Este documento trata sobre la validación de métodos analíticos. Explica que la validación es necesaria cuando se desarrolla una nueva técnica, antes de incorporar una nueva técnica a la rutina del laboratorio o para comparar el desempeño de dos técnicas. Detalla los parámetros que deben considerarse al seleccionar un método, como la sensibilidad, especificidad, precisión, exactitud, costo y seguridad. Además, explica las distintas fases por las que debe pasar un método antes de ser comercializado

1. 1
VALIDACIÓN DE MÉTODOS
ANALÍTICOS

2. ¿Qué características tengo que considerar
2
cuando selecciono un método para
incorporarlo a la rutina del laboratorio?

3. 3
Se debe considerar:
1. Uso que se le dará (rutina, confirmatorio)
2. Nº de tests a realizar
3. Instrumentación requerida
4. Sensibilidad, especificidad, exactitud y precisión
5. Costo
6. Tipo de muestra
7. Tipo de analito
8. Seguridad
9. Aceptación internacional y científica
10. Que no sea obsoleto

4. Fases que debe pasar un kit antes de poder ser
comercializado o empleado en el laboratorio
4
DISEÑO Y
OPTIMIZACIÓN
DEL ENSAYO
VALIDACIÓN
ANALÍTICA
VALIDACIÓN
CLÍNICA

5. 5
¿CCuuáánnddoo eess nneecceessaarriioo vvaalliiddaarr??
 Cuando se está desarrollando una técnica
nueva.
 Antes de incorporar una nueva técnica a la rutina
del laboratorio.
 Cuando se desea comparar el desempeño de dos
técnicas.

6. 6
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN
“La validación de un método analítico es un
proceso de evaluación sistemático para demostrar
que el método cumple con los requisitos
necesarios para el uso que se le va a dar”.

7. ¿QUÉ ES LA VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO?
1. Validación es la confirmación mediante examen y
aporte de evidencia objetiva de que se cumplen los
requisitos particulares para el uso específico previsto
(ISO 8402, ISO 17025).
2. La validación debe ser tan exhaustiva como sea
necesario para responder a las necesidades de la
aplicación en cuestión.
3. La validación puede incluir procedimientos para el
7
muestreo, manejo y transporte de muestras.

8. 8
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN AANNAALLÍÍTTIICCAA
Estudia los parámetros de desempeño analítico
del método:
 Precisión
 Exactitud
 Especificidad
 Límite de detección
 Límite de cuantificación
 Linealidad e intervalo de linealidad
 Robustez

9. 9
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN
AANNAALLÍÍTTIICCAA
VVaalliiddaacciióónn MMeettooddoollóóggiiccaa
11.. EEssppeeccttrroo ddee aabbssoorrcciióónn
22.. EEssttaabbiilliiddaadd ddee llaa rreeaacccciióónn ddee ccoolloorr
33.. LLiinneeaalliiddaadd
44.. LLíímmiittee ddee ddiilluucciióónn
55.. RReeccuuppeerraabbiilliiddaadd
66.. SSeennssiibbiilliiddaadd
77.. LLíímmiittee ddee ddeetteecccciióónn
VVaalliiddaacciióónn EEssttaaddííssttiiccaa
11.. PPrreecciissiióónn
22.. EExxaaccttiittuudd

10. 10
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN MMEETTOODDOOLLÓÓGGIICCAA

11. 11
LLIINNEEAALLIIDDAADD
1. Es la capacidad de producir resultados proporcionales a la
concentración del analito en las muestras dentro de un rango
determinado de concentración ya sea directamente o por medio
de una transformación matemática bien conocida.
2. Se analizan muestras de concentraciones conocidas o series
de muestras diluidas en al menos 5 niveles de concentración.
3. Repetir 3 veces en forma independiente
4. Se grafican los datos resultantes en el eje y y los valores
conocidos o esperados en el x.

12. INTERVALO DE LINEALIDAD YY LLÍÍMMIITTEE DDEE DDIILLUUCCIIÓÓNN
12
Absorbancia (A)
Rango de linealidad
DA
Concentración (C)
DC
2 4 6 8 10 12 g/dL
Rango de Linealidad:
0 – 10 g/dL
Límite de Dilución:
10 g/dL
Rango de linealidad: intervalo entre las concentraciones más baja y más alta de
analito determinadas, para las cuales se cumple la ley de Beer.

13. 13
Curvas de calibración

14. 14
Errores de una calibración inadecuada

15. 15
DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER
RADIACIÓN POLICROMÁTICA

16. 16
RREECCUUPPEERRAABBIILLIIDDAADD
Capacidad de un método de determinar todo el analito
presente en la muestra, según el alcance del método
(algunos solo determinan algunas especies del analito).
La mejor manera de determinar la eficacia de extracción
del método es adicionar diferentes concentraciones del
analito a las muestras y procesarlas por el método
completo.

17. Aunque es la manera más común de cuantificar la
recuperación, el analito adicionado puede no enlazarse tan
fuertemente a la matriz como el presente de manera natural
y dar como resultado la impresión de una elevada eficacia de
extracción.
La alternativa es efectuar el proceso con MR en la matriz
deseada, si existen; si estos MR han sido generados
mediante caracterización de muestras naturales el estudio
de recuperación representará con mayor precisión la
extracción de muestras reales.
17

18. 18
ENSAYO DDEE RREECCUUPPEERRAACCIIÓÓNN
• También llamado de adición estándar.
• Se puede llevar a cabo de dos maneras: con
placebo o con muestra, que se enriquece con
estándar.
• Realizar las medidas por triplicado.
Criterio de Aceptación
% de recuperación obtenido entre 85 - 115 %

19. SENSIBILIDAD
 La sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida
19
para una determinada cantidad de analito.
 También se indica mediante dos factores analíticos:
1. El Límite de Detección (LOD).
2. El Límite de Cuantificación (LOQ).

20. 20
LÍMITE DDEE DDEETTEECCCCIIÓÓNN ((LLOODD))
 Es la concentración más baja del analito que se puede
detectar pero no necesariamente cuantificar.
 En general, es el punto al que la señal del analito es
igual a tres veces el ruido de la medida.
 Para algunos espectrofotómetros se puede establecer
que el LOD es, aproximadamente, tres veces la
desviación estándar.

21.  El LOQ es la concentración más baja del analito
que se puede determinar con una precisión y
exactitud aceptables.
 Para calcular el LOQ se deben de definir por tanto
los límites aceptables de precisión y exactitud.
 Se puede aproximar a la relación entre la precisión
de la medida analítica y la sensibilidad del método.
21
LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LOQ)

22. RROOBBUUSSTTEEZZ
 Es una medida de la capacidad de un procedimiento de
permanecer inalterado por pequeñas pero deliberadas
variaciones en los parámetros del método y provee
información de su comportamiento en la rutina.
22
 Parámetros estudiados:
1. Efectos del congelado- descongelado
2. Tiempos de incubación
3. Temperaturas de incubación
4. Longevidad de los reactivos
5. Preparación de la muestra
6. Conservación de la muestra

23. 23
EESSPPEECCIIFFIICCIIDDAADD
Habilidad de evaluar inequívocamente el analito
en presencia de componentes que se puede
esperar que estén presentes.

24. INTERFERENCIAS
 Efecto de una sustancia presente en una
muestra que causa que el resultado de un test
sea erróneo.
 Puede ser dependiente del analito o
independiente del mismo y puede aumentar o
disminuir la medida realizada.
24
 Son difíciles de detectar.

25. COMO DETECTAR Y CHEQUEAR INTERFERENCIAS
 Son difíciles de detectar pues se desconoce el resultado
verdadero. Se saca de los datos del fabricante o de literatura.
 Prestar atención a resultados de pacientes con condiciones
clínicas asociadas con interferencias (enfermedades hepáticas,
fallas renales, embarazo).
25
 Incongruencias con cuadro clínico.
 Inspeccionar las muestras visualmente buscando: hemólisis,
ictericia, lipemia o mejor evaluarlas usando índices séricos.

26. FORMAS DE ESTUDIAR LLAASS IINNTTEERRFFEERREENNCCIIAASS
1 Test de dilución lineal (las interferencias no se
comportan linealmente con la dilución).
2 Analizar la muestra por otro método (se comportan
diferentes).
3 Tratar la muestra para remover, destruir o inhibir
sustancias potencialmente interferentes.
4 Análisis de muestras enriquecidas con el interferente.
26

27. 27
Análisis ddee mmuueessttrraass eennrriiqquueecciiddaass
 Se prepara una muestra agregando el material
interferente a una muestra real que contenga el analito.
 Una segunda alícuota de la muestra original se diluye
con un solvente y ambas se analizan determinándose la
diferencia entre ambas.

28. 28
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN EESSTTAADDÍÍSSTTIICCAA

29. 29
PPRREECCIISSIIÓÓNN
Expresa el grado de acuerdo entre valores cuando
se analiza la misma muestra estable repetidamente.
Se habla de Imprecisión.
Puede considerarse a tres niveles:
1. Repetibilidad
2. Precisión intermedia
3. Reproducibilidad

30.  REPETIBILIDAD (REPETITIVIDAD): Precisión obtenida bajo
las mismas condiciones de operación en un intervalo corto
de tiempo (mismo día), por un mismo analista, en la misma
muestra homogénea y en el mismo equipo.
 PRECISION INTERMEDIA: Precisión obtenida dentro del
laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos, días
distintos con la misma muestra homogénea.
 REPRODUCIBILIDAD: Expresa la precisión entre laboratorios
como resultado de estudios interlaboratoriales diseñados
para estandarizar la metodología.
30

31. 1. Se estudia mediante experimentos de replicación.
2. El propósito es observar la variación esperada en
el resultado de un test bajo las condiciones de
operación normal de un laboratorio.
3. Estima el error causado por factores como el
pipeteo, condiciones de reacción (Tº, mezclado).
31
4. Suele ser mayor en sistemas no automatizados.

32. • Las muestras de ensayo comúnmente usadas son:
soluciones estándar, materiales de control, pooles de
pacientes o muestras frescas de pacientes individuales.
• Se emplean los resultados de 20 alícuotas de cada
material y se calcula la media, el desvío estándar y el
coeficiente de variación.
• Período de tiempo que abarca el experimento: Tiempo
ideal 20 días.
32

33. 33
CCÁÁLLCCUULLOOSS::
Promedio: Desvío standard :
Coeficiente de variación:
CV = (s/x)100

34. 34
EEXXAACCTTIITTUUDD
Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, sea
como un valor convencional verdadero (material de
referencia interno), sea como un valor de referencia
(material de referencia certificado o estándar) y el valor
promedio obtenido al aplicar el procedimiento de análisis
un cierto número de veces.
“Un test exacto es implicitamente específico y preciso”

35. 35
¿CCóómmoo llaa ddeetteerrmmiinnoo??
A) Comparación con métodos de referencia.
B) Análisis de muestras de referencia certificadas.
C) Ensayos de recuperación.
D) Ensayos interlaboratorios.

36. 36
Comparación con métodos de referencia
 Se analizan muestras de pacientes por el método en
estudio y otro método de comparación, luego se estima el
error sistemático basándose en las diferencias observadas
para ambos métodos.
 El método de comparación debe en lo posible ser el de
referencia (“gold standard”). Es una técnica cuyos
resultados se han comparado con métodos definitivos y/o
trazables a materiales estándar de referencia.

37. 37
Número de muestras a usar
 Mínimo de 40 para los dos test.
 Deben elegirse de modo de cubrir todo el rango de trabajo del
método y representar el espectro de enfermedades esperadas en
la aplicación de rutina del método.
 Es mejor realizar ensayos de las muestras por duplicado (a
partir de dos alícuotas diferentes) en diferentes corridas o por lo
menos en diferente orden.
Período de tiempo:
 Mínimo de 5 días, lo ideal 20 días, corriendo 2 a 5
muestras de pacientes por día.

38. Análisis de datos:
Existe mucha discusión sobre cual es la mejor forma
de analizar los datos:
A) Graficar los resultados y hacer una inspección
visual de los mismos.
Cualquier muestra con resultados discrepantes debe
ser reanalizada.
Para los métodos que se espera coincidan hacer
primero un gráfico de “diferencias”. Las mismas
deberán oscilar alrededor de la línea del cero.
38

39. 39

40. Cálculos estadísticos
• Para la comparación de resultados que cubren un
amplio rango analítico lo mejor es el cálculo de la
regresión lineal.
• Permite estimar el error sistemático a más de una
concentración de decisión médica.
• También se puede calcular el coeficiente de
correlación r que permite saber si el rango de
datos es lo suficientemente amplio para dar
buenos estimados de la pendiente y la ordenada
en el origen (r > 0.99).
40

41. 41
B) Análisis de muestras de referencia cceerrttiiffiiccaaddaass
• Se analiza un mínimo de 3 concentraciones y 5
determinaciones por el método a validar y se compara el
resultado obtenido con el valor verdadero declarado.
Criterio de aceptación:
• El valor medio debe estar dentro del 15% del valor
nominal excepto en el Límite de cuantificación (LDC)
que puede ser el 20%.

42. 42
VVAALLIIDDAACCIIÓÓNN CCLLÍÍNNIICCAA

43. 43
VVaalliiddaacciióónn CCllíínniiccaa
 La toma de decisiones clínicas es un proceso extremadamente
complejo en el que deberá finalmente ser valorada la utilidad de la
prueba diagnóstica para el manejo del paciente.
Debo conocer la exactitud, es decir, su
capacidad para clasificar correctamente a
los pacientes en categorías o estados en
relación con la enfermedad (típicamente
dos: estar o no estar enfermo, respuesta
positiva o negativa a la terapia).

44. Diseño de los eessttuuddiiooss ddee VVaalliiddaacciióónn ccllíínniiccaa
44
En el diseño debe considerarse:
 Intervalos de referencia o rangos normales.
Existe diferencia con la edad, sexo u otro factor?
Pueden usarse valores de literatura?.
 Valores de cut off o umbral de decisión: pueden
usarse los generalmente aceptados?.

45. 45
SSeelleecccciióónn ddee llaass mmuueessttrraass
 Debe tomarse una porción que sea representativa
de la población total.
 Idealmente deben elegirse los sujetos por un
proceso al azar para evitar sesgos.

46. 46
AAnnáálliissiiss ddee llaass mmuueessttrraass
 Para evitar sesgos el ensayo debe hacerse a
ciegas, es decir sin que el laboratorista sepa la
condición clínica del paciente.
 Si se comparan varios test en el mismo estudio,
deben hacerse todos los test en todos los sujetos
y en el mismo punto del curso de su enfermedad.

47. 47
EEvvaalluuaacciióónn ddeell ddeesseemmppeeññoo
Sensibilidad:
Es la probabilidad de clasificar correctamente a un
individuo cuyo estado real sea el definido como
positivo respecto a la condición que estudia la
prueba, razón por la que también es denominada
fracción de verdaderos positivos (FVP).

48. 48
Especificidad:
Es la probabilidad de clasificar correctamente a
un individuo cuyo estado real sea el definido
como negativo. Es igual al resultado de restar a
uno la fracción de falsos positivos (FFP)

49. 49
Prevalencia:
Indica la proporción de sujetos en la
población estudiada que realmente tienen la
enfermedad.

50. 50
 Un test perfecto tiene S y E de 100%.
 En realidad existe un par S-E para cada umbral o
nivel de decisión.
 Hay que decidir que par S-E funciona mejor para
las circunstancias en que quiero usar el test.

51. CCrrééddiittooss
Prof. Dr. Luis Salazar N., Depto. de
Ciencias Básicas – UFRO
51