El documento describe los métodos manuales de secuenciación de ácidos nucleicos, incluyendo el método químico de Maxam y Gilbert y el método enzimático de Sanger y Coulson. El método de Maxam y Gilbert usa sustancias químicas para fragmentar el ADN, mientras que el método de Sanger y Coulson usa la ADN polimerasa. Ambos métodos generan fragmentos de diferentes tamaños que pueden separarse y leerse para determinar la secuencia de nucleótidos. El documento también explica los principios y procedim

1. SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

2. ¿Qué es la secuenciación?
Finalidades de la Secuenciación
Métodos manuales
Métodos de 1ª Generación
Secuenciación Masiva: 2ª Generación
Secuenciación Masiva: 3ª Generación
Bases de Datos: Bioinformática

3. ¿Qué es la secuenciación de ácidos nucleicos?

4. ¿Qué es la secuenciación de ácidos nucleicos?
Conjunto de técnicas cuya finalidad es la
determinación y el orden de los nucleótidos
(A,C,G,T) en una cadena de ADN

5. Conjunto de técnicas cuya finalidad es la
determinación y el orden de los nucleótidos
(A,C,G,T) en una cadena de ADN
Consiste en la fragmentación de ADN,
secuenciación de los fragmentos y ensamble
por solapamiento de la secuenciación
¿Qué es la secuenciación de ácidos nucleicos?

6. Finalidades de la Secuenciación

7. Finalidades de la Secuenciación
Conocer las dianas
Enzimas de restricción

8. Finalidades de la Secuenciación
Conocer las dianas
Enzimas de restricción
Estudiar los mecanismos
que influyen en la
expresión de un gen

9. Finalidades de la Secuenciación
Conocer las dianas
Enzimas de restricción
Estudiar las mutaciones
Estudiar los mecanismos
que influyen en la
expresión de un gen

10. Finalidades de la Secuenciación
Conocer las regiones que
codifican una proteína

11. Finalidades de la Secuenciación
Conocer las regiones que
codifican una proteína
Predecir una proteína

12. Métodos Manuales

13. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert

14. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert
MÉTODO QUÍMICO

15. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert
MÉTODO QUÍMICO
Sanger y Coulson

16. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert
MÉTODO QUÍMICO
Sanger y Coulson
MÉTODO ENZIMÁTICO

17. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert
MÉTODO QUÍMICO
Sanger y Coulson
MÉTODO ENZIMÁTICO
¿POR QUÉ?

18. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert
MÉTODO QUÍMICO
Sanger y Coulson
MÉTODO ENZIMÁTICO
¿POR QUÉ?
USA SUSTANCIAS QUÍMICAS
PARA LA FRAGMENTACIÓN
DEL ADN
USA EL PROCESO DE LA ADN
POLIMERASA (ENZIMA)
PARA LA FRAGMENTACIÓN

19. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico

20. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
• Se marca la cadena de ADN con P 32 (elemento radioactivo)
por el extremo 5’
• Se divide el ADN en 4 alícuotas y cada alícuota se trata con
una sustancia química diferente, para su fragmentación.
• A+G : ácido fórmico
• G: Dimetil sulfato
• C: Hidracina + sales (NaCl)
• C+T: Hidracina más sales
• Se realiza una electroforesis en gel para la separación de los
fragmentos generados de cada reacción.
• Se realiza una autorradiografía que detecta la señal que
emite el P 32.
• Se realiza la lectura de las bandas negras marcadas por el
isótopo

21. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G

22. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
ACTIVIDAD

23. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
T
ACTIVIDAD

24. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
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G
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T
ACTIVIDAD

25. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
B
C
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I
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T
T
ACTIVIDAD

26. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
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3’
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T
T
G
ACTIVIDAD

27. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
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C
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F
G
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I
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T
T
G
G
ACTIVIDAD

28. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
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T
G
G
G
ACTIVIDAD

29. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
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T
G
G
G
C
ACTIVIDAD

30. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
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3’
T
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T
G
G
G
C
T
ACTIVIDAD

31. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
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3’
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T
T
G
G
G
C
T
T
ACTIVIDAD

32. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
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K
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T
T
G
G
G
C
T
T
A
ACTIVIDAD

33. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
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3’
T
A
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T
T
G
G
G
C
T
T
A
G
ACTIVIDAD

34. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
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K
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T
T
T
G
G
G
C
T
T
A
G
C
ACTIVIDAD

35. Métodos Manuales
Maxam y Gilbert: Método químico
LECTURA
• Se lee de abajo hacia arriba
• Abajo quedaría el extremo 5’ y arriba el 3’
• Para leer las bandas:
• C: Cuando se ve una banda en C y en C+T
• T: Cuando se ve una banda solo en C+T
• G: Cuando se ve una banda en G y en A+G
• A: Cuando se ve una banda solo en A+G
G A+G C+T C
5’
3’
T
A
B
C
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K
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T
T
T
G
G
G
C
T
T
A
G
C
5’ TTTTGGGCTTAGC 3’
ACTIVIDAD

36. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
FUNDAMENTO

37. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
• Se divide la muestra en 4 alícuotas para la reacción de 4 reacciones
de polimerización.
• Cada tubo de reacción contiene:
• Hebra molde de ADN (cadena a secuenciar)
• Un cebador marcado en su extremo 5’ con P 32 y
complementario al extremo 3’ de la hebra molde
• ADN polimerasa
• Los cuatro dNTP
• Uno de los cuatro ddNTP (marca la especificidad de la
reacción)
• Electroforesis en gel de poliacrilamida y autorradiografía del gel
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la secuencia
comlementaria
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

38. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

39. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
C
3’
5’
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

40. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
C
3’
5’
A
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

41. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
C
3’
5’
A
A
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

42. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
C
3’
5’
A
A
T
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

43. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
ACTIVIDAD
C
3’
5’
A
A
T
A
G
G
C
G
A
G
G
T
T
C
A
A
T
G
G
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G

44. Métodos Manuales
Sanger y Coulson: Método enzimático
• Lectura:
• Se lee de abajo hacia arriba (5’ a 3’) y la
secuencia complementaria inversa
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP:G
ACTIVIDAD
C
3’
5’
A
A
T
A
G
G
C
G
A
G
G
T
T
C
A
A
T
G
G
5’-CCATTGAACCTCGCCTATTG-3’

45. Métodos de 1ª Generación: Sanger Automatizado (Secuenciación por ciclos)
• Se basa en el mismo principio que el método Sánger
manual.
• Se amplifica el fragmento de ADN por PCR o
Clonación.
• Se marca cada uno de los ddNTP con un colorante
fluorescente diferente y no necesita alícuotas
separadas
• Se realiza una electroforesis capilar y los fragmentos
son detectados por un haz láser
• Cada fragmento aparece como un pico que se registra
en un ordenador
• La secuencia se lee en el ordenador directamente.
• Lectura:
• ddATP: A
• ddTTP: T
• ddCTP: C
• ddGTP: G

46. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
La Secuenciación Masiva permite la secuenciación de todo el genoma de una forma
más rápida, eficiente y de menor coste

47. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
La Secuenciación Masiva permite la secuenciación de todo el genoma de una forma
más rápida, eficiente y de menor coste
Requieren el empleo de herramientas informáticas
para el ensamblaje de las secuencias obtenidas
Utilizan un paso previo de clonación o PCR para
obtener muchas copias de cada molécula individual
No son lo suficientemente sensibles para la
secuenciación de una única molécula

48. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
Fases
Preparación del
ADN
Fragmentación
del genoma
Unión a
adaptadores
universales
Biblioteca de
fragmentos
Amplificación
ADN molde
Secuenciación
Reacciones de
secuenciación
Análisis de datos
Software de
análisis

49. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
454 Pirosecuenciación
Se basa en la producción de bioluminiscencia mediante
reacciones enzimáticas acopladas a la incorporación de
un nucleótido a una cadena de crecimiento.

50. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
454 Pirosecuenciación
• PCR por emulsión
• Se fragmenta el molde de ADN en
segmentos pequeños y se le añaden dos
primers, dNTPs y la polimerasa
• Se amplifica la secuencia, generando
esferas con miles de fragmentos de ADN
• Se clona cada micela y en una placa se
rellenan las celdillas con cada fragmento
y las enzimas sulfurilasa y luciferasa

51. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
454 Pirosecuenciación
• Se hace pasar un dNTP y una polimerasa
• Se une el dNTP y se libera PPi
• La ATP sulfurilasa convierte el PPi en ATP
• La Luciferasa convierte el ATP en luz
• Se mide el pulso de luz sabiendo que el nucleótido complementario se ha
unido
• La cantidad de luz emitida corresponde con el número de dNTPs unidos,
• Tras cada unión se limpia el sobrante de dNTPs
• Esta técnica da problemas con los homopolímeros
• Un software nos da la secuencia del
fragmento secuenciado en cada
pocillo.
• Ensamblando las secuencias
parciales obtenemos la secuencia del
ADN de partida

52. Secuenciación Masiva: 2ª Generación
Illumina
• Se usan terminadores marcados con
fluorocromos como en el método Sanger.
DIFERENCIA
• Se realizan millones de secuencias en cada
corrida.
• Posibilidad de eliminar la fluorescencia entre
cada corrida.
• Se desbloquea el C 3’ para que pueda
aceptar una nueva base para continuar con
la reacción.
• Resuelve el problema de los homopolímeros

53. Secuenciación Masiva: 3ª Generación
Ion Torrent
Se basa en la detección de microvariaciones de pH producidas
en una rección de polimerización
• Se inmoviliza el ADN molde, unido a un cebador y una ADN
polimerasa en un micropocillo con un sensor de pH.
• Se van pasando los dNTPs por los pocillos sin marcar, con
ciclos posteriores de lavado.
• Al incorporarse un dNTP se libera un H+ (varía el pH).
• El sensor reconoce la variación y el software establece la
secuencia de cada pocillo.
• Finalmente se ensambla cada fragmento para obtener la
secuencia completa.
Método más rápido que los de 2ª generación, ya que se
realiza en continuo sin tener que eliminar marcadores.

54. Secuenciación Masiva: 3ª Generación
Nanoporo
Método en tiempo real sin reacción de polimerización y sin
marcajes, basado en biosensores
• El biosensor consta de una membrana bicapa sometida a un
voltaje y atravesada por un nanoporo proteíco (crea un canal)
con un microelectrodo.
• A la proteína se liga una ADN polimerasa
• La molécula a sintetizar fluye por el nanoporo y provoca una
alteración de la corriente.
• Cada nucleótido genera una diferencia de potencial
característica, lo que permite secuenciar la molécula.
• Para secuenciar una molécula de ADN basta con hacer pasar una
de las cadenas por el nanoporo.
Método muy rápido y se puede miniaturizar. Abre las puertas a
los secuenciadores portátiles.

55. Base de datos: Bioinformática

56. Base de datos: Bioinformática
Las Bases de datos son archivos de datos que provienen de diferentes áreas
almacenados de modo uniforme y de uso público para toda la comunidad científica

57. Base de datos: Bioinformática
Las Bases de datos son archivos de datos que provienen de diferentes áreas
almacenados de modo uniforme y de uso público para toda la comunidad científica
BIBLIOGRÁFICAS
DE GENOMAS
DE SECUENCIAS DE
NUCLEÓTIDOS DE DATOS GEÉTICO-CLINICOS
DE VARIACIONES DEL
GENOMA HUMANO
DEPROTEÍNAS

58. Base de datos: Bioinformática
Las Bases de datos son archivos de datos que provienen de diferentes áreas
almacenados de modo uniforme y de uso público para toda la comunidad científica
BIBLIOGRÁFICAS
DE GENOMAS
DE SECUENCIAS DE
NUCLEÓTIDOS DE DATOS GEÉTICO-CLINICOS
DE VARIACIONES DEL
GENOMA HUMANO
DEPROTEÍNAS
IMPORTANTE
• Sean dinámicas
• Permitan el uso de datos por parte de investigadores
de todo el mundo
• Estén asequibles en la red