In vivo diversification of target genomic sites using processive base deaminase fusions blocked by dCas9

1. Manuela Restrepo Molina
Valeria Restrepo Londoño
Pontifical Bolivarian University
Health Sciences - Medicine
Third semester

2. NTRODUCTION
dCas9
RNA-guided DNA endonuclease
associated with the crypr system.
It is used to introduce new genes or to
inactivate them.
By memory of sequences, they facilitate
their recognition in bacteriophages so
that when they invade they can recognize
them.
CRISPR/Cas

3. INTRODUCTION
Apoptosis
Is a genetically form of cells regulation
which consists in molecular mechanisms
involved in death signals.
Mutagenesis
Deaminases
dCas9
CRISPR knock out
Mutations, alterations in the sequences of
DNA chains in strains, which allow generating
variants in the expression of a gene, in order
to accelerate the evolution of proteins.
Using:

4. GENERAL PURPOSE
Evaluate in vivo
diversification of
target genomic sites
using processive base
deaminase fusions
blocked by dCas9.

5. ---------------------------------------------
CITOMETRÍA DE FLUJO
1- FUNDAMENTO
Técnica aplicada al estudio de poblaciones celulares mediante la cual se
analizan y cuantifica características celulares como tamaño, densidad y
mecanismos de fluidos de la membrana.
2- PROPÓSITO
Mediante la citometria se logró observar la evolución de las diferentes
mutaciones que ha presentado el gen.
MATERIALES Y METODOS

6. MATERIALES Y METODOS
REACCIÓN EN CADENA DE
LA POLIMERASA - PCR
El objetivo de esta técnica es la amplificación directa de un gen o
un fragmento de DNA, permitiendo generar copias en corto
tiempo.
1-
Esta técnica permite verificar la correcta expresión de los
genes que fueron intervenidos en la mutagenesis.
2-
Fundamento
Propósito

7. MATERIALES Y METODOS
Se aplica en electroforesis
WESTERN BLOT
1- FUNDAMENTO
Esta prueba fue utilizada para identificar una reacción entre un antígeno y
un anticuerpo, en este caso se separa las proteínas por medio de una
electroforesis en la cual los anticuerpos reaccionan con una proteína
especifica.
2- PROPÓSITO
Mediante la interacción de la dCas 9 se logra identificar la fusión de las
proteínas que permiten diversificar los fragmentos del ADN.

8. MATERIALES Y METODOS
SECUENCIACIÓN
GENOMICA
Esta técnica se utiliza para la determinación de fragmentos de
ADN originados a partir de un molde de ADN por medio de
enzimas de restricción.
1-
En el artículo podemos encontrar que al momento de realizar la
secuenciación del genoma se utilizó el método enzimático, ya que
con este se buscó identificar la secuencia del molde mientras se
sintetiza una cadena complementaria.
2- Propósito
Fundamento

9. The crRNA
necesario para la
transcripción.
EL promotor T7 es una
secuencia de ADN donde
el gen comienza a ser
transcrito.
RESULTADOS
Efectos
Mutagénesis
Potencia
Inhibe
Bloquea
dCas9 permite
potenciar la expresión
de una secuencia- gen.

10. RESULTADOS
Western Blot
KDa
Análisis de proteínas.
Lo analizamos Según:
Intensidad del color
Numero de bandas
------------------
SOBREEXPRESIÓN
SOBREEXPRESIÓN
SOBREEXPRESIÓN

11. RESULTADOS
La acción de la TadA, permite la
desaminación de las adeninas
en la secuencia de ADN
conlleva a una mayor expresión
del gen.
Variantes de
desaminasas de
adenina y de citicina.

12. RESULTADOS
Generan variantes con
diferentes niveles de
resistencia a CAZ.
Acumulación mutaciones
en cada ciclo

13. - IN VIVO DIVERSIFICATION OF TARGET GENOMIC SITES USING
PROCESSIVE BASE DEAMINASE FUSIONS BLOCKED BY DCAS9 -
TadA* fusion was not affected by
UNG, and its activity was increased
moderately by the lack of
endonuclease V. This might be due
to a lower activity of endonuclease
V for the removal of inosines
generated by TadA*.
Elimination of the DNA repair enzymes
UNG (Δung) and endonuclease V (Δnfi)
enabled to obtain higher mutant
frequencies for BDs. An interesting
alternative to ung deletion for CDs is its
transient expression of UGI from
bacteriophage PBS217.
DISCUSSION
Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A•T
to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature
551, 464 (2017).
Wang, Z. G., Smith, D. G. & Mosbaugh, D. W.
Overproduction and characterization of the uracil-DNA
glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene 99,
31–37 (1991).
T7RNAP increases the mutant
frequency by a mechanism
that is independent of BDs and
UNG, but which might be
related to conflicts of high
transcription with other
cellular machineries.
Jinks-Robertson, S. & Bhagwat, A. S.
Transcription-associated mutagenesis.
Annu. Rev. Genet. 48, 341–359 (2014).

14. CONCLUSIONS
Importance of molecular biology for medical life
SEMINAR - MOLECULAR BIOLOGY
1- It allows to understand
cellular interactions,
its mechanism of action so
that in case of any
alteration carry out
regulation processes for
proper cell function.
2- We can inhibit,
enhance or block
genes in order to
improve the
genome.
3- It allows
prevention and
control of diseases.

15. Valeria Restrepo Londoño

16. Manuela
Restrepo
Molina