Sumario no extensivo de Técnicas de Modificación Genética y Técnicas de Purificación de Proteínas Recombinantes dirigido a personal dictaminador de COFEPRIS

1. Abril 2016
TÉCNICAS DE MODIFICACIÓN GENETICA
Y PURIFICACIÓN DE PROTEINAS RECOMBINANTES

2. 2
Contenido
I. Objetivo de la presentación
II. ADN y Mutaciones
III. Gen, Cromatina y Cromosomas
IV. Técnicas de Manipulación Genética
V. Técnicas de Purificación
VI. Aplicaciones

3. • Dar a conocer los principales métodos de Modificación Genética en
Bacterias y otros organismos, así como dar los fundamentos de las
técnicas de purificación de Proteínas Recombinantes.
I. Objetivo

4. II. ADN
ADN: ácido nucleico que
contiene las instrucciones
genéticas usadas en el
desarrollo y
funcionamiento de todos
los organismos vivos
conocidos y algunos
virus, y es responsable de
su transmisión hereditaria

5. II. ADN
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
DNA polimerasa RNA Polimerasa “Priones”
Neomicina y Ribosomas

6. II. ADN
2 Purinas
2 Pirimidinas

7. II. ADN

8. II. ADN

9. II. ADN
Mutaciones Génicas

10.  GEN: unidad de información en un locus de Ácido desoxirribonucleico
(ADN) que codifica un producto funcional, o Ácido ribonucleico (ARN)
o proteínas y es la unidad de herencia molecular
III. Gen, Cromatina y Cromosomas

11.  El genoma humano presenta una
densidad de genes muy inferior a
la que inicialmente se había
predicho, con sólo en torno al 1.5
% de su longitud compuesta por
exones codificantes de proteínas
 GENES HUMANOS: 25,000
(Proyecto Genoma Humano
esperaba más de 100,000 genes)
 Del genoma humano solo 1–2%
consistan de genes codificantes
de proteínas
III. Gen, Cromatina y Cromosomas

12. III. Gen, Cromatina y Cromosomas
Especie
Tamaño del
genoma (Mb)
Número
de genes
Candidatus Carsonella ruddii 0.15 182
Streptococcus pneumoniae 2.2 2300
Escherichia coli 4.6 4400
Saccharomyces cerevisiae 12 5800
Caenorhabditis elegans
(nemátodo)
97 19000
Arabidopsis thaliana 125 25500
Drosophila melanogaster
(mosca)
180 13700
Oryza sativa (arroz) 466 45 000-55 000
Mus musculus (ratón) 2500 29 000
Homo sapiens (ser humano) 2900 27 000

13. III. Gen, Cromatina y Cromosomas
 El genotipo se refiere a
la información genética
que posee un
organismo en particular,
en forma de ADN.
 El fenotipo se refiere a
la expresión del
genotipo más la
influencia del medio.

14. III. Gen, Cromatina y Cromosomas
Interacción
con el
Medio
Ambiente

15. III. Gen, Cromatina y Cromosomas
Interacción
con el
Medio
Ambiente

16. III. Gen, Cromatina y Cromosomas

17. III. Gen, Cromatina y Cromosomas

18. IV. Técnicas de Manipulación Genética

19. VECTOR DE CLONACIÓN es el vehículo que transporta un gen
dentro
de la célula receptora y es responsable de su replicación.
CARACTERÍSTICAS ESENCIALES
• Replicación en Célula Receptora.
• Agentes o Genes de Selección.
• Secuencias de Restricción
IV. Técnicas de Manipulación Genética

20. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN O
ENDONUCLEASAS
• Enzimas que catalizan la ruptura de
enlaces fosfodiéster en diferentes
regiones ubicadas en el interior de una
cadena polinucleotídica
• La secuencia de nucleótidos reconocida
para escisión por una enzima de
restricción se denomina sitio de
restricción
• Típicamente un sitio de restricción es una
secuencia palindrómica de entre cuatro a
seis nucleótidos de extensión
IV. Técnicas de Manipulación Genética

21. IV. Técnicas de Manipulación Genética
Ejemplos de Vectores:
1. Plásmidos
2. PAC (Fago P1)
3. BAC (bacterial)
4. YAC (yeast artificial
cromosome)
5. Bacteriofago Lamda
o Virus
6. Cósmidos
7. Fagémidos (ADN
monocatenario OR Fago F1
8. HAC (human)

22. IV. Técnicas de Manipulación Genética
Diferentes sitios para la enzima de restricción. Ayuda en la
selección de Cepas Transformadas

23. IV. Técnicas de Manipulación Genética
YACS
BAC
Originado del Factor F que genera
los procesos de fertilidad de E. Coli
Puede integrarse en el cromosoma
bacteriano o liberarse
Altamente estable
Bajo Quimerismo (dos copias
diferentes del mismo gen o
cromosoma)

24. IV. Técnicas de Manipulación Genética
YACS
YAC
Región Centromérica (Cromosoma 4
de S. cerevisae)
Función: Unión al Huso mitótico
Región Telomérica (Tetrahymena)
Función: Estabilidad del Cromosoma
Gen de Selección
Región de Clonación

25. IV. Técnicas de Manipulación Genética
Bacteriófago Lambda

26. IV. Técnicas de Manipulación Genética
CÓSMIDOS
Plásmidos con borde
cohesivo procedente del
genoma del Fago lambda
(COS)

27. TRANSFORMACIÓN: Introducción del ADN en la Célula Huésped
IV. Técnicas de Manipulación Genética

28. Choque Térmico.
• Cl₂Ca a 0ºC para afectar la pared celular
• El DNA se adhiere a sitios accesibles de la pared.
• Choque térmico a 42ºC favorece la incorporación del
DNA.
Electroporación.
• Acción de un breve pulso eléctrico,
• Permeabiliza células procariotas como eucariotas
• Se forman poros
• Entrada de moléculas de ADN grandes y
partículas víricas.
Lipofección.
• Uso de liposomas capaces de unirse a la
superficie celular
• Se utiliza con células de mamífero
• El DNA transferido no se integra en el genoma
IV. Técnicas de Manipulación Genética

29. Microinyección.
• Equipos especializados
Biobalística.
• Microproyectiles a velocidad supersónica
• Macroproyectil, de polietileno, y son impulsados
por una descarga o explosión de gas.
• El gas (helio) recubre las células o tejido a
bombardear se retira con una bomba de vacío ya
que provoca
Fusión de protoplastos.
• Mezcla directa de protoplastos bacterianos con
alto número de copias de un plásmido.
• Fusión de las membranas en presencia de PEG,
• Es posible que se den fusiones múltiples entre
líneas que sean naturalmente incapaces de
conjugar.
• Se obtienen células híbridas viables, capaces de
dividirse y de formar colonias.
IV. Técnicas de Manipulación Genética

30. IV. Técnicas de Manipulación Genética

31. IV. Técnicas de Manipulación Genética
PCR
Polimerase
Chain
Reaction

32. IV. Técnicas de Manipulación Genética

33. V. Técnicas de Purificación
CONSIDERACIONES PARA LA PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS:
1. Definir un ensayo específico que identifique a la proteína
(actividad biológica) (específico, sensible, rápido y barato)
2. Matriz Biológica
3. Proteínas intraceluares o extracelulares
4. Estabilidad de la molécula
5. Aislamiento y concentración (fraccionamiento)
6. Pureza y calidad del producto final requerido

34. V. Técnicas de Purificación
ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

35. V. Técnicas de Purificación
TIPOS DE PURIFICACIÓN
1. Precipitación o Centrifugación
i. Precipitación
ii. Diálisis y Ultrafiltración
iii. Centrifugación por Gradientes
iv. Centrifugación Diferencial
2. Cromatográficos:
a) Exclusión Molecular
b) Intercambio Iónico
c) Cromatografía Hidrofóbica
d) Cromatografía de Afinidad
3. Electroforéticos
 Nativa-PAGE
 SDS-PAGE
 Isoeléctrico

36. V. Técnicas de Purificación
Precipitación (“Salting in Salting out”)
Basado en la alteración de la
Solubilidad de las Proteínas en
presencia de Soluciones saturadas de
sales.

37. V. Técnicas de Purificación
Diálisis y Ultrafiltración
Separar las moléculas en
una solución por la
diferencia en sus índices de
difusión o presión osmótica
a través de una membrana
semipermeable
Normalmente el objetivo es
la remoción de sales o
partículas muy pequeñas,
separándolas de las
macromoléculas.

38. V. Técnicas de Purificación
Centrifugación Diferencial y por Gradientes
Basado en el peso molecular de las
proteínas.

39. V. Técnicas de Purificación
EXCLUSIÓN MOLECULAR
Las separaciones
cromatográficas se basan en
las diferencias de carga,
tamaño o afinidad de las
diferentes proteínas
Cada proteína migrará a distinta
velocidad según su grado de
afinidad por la fase estacionaria

40. V. Técnicas de Purificación
INTERCAMBIO IÓNICO Y CROMATOGRAFÍA HIDROFÓBICA

41. V. Técnicas de Purificación
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

42. V. Técnicas de Purificación
ELECTROFORESIS

43. V. Técnicas de Purificación
ELECTROFORESIS

44. V. Técnicas de Purificación
ELECTROFORESIS ENFOQUE
ISOELÉCTRICO
• Esta técnica se utiliza para separar a las
moléculas por las diferencias en sus cargas
eléctricas
• Se genera un gradiente de pH basado en el punto
isoeléctrico de las moléculas
• El punto isoeléctrico se refiere al pH en donde la
molécula no posee una carga

45. VI. Aplicaciones
ADN Recombinante
(Plásmidos)

46. VI. Aplicaciones

47. VI. Aplicaciones

48. VI. Aplicaciones

49. Gracias
QFB. Nazul Edmundo Becerril López
: nbecerril@cofepris.gob.mx