Este documento describe la optimización de la separación y caracterización de compuestos con actividad antimicrobiana del alga Caulerpa prolifera. Los investigadores extrajeron compuestos del alga usando disolventes orgánicos y optimizaron su separación mediante cromatografía en capa fina y HPLC. Un compuesto se seleccionó por su actividad contra patógenos en bioensayos. El análisis por espectrometría de masas sugiere que el compuesto es un triterpeno con una masa molecular de 430. La caracteriz

1. COMPUESTOS DE DEFENSA CONSTITUTIVOS FRENTE A PATÓGENOS DEL ALGA Caulerpa prolifera.
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Rubio, L., 1Ezziyyani, M., 2Egea-Gilabert, C., 1Requena, M.E. y 1Candela, M. E.
Departamento de Biología Vegetal. Facultad de Biología, Universidad de Murcia, Campus de Espinardo, 30100 Espinardo
(Murcia), e-mail: mcandela@um.es
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Departamento de Producción Agraria. E.T.S. Ingeniería Agronómica. Universidad Politécnica de Cartagena, Paseo Alfonso
XIII, 52, 30203 Cartagena.
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INTRODUCCIÓN
Durante los últimos años se ha desarrollado un importante estudio sobre compuestos bioactivos presentes en algas marinas, la mayoría de estos compuestos son activos tanto frente a
patógenos animales como vegetales; el espectro de acción de dichos compuestos es muy amplío siendo efectivos contra bacterias, hongos y virus, por lo que los convierten en compuestos de
interés por su potencial aplicación como agentes microbicidas.
Las técnicas de caracterización para dichos compuestos son muy diversas, influenciadas por numerosos factores tanto del individuo como de su hábitat, por lo que a menudo es necesario
ajustar la metodología de trabajo y a los ensayos requeridos para analizar su actividad biológica.
El Mar Menor es una laguna costera situada en la Región de Murcia, sus condiciones ambientales difieren de las del Mediterráneo y hacen de ésta un entorno muy favorable para el
desarrollo de numerosas especies vegetales, animales y microbianas. El alga Caulerpa prolifera se encuentra ampliamente distribuida en el Mar Menor impidiendo el desarrollo de numerosas
algas de la ficoflora de la laguna. Su rápida proliferación se debe a la existencia de compuestos constitutivos que le permiten una mayor defensa frente a herbívoros y microorganismos respecto
a las algas de su entorno. Esta singularidad la convierte en una especie de máximo interés para el estudio de compuestos con actividad antimicrobiana de aplicación en los procesos de
biocontrol y biorremediación.
El objeto de este trabajo ha sido optimizar la separación y caracterización de compuestos con actividad antimicrobiana del alga Caulerpa prolifera, para ello, se obtuvieron extractos con
disolventes orgánicos optimizándose su separación mediante técnicas de cromatografía en TLC y HPLC; los compuestos se escogieron por su actividad frente a diferentes patógenos mediante
bioensayos de inhibición sobre TLC. Los compuestos seleccionados se analizaron por espectometría de masas, cuyos datos sugieren que se tratarían de triterpenos; la caracterización final se
realizará por resonancia magnética nuclear (rmn) y espectometría de infrarrojos (IR).
La producción de estos compuestos purificados se está ensayando como potenciales agentes de biocontrol en cultivo de pimiento en invernadero.
MATERIAL Y MÉTODOS
RESULTADOS
A
Fig. 1: Caulerpa prolifera (Mar
Menor). Detalle donde se puede
observar la presencia de herbívoros
sobre el alga
B
Fig. 2: Caulerpa prolifera: Material
preparado para la extracción de
compuestos antimicrobianos.
C
Cromatografía en capa fina (TLC):
- Soporte: Gel de sílice.
- Fase móvil: Hexano : Diclorometano : Metanol (4:5:1 v/v/v)
- Duración: 1 h. y 32 min.
Bioensayo:
C
- Se prepara el microorganismo patógeno a ensayar (inóculo bacteriano,
Enterococcus faecalis) añadiendo 1 ml del medio de crecimiento (caldo
nutritivo NB) a 9 ml de un medio selectivo y diferencial (Agarestreptococos KF), antes de solidificar.
Fig. 3: Soxhlet. El
disolvente empleado
para la extracción fue
éter
de
petróleo,
duración : 36 hrs.
- Se vierte sobre la placa cromatográfiada y se incuba en cámara
húmeda. A las 24 h. se recoge la banda con actividad diferenciada por la
ausencia de cambio de color del medio diferencial.
A: En el cromatograma de TLC la zona de inhibición
crecimiento microbiano aparece con un Rf de 0,95.
de
B: La separación por HPLC confirma la obtención del compuesto
puro, con un tiempo de retención de 1,1611 y una pureza de pico
del 99,77 %; con una λ max. UV: 216 nm.
C: El análisis por espectrometría de masas revela que el
compuesto inhibidor tiene un m/z 430 [M]+.
CONCLUSIONES:
Fig. 4: HPLC:
Fig. 5: Espectrometría de masas:
- Fase móvil: Hexano: Isopropanol (97:3 v/v).
- Inyección directa.
- Columna: Spherisorb W 10 µm (30x0.39 cm).
- Solvente: Metanol.
- Flujo: 2 ml/min.
- Cantidad: 10 microlitros.
AGRADECIMIENTOS:
1- Se ha puesto a punto una técnica por TLC que separa
correctamente un compuesto mayoritario con actividad
antimicrobiana del alga Caulerpa prolifera.
2- Se ha verificado mediante HPLC la pureza de dicho
compuesto.
3- Mediante espectrometría de masas se ha resuelto que el
compuesto tiene una masa molecular de 430, cuya formula
molecular correspondería con : C30 H 48 O característica de
triterpenos.
Luis Rubio está incorporado en el Programa Torres Quevedo del MCYT en Ramón Sabater, S. A.
XV Reunión SEFV & VIII Congreso Hispano-Luso de Fisiología Vegetal.
Palma de Mallorca, 16-19 Septiembre 2003.