Doctoral thesis final exposition. IIB-INTECH 29/9/2010 10:30-12:30 by Martin Blasco. Degree: Ph. D. in Molecular Biology and Biotechnology. Theme, sex differentiation, temperature sex determination, steroidogenesis, androgen biosynthesis. LC-MS.

1. Esteroidogénesis y diferenciación sexual en el pejerrey Lic. Martín Blasco Director: Dr. Gustavo Somoza1 Co-Directora: Dra. Denise Vizziano2 IIB-INTECH Dpto. Oceanología. UdelaR.URUGUAY 1

2. Composición de la tesis Cuantificación de andrógenos Perfiles de expresión de marcadores Síntesis de andrógenos en órganos del pejerrey 2

3. Introducción. Determinación sexual y diferenciacióngonadal ♀ Determinación sexual Diferenciación gonadal ♂ 3 Devlin & Nagahama, 2002

4. Introducción. Mecanismos de determinación sexual ESD GSD GSD Temperatura XX XY pH ZW ZZ ♀ ♂ ♀ ♂ 4

5. Introducción. TSD en el pejerreybonaerense Odontesthesbonariensis ♀ 17° C ♂ 29° C 5 Strüssmann et al. 1997, Ito 2005

6. Introducción. Determinación sexual y diferenciación gonadal eclosión Diferenciación Gonadal EST TFH (17°C) TFMix (25°C) TFM (29°C) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 semanas post-eclosión 6

7. 7 Introducción. Diferenciaciónmorfológica en el pejerrey ♀ ♂ Determinación Primerossignos de diferenciación

8. 8 Introducción. Marcadorestempranos de la diferenciación ♀ cyp19a1a fst foxl sox9 nr0b1  dax1 ♂ dmrt1 nr5a1 sf-1 amh

9. Introducción. Sensibilidad a los esteroides 9 Adaptado de Piferrer, 2002

10. Introducción. Hipótesis los esteroidescomomediadores de la dif. Estrógenos Determinación sexual Diferenciación gonadal ¿Andrógenos? ♀ Estrógenos Yamamoto, T-O ,1969 Inh. Arom ♂ Andrógenos 10

11. 11 Introducción. Biosíntesis de esteroidessexuales en peces

13. Caracterización de enzimas clave para la síntesis de andrógenos.

14. Expresión temprana de las enzimas de la androgénesis.

15. Análisiscuantitativo de los andrógenos.12

16. Desarrollo de la estrategia de estudio La producción de esteroides es muydifícil de estudiar en los estadíostempranos Biología molecular para el estudio de la capacidadandrogénica. ¿Quéandrógenos son importantes? ¿Quéenzimasestáninvolucradas? Elección de genes. 13

17. 14 Capítulo I. Introducción. Estudio de la esteroidogénesis Espermatogénesis Caracteressexualessecundarios

18. Capítulo I. Materiales y métodos. “Bioquímicaclásica” Resolución Extracción Incubación TLC T. indif. Muestras T. juv. Etc. HPLC Fraccionamiento Identificacióndefinitiva DPMs/mg DPMs/pico 15

19. Cap. I. Resultados. Testículosanalizados Diferenciación Juveniles Adultos mpe IGS% Indiferenciado Experimento 16

20. Cap. I. Resultados. Síntesis de 11-KT en la gónadaindiferenciada (TFM) Semana 5 (TFM) Incubado con A4 11-KT 17

21. 18 Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículos de juveniles Meses 6,5 Incubados con 17P

22. 19 Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en testículosmaduros (17P) Incubados con 17P

23. Cap. I. Resultados. Identificación de 11-KT, 11β-OHA4 y 11-KA4 20

24. Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en ovarios (P.V.) Incubados con A4 ó 17P 21

25. Cap. I. Resultados. Esteroidogénesis en riñón Riñón 11β-OHA4 22

26. Cap. I. Discusión y conclusiones. 23 Semana 5 TFM 11-KT 11-KT ¿Hígado? Juveniles ¿Sangre? 11-KT 11β-OHA4 Adultos

27. 24 Cap. I. Discusión y conclusiones. A4 11β-OHA4 11-KA4 11-KT

28. Cap. I. Discusión y conclusiones. Androgénesis en otrosórganos Riñón 11β-OHA4 Ovario SNC Hígado 25

29. Potencialandrogénicodurante el desarrollogonadal ¿Andrógenos? Enzimas clave en la síntesis de andrógenos (P450-scc y P450-11b) Estudio de la expresión en tejidos Expresióntempranadurante el TSD y la diferenciación a TFM y TFH 26

30. Capítulo II. Patrones de expresióngénica Caracterización de las secuencias de cyp11a1 y cyp11b1 OligosqPCR Testículos ♀ Tejidos ♂ TFH TFM Sitios de expresión Perfiles de expresión t= 1, 2, ..9 spe 27

31. Capítulo II. Troncos y gónadas pre- y post-diferenciación 28

32. Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11a1 Región de unión a esteroide (Tsujita et al, 1993). Región de unión a adrenodoxina (Wada et al, 1992). Región de coordinación del grupohemo. 29

33. Cap. II. Resultados. Secuencia y características de la cyp11b1 Sitio de unión a esteroides Unión a oxígeno (C) Región de Ozol (D) Sitioaromático, (E) Sitio de unión al hemo 30

34. Cap. II. Resultados. P450-scc y P450-11b porClustalW 31

35. Cap. II. Resultados. Sitios de expresión de cyp11a1 y cyp11b1 ♀ ♂ 32

36. Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a1 y cyp11b1 en troncos (1-8) 33

37. Cap. II. Resultados . Expresión de cyp11a, 11b1, 19a1a en gónadas 34

38. 35 Cap. II. Resultados . Marcadores de la diferenciacióngonadal

39. Cap. II. Discusión y conclusiones cyp19a1a ♀ nr5a1 ♂ 11-KT cyp19a1a cyp11b1 amh sox9 dmrt1 nr5a1 36

41. Necesidad de conjugación (haptenos)

42. Reactividadcruzada

43. Disponibilidadcomercial (síntesisa medida)+ RIA(EIA) LC + fraccionador + extracción + RIA (3 días) 37

44. 38 Capítulo III. Estrategia HPLC-ESI-MS Esteroides de interésmedidospor RIA en un modeloconocido Carassiusauratus

45. Cap. III. Materialesy métodos. Ionesmoleculares y linealidad Estándares de esteroides 1 ppm SCAN LC-MS ENFOCADO 0,2-50 ppb 39

46. Cap. III. Materiales y métodos. Determinaciones en plasma Evaporación Extracto en fase móvil (CH3CN:H2O) Histología gonadal [HE:E] Extracción orgánica [Partición-Congelación] Centrifugación 30 min x 350 rcf Extracción por punción del pedúnculo caudal LC-MS 40

47. Cap. III. Resultados. Espectrosde masaen modo SCAN 41

48. Cap. III. Resultados. Resolución, LD, LQ en modoenfocado (SIM) LQ LD 42

49. 43 Cap. III. Resultados . Concentracionesséricas en goldfish

51. Reaccióncruzada

52. TrazadorEIA-RIA + RIA LC + fraccionador + extracción (acondicionamiento) + RIA (3 días)

53. Cap. III. Conclusiones Cuantificaciónsimultánea de T, 11-KT y 11β-OHA4. Los niveles de detección y cuantificaciónpermitenestudiosfisiológicos. Compatible con otrossistemas (porej. MS/MS). Estudio de bioquímica de esteroides (metabolómica). 45

54. 46 Cap. III. Proyecciones Relacióngónada Circulación Estudio de viasmetabólicascompletas Aplicación Análisis de 11-KT/11β-OHA4 en otrosvertebrados

55. 47 Cap. III. Proyecciones. Anticipo. Macho espermiante Suero

56. 48 Conclusionesgenerales Identificación de los principalesandrógenostesticulares. A4 11β-OHA4 11-KA4 11-KT Machos en diferenciación molecular  11-KT Dimorfismo en cyp11a1 y cyp11b1  Desarrollo testicular temprano Herramientasparaestudio de andrógenos (cuali-cuantitativo)

57. 49 ¿Preguntas? ¿? ¿? ¿? ¿?