1. Métodos de
medición
analítica en
Bioquímica
Clínica

2. Bioquímica
 “Ciencia
que
estudia las bases
químicas de la
vida”
Pilar fundamental de la biotecnología, y se ha
consolidado como una disciplina esencial para
abordar los grandes problemas y enfermedades
actuales y del futuro

3. Utilidad
 Diagnóstico
 Valoración
del pronóstico y del
tratamiento
 Investigación
 Ensayos clínicos de fármacos.

4. Fase Analítica
Comprende:
 Técnicas
analíticas
Procedimientos de análisis basados en el
comportamiento de la materia.



Espectrometría  Electroforesis
Cromatografía  Electroquímica
Química seca  Inmunoensayos

5.  Métodos
Analíticos
Son aplicaciones de las técnicas, con
parámetros y protocolos concretos.

Características analíticas: punto final, cinético,
colorimétrico, enzimático, métodos de curva de
calibración.

Reactivos usados: glucosa oxidasa, verde de
bromocresol

6. Fase Post-analítica
 Desde
la obtención de resultados hasta
que el clínico solicitante tiene el informe.
 “Fase
total”.
decisiva para cumplir una calidad

7.  Validación







de resultados
Valoración técnica: es la aceptación de los
resultados obtenidos por las distintas técnicas.
Valoración clínica: los resultados deben ser
coherentes con la clínica.
Informe de resultados
Tiempo de respuesta
Teoría de los valores de referencia
Variaciones analíticas
Variaciones extraanalíticas

9. Método químico
Se emplean en la determinación de una
molécula
o
de
un
elemento
determinado, que se halla inmerso en
una mezcla con otras moléculas o
elementos
Los bioelementos poseen una capacidad para
emitir y absorber luz de una determinada
longitud, siendo la longitud de onda de
emisión característica de cada elemento.
Requieren de la utilización
de alguna característica
diferencial

10. Métodos físicos
Compuestos bioquímicos, es
que son muy parecidos en
cuanto a propiedades
químicas
solubilidad
polaridad
Requieren de un
procedimiento previo
Métodos separativos
punto isoeléctrico
Basados en las propiedades físicas de
los compuestos.

11. Métodos enzimáticos
La mayoría de las veces las técnicas separativas
no permiten determinar la presencia de una
determinada proteína en presencia de otras
Las enzimas son específicas de reacción y sustrato, y los elementos que
intervienen en la reacción pueden determinarse, bien porque presentan
una característica que puede medirse o bien porque pueden determinarse
por medios químicos.

12. Métodos inmunológicos
No todas la proteínas poseen
actividad enzimática o una función
que pudiera medirse
Embargo la gran diferencia entre
proteínas radica en su gran y única
configuración tridimensional

13. Métodos de hibridación
Ácidos nucleicos son difíciles de determinar
Las diferencias en tamaño de las especies de
ARN o de fragmento de ADN no lo permiten
+
Secuencia de nucleótidos.
Método para el
reconocimiento de una
secuencia específica.

14. Este método emplea sondas que
son específicas y complementarias
a determinada zona de la cadena
de ADN o ARN dependiendo lo que
se
quiera
determinar.
Es
importante recordar que es
necesario un sistema de marcaje
que permita cuantificar la cantidad
de ácido nucleico presente, ya que
la hibridación sólo induce la
especificidad del método.

15. Métodos Fotométricos
Espectro Electromagnético: cubre un
amplio intervalo de E radiante, desde los
rayos de longitud de onda corta hasta
las ondas de radio, de longitud de onda
larga.
 Región
Ultravioleta: = 10-380 nm
 Región Visible: = 380-780 nm
 Región Infrarroja: = 780-30.000 nm

16. Ley de Beer:
 “La
Absorbancia de una solución es
directamente proporcional ala
concentración y a la longitud del paso de la
luz”.

17.  Espectrofotómetro

Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan
porque utilizan filtros que solo permiten el paso
de una determinada longitud de onda.

Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con
ellos se obtiene un haz de luz monocromático
cuya longitud de onda se varía a voluntad.

18.  Fluorimetría


o Fluorimetría
Luminiscencia
Fluorescencia
Tiene una alta sensibilidad de 100 a 1000 veces
mas sensibles q técnicas colorimétricas
normales.
FLUOROINMUNOANÁLISIS: son anticuerpos marcados con
una sustancia fluorescente, específicos de la sustancia
que se va a estudiar.
DETERMINACIÓN de vitaminas, fármacos, algunas
enzimas, etc.

19.  Fotometría
de llama
La intensidad luminosa es directamente
proporcional al número de átomos que emiten
energía, que a su vez es directamente
proporcional a la concentración del ión de la
muestra.
Se utiliza para la determinación de Sodio, Litio
y Potasio (Na, Li, k) en líquidos biológicos.

20.  Espectrofotometría
de absorción atómica
Se utiliza para la determinación de Calcio,
Magnesio, Cobre, Zinc, Plomo y otros metales
 Nefelometría
y turbidimetría
Cuando un haz de luz choca contra una partícula
en suspensión sufre una serie de fenómenos:
- dispersión de la luz
- reflexión
- absorción
- transmisión

21.  La
DISPERSIÓN de la luz depende de
varios factores, que son:




Tamaño y peso molecular de las partículas
Longitud de onda de la luz incidente
Distancia del detector a la cubeta
Concentración de partículas

22. Métodos para medir la [] de
una sustancia por
Espectrofotometría

23.  Punto
final o de equilibrio
Se incuba la muestra y el reactivo durante un
tiempo determinado y a una temperatura
determinada para que se complete totalmente la
reacción, de tal forma que la sustancia que
buscamos debe consumirse totalmente. Si no
fuera así y quedase parte de la sustancia sin
consumir, al medir el producto, estaríamos
midiendo menos cantidad de la que realmente
hay. Por lo tanto se mide al final de un tiempo fijo
de incubación.

24.  Métodos
cinéticos
En ellos se mide la velocidad de la reacción
mediante la medida de la variación de la
Absorbancia en el tiempo y esto se relaciona
con la concentración. Es una medición
continua, a diferencia de la del punto final, se
mide en tiempos regulares. Se puede medir la
cantidad de sustrato no transformado ó la
cantidad de producto formado

25. Lectura

26. Bicromático
Esta técnica está basada en la premisa que aunque un
compuesto puede dar una interferencia espectral, la
absorbancia máxima del interferente será diferente de
la de la reacción analítica verdadera
El uso de este procedimiento permite
también que cada muestra sea
utilizada como su propio blanco para
el color endógeno.

27. Esta técnica involucra la medición de la absorbancia de una mezcla
de reacción a dos longitudes de onda diferentes simultáneamente.
Estas son:
- la longitud de onda principal (1 )
- la longitud de onda cercana 2 .
1 es la longitud de onda a la cual el cromógeno tiene la máxima
absorción. En 2 hay un mínimo de absorción del cromógeno. Como
la reacción es monitoreada simultáneamente a dos longitudes de
onda, ésta es conocida como análisis bicromático.

28. Otro método similar para la corrección de la
interferencia de fondo es la medición de la
absorbancia a la longitud de onda primaria Amax
y a dos longitudes de onda adicional,
generalmente equidistante del pico, A1 y A2. Las
lecturas de absorbancia a estas dos últimas
longitudes de onda son promediadas para dar la
absorbancia de fondo promedio en la muestra.
Esta técnica para la corrección de la absorbancia
de fondo de las sustancias interferentes es
conocida como la corrección de Allen.

29. Curva de calibración
 En
relación a los equipos automatizados y
su correcto funcionamiento para realizar
una lectura hay que tener bien en claro
que no se puede procesar un método si
no ha programado previamente el
equipo analizador

31. Calibración por curva-Calibración por grafica analítica
Se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones
conocidas del analito, dichas soluciones deben cubrir el intervalo de
concentraciones de interés
Así como tener una composición matricial, tan parecida como se pueda a la de las
soluciones de la muestra
Si se obtiene una grafica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse
equipo electrónico o programas computacionales para compensar la curvatura y
producir una salida que sea una función lineal de la concentración, en regiones no
lineales el numero de soluciones estándares analizadas debe aumentarse para
obtener la exactitud del análisis de las muestras problema

32. Calibración por el método de adiciones estándares:
Cuando es imposible
suprimir interferencias
físicas o químicas en la
matriz de la muestra
La respuesta del instrumento
debe ser función lineal de la
concentración del analito,
en el intervalo de
concentraciones y también
debe tener una ordenada al
origen en cero (señal cero
para concentración cero).
Una pequeña cantidad de solución del analito de
concentración conocida se añade a una alícuota de una
solución de muestra analizada previamente y el análisis se
repite usando reactivos, parámetros del instrumento y
procedimientos idénticos.

34. Calibración por el Método
del Estándar Interno
Se emplea un
estándar interno para
minimizar las
diferencias en las
propiedades físicas
de un conjunto de
soluciones muestra
que contiene el
mismo analito
Una cantidad fija de
una sustancia pura se
añade tanto a las
soluciones muestra
como a las soluciones
estándares, se
determinan luego las
respuestas del analito
y del estándar interno
El cociente de
respuestas ( del
analito al estándar
interno) depende
solamente de la
concentración del
analito
Si se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la respuesta de
la línea del estándar interno será constante, por supuesto que la concentración
del estándar interno no es fija, sin embargo, si varia uno o mas de los parámetros
que afectan las respuestas medidas, dichas respuestas del analito y del estándar
interno deben ser afectada por igual.

35. Gracias