderado.
• El paciente ingresa por síndrome general y
afectación respiratoria. Hace 4 meses tiene
disnea de esfuerzo, opresión torácica, astenia
e hiporexia, ha perdido 10 Kg en 5 meses.
• sin fiebre, tos discreta con expectoración
blanquecina. Radiografía de tórax y abdomen
normales, en la analítica destacaban alteraciones
menores en la serie blanca (neutrófilos absolutos
7,3 mil/microlitro, 79,9%, linfocitos absolutos 1,2
mil/microlitro, 13%), y serología positiva de
Hepatitis B con Anti-HBc: Positivo, HBs-Ag:
Negativo, Anti HBs 7934 UI/l. Los marcadores
tumorales fueron negativos.
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA
HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

12. Progresivamente la disnea fue aumentando hasta ser II/IV siempre con opresión torácica y se acentuó la
pérdida de peso.
• Se le pidió una batería de pruebas y se objetivó
neumonía por Pneumocystis jiroveci con afectación
intersticial bilateral, insuficiencia respiratoria
aguda secundaria y gastritis por citomegalovirus
(múltiples úlceras agudas).
• Se trataba de un paciente con una
inmunodepresión severa por lo que se inició un
estudio por parte de Hematología y además se
pidió una nueva analítica para la determinación de
VIH
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON
WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

13. • Se realizó la serología anti-VIH en 2 ocasiones
con la técnica Elecsys HIV Combi PT que
resultaron negativas. Los valores obtenidos
fueron 0,8 en la primera determinación y 0,3
en la segunda.
• En el estudio hematológico se observaron:
• Linfocitos totales: 4.9% (19-48%)
• Poblaciones linfocitarias:
• Linfocitos CD3: 472.3 cells/microlitro (1292-
2004)
• Linfocitos CD4: 3.5 cells/microlitro (656-1245)
• Linfocitos CD8: 444 cells/microlitro (360-881)
• Cociente CD4/CD8: 0%
• Al poseer un resultado tan ajustado (0,8)
y a la vista de la información clínica, se
amplió el estudio y se realizó una nueva
determinación usando el kit
de bioblot, encontrando igualmente un
resultado de western blot negativo.
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA,
CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

14. Ante la discordancia entre las pruebas serológicas y el resto de pruebas de laboratorio y la situación clínica del paciente, con
(infección por Pneumocystis y citomegalovirus, ambas enfermedades definitorias de SIDA según el grupo de estudio del
SIDA-SEIM (GeSIDA) se decidió realizar la determinación de carga viral de VIH mediante PCR con el equipo COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HIV-1, version 2.0, que objetivo que el paciente poseía 353000 copias/ml (valor de Referencia:
< 20 copias/ml), con lo que se diagnostico definitivamente la infección por VIH estadio C3.
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA
HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf
Categorías clínicas
Categorías inmunológicas A infección aguda
asintomática o LPG
B infección sintomática no A
no
C procesos incluidos en la
definición del sida
1 A1 B1 C1
2 A2 B2 C2
3 A3 B3 C3
Categorías clínicas para la codificación del VIH en mayores de 13 años

15. La familia de los retrovirus es un grupo grande de virus. Uno de los
miembros de esta familia, que infecta al ser humano son los virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH). El virus de la inmunodeficiencia
humana, es el agente causal del Síndrome de Inmunodeficiencia
Adquirida (SIDA), enfermedad viral caracterizada por la ausencia de
respuesta inmunológica
VIH / SIDA
La transmisión vírica tiene lugar
por contacto sexual, exposición
a sangre, hemoderivados y
exposición perinatal El sitio de latencia del
virus son los linfocitos
TCD4 causantes de la
disfunción inmune
¿COMO SE TRANSMITE?
¿DONDE CAUSAN EL DAÑO?
También se conocen como linfocitos T4 o
"célula T auxiliar". ayudan a combatir
infecciones al hacer que el sistema
inmunitario destruya virus, bacterias y
otros gérmenes que pueden enfermarlo.
Las tres fases de infección por el VIH son
1) infección aguda
2) 2) infección crónica
3) 3) síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA).
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA
HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

16. Western Blot
Principalmente detectara antígenos presentes en la muestra.
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON WESTERN
BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

17. Caso clínico
En el laboratorio se realizó la serología anti-VIH
en 2 ocasiones con la técnica Elecsys HIV Combi PT que
resultaron negativas, primer resultado 0.8, segundo
resultado 0.3
En el estudio hematológico se observaron:
● Linfocitos totales: 4.9% (19-48%)
● Poblaciones linfocitarias: ·
● Linfocitos CD3: 472.3 cells/microlitro (1292-2004)
● Linfocitos CD4: 3.5 cells/microlitro (656-1245)
● Linfocitos CD8: 444 cells/microlitro (360-881)
● Cociente CD4/CD8: 0%
¿Por qué dio negativo en esta técnica?
solo el 10-20% de los infectados
asintomáticos presentan antigenemia
detectable, en cambio más del 70% de
los pacientes con SIDA la revelan
• Los pacientes de raza negra presentan con menor frecuencia
antigenemia
• La administración de antivirales disminuye la antigenemia como
consecuencia de una menor replicación viral.
• Las infecciones por patógenos oportunistas estimulan de un modo
indirecto la producción de antígenos.
Sistema inmunitario bajo
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de
https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

18. ✔ Pueden desaparecer los anticuerpos contra proteínas estructurales del virus como son la:
p24, p17, p55, etc.
✔ En algunos pacientes se ha observado la ausencia de criterios diagnósticos de positividad
mediante western Blot en esos meses finales de la enfermedad, como consecuencia del
intenso deterioro inmunitario
¿Por qué dio negativo en Western Blot?
La marcada inmunodepresión del paciente dio lugar a un falso negativo, ya que las técnicas
utilizadas para diagnosticar VIH se basan, fundamentalmente, en la búsqueda de anticuerpos.
Se decidió ampliar el estudio y realizar una nueva determinación usando el kit
de bioblot, encontrando igualmente un resultado de western Blot negativo.
se decidió realizar la determinación de carga viral de VIH mediante
equipo especial, que objetivo que el paciente poseía 353000 copias/ml
(valor de Referencia: < 20 copias/ml), con lo que se diagnostico
definitivamente la infección por VIH
En la fase final de la infección
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de
https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

19. ❑ Las pruebas de confirmación tienen como objetivo verificar que los resultados obtenidos con
las pruebas de escrutinio sean correctos
❑ La prueba de electroinmunotransferencia (Western Blot) es la principal prueba confirmatoria
de la actualidad. Básicamente consiste en la separación de las proteínas (antígenos virales)
obtenidos del cultivo del virus del VIH-1 lisados y purificados por centrifugación.
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA,
CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

20. ❑La proteína viral así obtenida se coloca en un
gel de poliacrilamida en forma de láminas
delgadas y luego se efectúa una electroforesis,
con lo que las proteínas de menor peso
molecular
❑Emigran más lejos en el gel, mientras que las
de mayor peso molecular se mantienen cerca
de su lugar de depósito. Después se
transfieren a una tira de nitrocelulosa y se
cortan en tiras de 3 a 5 mm de ancho.
❑Posteriormente, la prueba se basa en un
ensayo inmunoenzimático indirecto, sobre la
tira de nitrocelulosa que contiene todas las
proteínas constituyentes del virus VIH-1
Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., & Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de
https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf

21. 1.PREPARACION DE LA MUESTRA
es esencial para tener éxito en un ensayo de Western Blot ya que esto
conlleva a tener buen manejo con la muestra.
2.ELECTROFORESIS
son el agente desnaturalizante que se agrega al tampón durante este
procedimiento. PAGE significa electroforesis en gel de poliacrilamida, ya que
los geles están típicamente hechos de acrilamida polimerizada.
3. TRANSFERENCIA
las proteínas a otra superficie. Esto se debe a que los geles son un
sustrato pobre para la inmunodetección y debido a la fragilidad de los
mismo pueden romperse fácilmente. Por lo tanto, se realiza la
transferencia la proteína a una membrana más duradera para la posterior
inmunotinción. La membrana es un soporte sólido que une e inmoviliza las
proteínas, permitiendo así la detección de un anticuerpo.
4.INMUNOTINCION
son tinciones no específicas y mostrarán todas las proteínas de la
muestra
5.DETECCION
La detección de la proteína se puede hacer mediante métodos
directos o indirecto
Quimioluminiscencia
Fluorescencia
Colorimetría

22. Bibliografía
▪ Bioquímica médica. John W. Baynes, Marek H. Dominiczak. Edit. Elsevier España (2007).
▪ J.M. Casey, Y. Kim, P.R. Andersen. Human T-cell lymhotropic virus type III: immunologic
characterization and primary structure analysis of the major internal protein p24. J Virology., 55
(1985), pp. 417-423
▪ Delgado Cuesta, S., Briones Cuesta, E., Casáis Muñoz, S., Peña Pérez, I., Barba Cermeño, J. L., &
Poncela García, M. a. V. (2015). PACIENTE INFECTADO POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA, CON WESTERN BLOT NEGATIVO. CASO CLÍNICO. Revista
Electrónica de Biomedicina. Recuperado 26 de agosto de 2022, de
https://biomed.uninet.edu/2015/n2/delgado.pdf
▪ CECILIA OSPINA, M. A. R. T. A. (2000, 3 enero). FUNDAMENTOS DE LAS TECNICAS PARA
INFECCIONES. METODOS EXPERIMENTALES. Recuperado 28 de agosto de 2022, de
https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

23. Gracias por su
atención